Preparazione di ovociti di Drosophila fissi per l'immunostaining: un metodo ad alta produttività per fissare e rimuovere la membrana esterna
Published: April 30, 2023
Abstract
Fonte: Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (2016).
L’immunosociazione degli ovociti in fase avanzata di Drosophila può rivelarsi impegnativa a causa delle membrane circostanti degli ovociti. Questo video descrive un metodo ad alta produttività per ottenere gli ovociti, la loro fissazione e la rimozione delle membrane per l’immunosociazione. Il protocollo in primo piano dimostra queste tecniche con ovociti in fase avanzata utilizzati per visualizzare diversi stadi della meiosi.
Protocol
Questo protocollo è tratto da Radford e McKim, Techniques for Imaging Prometaphase e Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016). NOTA: Le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione. Gli incubatori a temperatura controllata vengono utilizzati per mantenere le temperature per l’allevamento a mosca e le croci, salvo diversa indicazione. 1. Preparativi …
Representative Results
droga solvente Concentrazione di scorte Concentrazione finale Tempo di trattamento effetto colchicina etanolo 125 mM 150 μM 10 min o 30 min destabilizzare il non-kinetochore (10 min)o tutti i mi…
Materials
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| magnesium chloride | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
Cite This Article
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).