הכנת אוציטים קבועים של דרוזופילה לחיסון: שיטת תפוקה גבוהה לתיקון והסרה של הממברנה החיצונית

Overview

חיסון של ביצות בשלב מאוחר Drosophila יכול להוכיח מאתגר בשל הממברנות שמסביב ביציות. סרטון זה מתאר שיטה בעלת תפוקה גבוהה להשגת ביציות, קיבעון והסרת ממברנות לחיסון. הפרוטוקול המוצג מדגים טכניקות אלה עם ביציות בשלב מאוחר המשמשות להמחשת שלבים שונים של מיוזיס.

Protocol

פרוטוקול זה מובא מתוך רדפורד ומקים, טכניקות להדמיית פרומטאפאז ומטאפאאז של מיוזיס I ב Drosophila קבוע Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

שים לב: הנהלים מבוצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. חממות מבוקרות טמפרטורה משמשות לשמירה על טמפרטורות לגידול זבובים וצלבים, אלא אם צוין אחרת.

1. הכנות

1. הכינו זבובים.
   1. אוספי ביציות מועשרים בפרומטפאז.
      1. מבוגרים ברורים עפים ממלאי צעיר ובריא או מתרבויות צולבות. בקבוקי גיל במשך יומיים ב 25 מעלות צלזיוס.
         שים לב: בדרך כלל, שני בקבוקים בריאים יספיקו, אם כי ייתכן שיהיה צורך ביותר עבור כמה תרבויות צלב.
      2. לאחר יומיים, לאסוף ~ 100 כדי 300 נקבות (שהם 0 עד 2 ימים בשלב זה) מן הבקבוקים. הנקבות לא צריכות להיות בתולות. מוסיפים טיפה של משחת שמרים לצד בקבוקון ומניחים 30 נקבות ו -10 עד 15 זכרים כל אחד לבקבוקונים השמרים. בקבוקונים גיל במשך יומיים ב 25 מעלות צלזיוס.
   2. אוספי ביציות מועשרים במטאפאזה.
      1. לאסוף ~ 100 כדי 300 נקבות מתרבויות מלאי או לחצות. מוסיפים טיפה של משחת שמרים לצד בקבוקון ומניחים 30 נקבות כל אחת (ללא תוספת זכרים) לבקבוקונים השמרים. בקבוקונים גיל במשך שלושה עד חמישה ימים ב 25 °C (69 °F).
2. הכן פתרונות.
   שים לב: ניתן לאחסן פתרונות ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.
   1. הכן חיץ של רוב שונה (5x): 500 מ"מ HEPES, 500 מ"מ סוכרוז, 275 מ"מ נתרן אצטט, 200 מ"מ אשלגן אצטט, 50 מ"מ גלוקוז, 6 מ"מ מגנזיום כלורי, ו 5 מ"מ סידן כלורי. השתמש 10 N 11:8 נתרן הידרוקסידי:אשלגן הידרוקסיד להביא pH ל 7.4. לעקר על ידי סינון; אין לבצע מובלעת אוטומטית. יש לאחסן ב-20°C. להפשיר לפי הצורך כדי להכין ~ 200 מ"ל של 1x רוב של לכל הכנת ביצית.
   2. פתרונות קיבוע.
      1. אפשרות #1: הכנת קיבעון פורמלדהיד/הפטן. הכנת מאגר קיבוע: מלוחים עם אגירת פוספט (PBS) ו-150 מ"מ סוכרוז. כדי להשתמש, לעשות טרי עם 687.5 μl קיבוע מאגר ו 312.5 μl 16% פורמלדהיד לכל הכנת ביצית.
         אזהרה: ללבוש כפפות תוך שימוש בפתרונות פורמלדהיד במכסה המנוע אדים. להשליך פסולת בהתאם להנחיות המוסדיות.
      2. אפשרות #2: הכנת קיבעון פורמלדהיד/קמודילאט. הכן תיקון תערובת: 250 mM סוכרוז, 100 מ"מ אשלגן אצטט (pH 7.5), 25 מ"מ נתרן אצטט (pH 7.0), ו 25 מ"מ EGTA (pH 8.0). כדי להשתמש, לעשות טרי עם 400 μl לתקן לערבב, 100 μl אשלגן cacodylate (1 M, pH 7.2), ו 500 μl 16% פורמלדהיד לכל הכנת ביצית.
         אזהרה: אשלגן cacodylate מכיל ארסן.
   3. הכן PBS/טריטון X-100: 1x PBS פלוס 1% או 0.05% טריטון X-100. יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
   4. הכן אלבומין סרום PBS-Tween 20-שור (BSA) (PTB): 1x PBS, 0.5% BSA (w/v) ו- 0.1% טווין-20. ניתן לאחסן ב 4 °C (60 °F) למשך שבוע אחד.

2. אוסף של דרוזופילה אוציטס בשלב מאוחר

1. כמו Drosophila ביציות עם ממברנות שלמים יידבק פלסטיק וזכוכית, מראש לצפות את החלק הפנימי של צינור אחד 5 מיליליטר ו צינור פסטר אחד לכל הכנת ביצית עם PTB.
2. בהרדמה של כל ~ 100 עד 300 זבובים שמרים עם פחמן דו חמצני ולהוסיף בלנדר המכיל ~ 100 מיליליטר 1x רוב של Buffer. דופק שלוש פעמים (~ 1 שניות כל אחד). שמור ביציות אצל רוב למשך <20 דקות כדי למנוע הפעלה.
   שים לב: לחלופין, ביציות עשויות להיות מנותח ביד מן הנקבות. היתרון של שיטה זו הוא שהיא דורשת פחות נקבות. עם זאת, יש להקפיד להגביל את החשיפה לפחמן דו חמצני רק כמה דקות כדי למנוע חפצים הקשורים היפוקסיה.
3. סנן דרך רשת שינוי גדולה (~ 1,500 מיקרומטר) לתוך 250 מ"ל beaker כדי להסיר חלקי גוף גדולים. אם בטן שלמה רבים נשארים ברשת, טוחנים מחדש חומר באמצעות חוצץ רוב נוסף, ומסננים שוב. בואו להתיישב ~ 2 דקות, ואז לשאוף את השכבה העליונה, הסרת רבים של חלקי גוף גדולים ככל האפשר.
4. סנן דרך רשת שינוי קטנה (~ 300 מיקרומטר) לתוך 250 מ"ל beaker. יש לשטוף את ביציות הנותרות מהכובע הראשון באמצעות צינור פסטר נוסף של רוב מצופה. בואו להתיישב ~ 3 דקות; ביציות יתיישבו. לשאוף את כל אבל ~ 10 מ"ל.
5. יוצקים כמה שיותר של 10 מ"ל כפי שיתאים לתוך מצופה 5 מ"ל צינור. בואו להתיישב, להסיר נוזל, ולחזור עם שארית. יש לשטוף את ביציות הנותרות מהכובע באמצעות צינורות פסטר נוספים של רוב ומצופה. בואו להתיישב בצינור 5 מ"ל במשך ~ 3 - 5 דקות.

3. טיפולים תרופתיים (אופציונלי)

1. מצפים צינור 5 מ"ל שני עם PTB עבור כל הכנת ביצית. הוסף ממס מתאים (שליטה) או סמים 1 מיליליטר של רוב כל אחד עבור כל הכנה ביצית (טבלה 1).
2. לפצל ביציות לתוך צינור מצופה השני 5 מ"ל. בואו להתיישב, להסיר נוזל, ולהוסיף 1 מיליליטר של רוב בתוספת ממס לתוך צינור אחד 1 מיליליטר של רוב בתוספת סמים לתוך הצינור השני. אגוזים עבור כמות מתאימה של זמן לטיפול תרופתי (טבלה 1). בואו נתפשר.

4. קיבעון

1. לשאוף את כל הנוזלים ומיד להוסיף 1 מיליליטר לתקן.
2. אפשרות #1: קיבעון פורמלדהיד/הפטן (מאגר קיבוע פלוס 5% פורמלדהיד).
   1. לתקן במשך 2.5 דקות על מאגף. מוסיפים 1 מ"ל הפטאן ומערבולת 1 דקות. בואו להתיישב ~ 1 דקה.
   2. הסר את כל הנוזלים ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר 1x PBS. וורטקס 30 שניות. בואו להתיישב ~ 1 דקה.
   3. הסר את כל הנוזלים, ולאחר מכן למלא צינור עם 1x PBS.
      שים לב: ביציות ניתן להשתמש באופן מיידי או לשמור על המאגוז במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר.
3. אפשרות #2: קיבעון פורמלדהיד/קמודילאט (Fix Mix בתוספת 8% פורמלדהיד ו-100 מ"מ קמודילאט).
   1. תיקון במשך 6 דקות על מאגף. בואו להתיישב 2 דקות. הסר נוזל, ולאחר מכן למלא צינור עם 1x PBS.
      שים לב: ביציות ניתן להשתמש באופן מיידי או לשמור על המאגוז במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר.

5. הסרת ממברנות ("מתגלגל")

1. באמצעות צינור פסטר מצופה, להוסיף ~ 500 כדי 1,000 ביציות לחלק חלבי (חול מפוצץ) של שקופית זכוכית. הסר את כל חלקי הגוף וחומרים מיותרים באמצעות מלקחיים. אל תתנו ביציות להתייבש; להוסיף 1x PBS לפי הצורך.
2. מניחים כיסוי על גבי ביציות בעדינות "רול" ביציות עד שכל הקרומים מוסרים (גרירת קצה הכיסוי על פני ביציות עובד הכי טוב). מעת לעת לבדוק את ההתקדמות תחת המיקרוסקופ, הוספת עוד 1x PBS לפי הצורך. היזהר כמו יותר מדי לחץ יהרוס את ביציות.

Representative Results

סמים	הממס	ריכוז מלאי	ריכוז סופי	זמן הטיפול	אפקט
קולכיצין	אתנול	125 מ"מ	150 מיקרומטר	10 דקות או 30 דקות	לערער את היציבות הלא-קינטוצ'ורי (10 דקות) או כל המיקרוטובולות (30 דקות)
פקליטקסל	DMSO	10 מ"מ	10 מיקרומטר	10 דקות	ייצוב מיקרוטובולות
בינוקלאין 2	DMSO	25 מ"מ	25 מיקרומטר	20 דקות	לעכב אורורה B קינאז

טבלה 1: טיפול תרופתי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various