Preparazione di ovociti di Drosophila fissi per l'immunostaining: un metodo ad alta produttività per fissare e rimuovere la membrana esterna

Overview

L'immunosociazione degli ovociti in fase avanzata di Drosophila può rivelarsi impegnativa a causa delle membrane circostanti degli ovociti. Questo video descrive un metodo ad alta produttività per ottenere gli ovociti, la loro fissazione e la rimozione delle membrane per l'immunosociazione. Il protocollo in primo piano dimostra queste tecniche con ovociti in fase avanzata utilizzati per visualizzare diversi stadi della meiosi.

Protocol

Questo protocollo è tratto da Radford e McKim, Techniques for Imaging Prometaphase e Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

NOTA: Le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione. Gli incubatori a temperatura controllata vengono utilizzati per mantenere le temperature per l'allevamento a mosca e le croci, salvo diversa indicazione.

1. Preparativi

1. Preparate le mosche.
   1. Collezioni di ovocite arricchite con prometafase.
      1. Liberare le mosche adulte da stock sani e giovani o culture incrociate. Bottiglie d'età per due giorni a 25 °C.
         NOTA: In generale, saranno sufficienti due bottiglie sane, anche se potrebbero essere necessarie altre per alcune culture incrociate.
      2. Dopo due giorni, raccogli ~ 100 a 300 femmine (che hanno da 0 a 2 giorni a questo punto) dalle bottiglie. Le femmine non hanno bisogno di essere vergini. Aggiungere un tampone di pasta di lievito sul lato di una fiala e posizionare 30 femmine e da 10 a 15 maschi ciascuno nelle fiale lievitate. Fiale di età per due giorni a 25 °C.
   2. Collezioni di ovocite arricchite di metafase.
      1. Raccogli da ~100 a 300 femmine da stock o cross cultures. Aggiungere un tampone di pasta di lievito sul lato di una fiala e posizionare 30 femmine ciascuna (senza maschi aggiunti) nelle fiale lievitate. Fiale di età da tre a cinque giorni a 25 °C.
2. Preparare soluzioni.
   NOTA: Le soluzioni possono essere conservate a tempo indeterminato a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.
   1. Preparare il tampone di Robb modificato (5x): 500 mM HEPES, 500 mM di saccarosio, 275 mM di acetato di sodio, acetato di potassio da 200 mM, glucosio di 50 mM, cloruro di magnesio da 6 mM e cloruro di calcio da 5 mM. Utilizzare 10 N 11:8 idrossido di sodio:idrossido di potassio per portare il pH a 7,4. Sterilizzare per filtrazione; non autoclave. Conservare a -20 °C. Scongelare se necessario per preparare ~ 200 ml di preparazione per ovocita di 1x Robb.
   2. Soluzioni di fissazione.
      1. Opzione #1: Preparare la fissazione della formaldeide/eptano. Prepara tampone di fissazione: 1 saline tamponata con fosfato (PBS) più saccarosio da 150 mM. Da usare, rendere fresco con 687,5 μl tampone di fissazione e 312,5 μl 16% di formaldeide per preparazione degli ovocite.
         ATTENZIONE: Indossare guanti durante l'utilizzo di soluzioni di formaldeide in un cappuccio per fumi. Smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali.
      2. Opzione #2: Preparare la fissazione della formaldeide/cacodilato. Preparare Fix Mix: saccarosio da 250 mM, acetato di potassio da 100 mM (pH 7,5), acetato di sodio da 25 mM (pH 7,0) e EGTA da 25 mM (pH 8,0). Da usare, rendere fresco con 400 μl Fix Mix, 100 μl di cacodilato di potassio (1 M, pH 7.2) e 500 μl 16% di formaldeide per preparazione degli ovocti.
         ATTENZIONE: Il cacodilato di potassio contiene arsenico.
   3. Preparare PBS/Triton X-100: 1x PBS più 1% o 0,05% Tritone X-100. Conservare a 4 °C.
   4. Preparare l'albumina del siero bovino PBS-Tween 20 (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) e 0,1% Tween-20. Può essere conservato a 4 °C per una settimana.

2. Collezione di ovociti Drosophila in fase avanzata

1. Poiché gli ovociti Drosophila con membrane intatte si atterranno alla plastica e al vetro, pre-rivestire l'interno di un tubo da 5 ml e di una pipetta Pasteur per preparazione degli ovociti con PTB.
2. Anestetizza tutte le mosche lievitate da ~ 100 a 300 con anidride carbonica e aggiungi a un frullatore contenente ~ 100 ml 1x Robb's Buffer. Pulsare tre volte (~1 sec ciascuno). Tenere gli ovociti in Robb per <20 minuti per evitare l'attivazione.
   NOTA: In alternativa, gli ovociti possono essere sezionati a mano dalle femmine. Il vantaggio di questo metodo è che richiede meno femmine. Tuttavia, bisogna fare attenzione a limitare l'esposizione all'anidride carbonica a pochi minuti per evitare artefatti associati all'ipossia.
3. Filtrare attraverso maglie di grandi dimensioni (~1.500 μm) in becher da 250 ml per rimuovere parti del corpo di grandi dimensioni. Se molti addome intatti rimangono sulla rete, rilacinare il materiale utilizzando il tampone di Robb aggiuntivo e filtrare di nuovo. Lasciare depositare ~ 2 min, quindi aspirare fuori strato superiore, rimuovendo il maggior numero possibile di parti del corpo di grandi dimensioni.
4. Filtrare attraverso una piccola rete (~300 μm) in un becher da 250 ml. Risciacquare gli ovociti rimanenti dal primo becher usando robb aggiuntivi e pipetta Pasteur rivestita. Lasciare sistemare ~ 3 min; gli ovociti si stabiliranno. Aspirare fuori tutti tranne ~ 10 ml.
5. Versare la quantità di 10 ml che si adatta al tubo rivestito da 5 ml. Lasciare depositare, rimuovere il liquido e ripetere con il resto. Risciacquare gli ovociti rimanenti dal becher usando robb aggiuntivi e pipetta Pasteur rivestita. Lasciare depositare in un tubo da 5 ml per ~ 3-5 minuti.

3. Trattamenti farmacologici (facoltativo)

1. Rivestire un secondo tubo da 5 ml con PTB per ogni preparazione degli ovociciti. Aggiungere solvente (controllo) o farmaco appropriato a 1 ml di Robb ciascuno per ogni preparazione degli ovocitati(tabella 1).
2. Dividere gli ovociti in un secondo tubo rivestito da 5 ml. Lasciare depositare, rimuovere il liquido e aggiungere 1 ml di Robb più solvente in un tubo e 1 ml di farmaco Robb più nel secondo tubo. Nutato per un periodo di tempo adeguato per il trattamento farmacologico(tabella 1). Lascia che si sistemi.

4. Fissazione

1. Aspirare tutto il liquido e aggiungere immediatamente 1 ml Fix.
2. Opzione #1: fissazione di formaldeide/eptano (buffer di fissazione più formaldeide al 5%).
   1. Fissare per 2,5 minuti su un nutator. Aggiungere 1 ml di eptano e vortice 1 min. Lasciare sistemare ~ 1 min.
   2. Rimuovere tutto il liquido, quindi aggiungere 1 ml 1x PBS. Vortice 30 sec. Lasciare sistemare ~ 1 min.
   3. Rimuovere tutto il liquido, quindi riempire il tubo con 1x PBS.
      NOTA: Gli ovociti possono essere utilizzati immediatamente o conservati sul nutatore per diverse ore a temperatura ambiente.
3. Opzione #2: Fissazione formaldeide/cacodilato (Fix Mix più 8% di formaldeide e cacodilato da 100 mM).
   1. Fissare per 6 minuti su un nutator. Lasciare sistemare 2 minuti. Rimuovere il liquido e quindi riempire il tubo con 1x PBS.
      NOTA: Gli ovociti possono essere utilizzati immediatamente o conservati sul nutatore per diverse ore a temperatura ambiente.

5. Rimozione delle membrane ("rotolamento")

1. Usando pipetta Pasteur rivestita, aggiungi da ~ 500 a 1.000 ovociti alla parte smerigliata (sabbiata) di uno scivolo di vetro. Rimuovere tutte le parti del corpo e il materiale estraneo utilizzando le forcep. Non lasciare asciugare gli ovociti; aggiungere 1x PBS se necessario.
2. Posizionare un coverslip sopra gli ovociti e "rotolare" delicatamente gli ovociti fino a quando tutte le membrane non vengono rimosse (trascinare il bordo del coverslip attraverso gli ovociti funziona meglio). Controllare periodicamente lo stato di avanzamento al microscopio, aggiungendo più 1x PBS se necessario. Fai attenzione perché troppa pressione distruggerà gli ovociti.

Representative Results

droga	solvente	Concentrazione di scorte	Concentrazione finale	Tempo di trattamento	effetto
colchicina	etanolo	125 mM	150 μM	10 min o 30 min	destabilizzare il non-kinetochore (10 min) o tutti i microtubuli (30 min)
paclitaxel	Dmso	10 mM	10 μM	10 min	stabilizzare i microtubuli
Binucleina 2	Dmso	25 mM	25 μM	20 min	inibire l'aurora B chinasi

Tabella 1: Trattamento farmacologico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various