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Encyclopedia of Experiments

为免疫维护准备固定 的果蝇 卵母细胞:修复和去除外膜的高通量方法

Overview

由于卵母细胞周围的膜,对 期卵母细胞的免疫染色可能具有挑战性。此视频描述了获取卵母细胞的高通量方法、其固定和膜去除以进行免疫染色。特色协议演示了这些技术与后期卵母细胞用于可视化不同阶段的肌病。

Protocol

本协议摘自拉德福德和麦金,成像临代谢和元相的美化I在固定的德索菲拉卵母细胞,J.维斯Exp。(2016).

注: 除非另有说明,否则程序在室温下执行。温度控制的孵化器用于维持飞行饲养和交叉的温度,除非另有说明。

1. 准备

  1. 准备苍蝇。
    1. 富含蛋白的卵母细胞系列。
      1. 清除成人苍蝇从健康,年轻的股票或跨文化。年龄瓶两天在25°C。
        注: 一般来说,两个健康的瓶子就足够了,尽管一些跨文化可能需要更多。
      2. 两天后,从瓶子中收集约100至300名女性(此时0至2天大)。女性不需要是处女。在小瓶的侧面加入一点酵母酱,将30只雌性和10至15只雄性分别放入酵母瓶中。年龄小瓶两天在25°C。
    2. 代谢丰富的卵母细胞系列。
      1. 从股票或跨文化中收集约100至300名女性。在小瓶的侧面加入一点酵母酱,将每瓶30只母蜂(不添加男性)放入酵母瓶中。年龄小瓶三至五天在25°C。
  2. 准备解决方案。
    注: 除非另有说明,否则解决方案可在室温下无限期存储。
    1. 准备改良罗布缓冲区 (5 倍): 500 mM HEPES, 500 mM 蔗糖, 275 mM 醋酸钠, 200 mM 醋酸钾, 50 mM 葡萄糖, 6 mM 氯化镁和 5 mM 氯化钙.使用 10 N 11:8 氢氧化钠:氢氧化钾将 pH 带到 7.4。通过过滤消毒;不要高压灭菌。存储在-20°C。 根据需要解冻,准备~200毫升的1x罗伯的每个卵母细胞准备。
    2. 固定解决方案。
      1. 选项#1:准备甲醛/乙烷固定。准备固定缓冲区:1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)加150m蔗糖。要使用,请使用 687.5 μl 固定缓冲区和 312.5 μl 16% 甲醛(每次卵母细胞准备)制作新鲜。
        注意事项: 在烟罩中使用甲醛溶液时戴手套。按照机构准则处理废物。
      2. 选项#2:准备甲醛/可可甲酸酯固定。准备修复混合: 250 mM 蔗糖, 100 mM 醋酸钾 (pH 7.5), 25 mM 醋酸钠 (pH 7.0) 和 25 mM EGTA (pH 8.0).要使用,请使用 400μl 修复混合、100 μl 可可酸钾(1 M、pH 7.2)和 500 μl 16% 甲醛(每个卵母细胞准备)进行新鲜。
        注意事项: 仙人掌钾含有砷。
    3. 准备PBS/特里顿X-100:1x PBS加1%或0.05%特里顿X-100。存储在4°C。
    4. 准备 PBS-Tween 20-牛血清白蛋白 (BSA) (PTB): 1x PBS, 0.5% BSA (w/v) 和 0.1% 补间 - 20.可在4°C下存储一周。

2. 晚期 德罗索菲拉 卵母细胞的集合

  1. 由于带膜完好无损的 磷酸盐 将粘在塑料和玻璃上,因此用PTB预涂一个5毫升管子和一个巴斯德管。
  2. 用二氧化碳麻醉所有 100 到 300 只酵母苍蝇,并加入含有 100 毫升 1x Robb 缓冲器的搅拌机。脉冲三次(每次+1秒)。将卵母细胞保存在 Robb 的 lt:20 分钟内,以避免激活。
    注: 或者,卵母细胞可能从雌性中手工解剖。这种方法的优点是,它需要更少的女性。但是,必须小心将接触二氧化碳的时间限制在几分钟以内,以避免与缺氧相关的人工制品。
  3. 通过大网格(约1,500微米)过滤成250毫升烧嘴,去除大身体部位。如果许多完整的腹部留在网状物上,则使用额外的 Robb 缓冲器重新研磨材料,并再次过滤。让沉淀约2分钟,然后吸气关闭顶层,去除尽可能多的大身体部位。
  4. 通过小网格(约300微米)过滤成250毫升烧嘴。使用额外的 Robb 和涂层的巴斯德管道从第一个烧杯中冲洗剩余的卵母细胞。让结算~3分钟:卵母细胞会安定下来的。吸气关闭所有,但〜10毫升。
  5. 倒尽可能多的10毫升,将适合涂层5毫升管。让沉降,去除液体,并重复与其余的。使用额外的 Robb 和涂层巴斯德管道从烧杯中冲洗剩余的卵母细胞。让定居在5毫升管〜3-5分钟。

3. 药物治疗(可选)

  1. 涂上第二个 5 毫升管与 PTB 为每个卵母细胞准备。添加适当的溶剂(控制)或药物到1毫升Robb的每个卵母细胞准备(表1)。
  2. 将卵母细胞分割成第二层涂层的 5 毫升管。让定居,去除液体,并添加1毫升Robb的加溶剂到一个管和1毫升罗布的加药物到第二管。为适当的药物治疗时间(表1)。让我们安定下来。

4. 固定

  1. 吸走所有液体,并立即添加1毫升修复。
  2. 选项#1:甲醛/乙烷固定(固定缓冲区加5%甲醛)。
    1. 在螺母上修复2.5分钟。添加1毫升赫普坦和漩涡1分钟。让我们解决~1分钟。
    2. 取出所有液体,然后添加 1 毫升 1x PBS。漩涡30秒让我们解决~1分钟。
    3. 取出所有液体,然后用 1 倍 PBS 填充管。
      注: 卵母细胞可以立即使用或在室温下在螺母上保存几个小时。
  3. 选项#2:甲醛/仙人掌固定(修复混合加上8%甲醛和100m可可酸酯)。
    1. 在螺母上修复6分钟。让我们解决2分钟。取出液体,然后用 1 倍 PBS 填充管。
      注: 卵母细胞可以立即使用或在室温下在螺母上保存几个小时。

5. 去除膜("滚动")

  1. 使用涂层的巴斯德管道,在玻璃滑梯的磨砂(砂爆)部分添加约500至1,000个卵母细胞。使用钳子去除所有身体部位和无关材料。不要让卵母细胞干涸:根据需要添加1倍PBS。
  2. 在卵母细胞顶部放置盖子,轻轻"滚动"卵母细胞,直到去除所有膜(拖动覆盖膜边缘穿过卵母细胞效果最好)。定期检查显微镜下的进度,必要时添加更多 1 倍 PBS。小心,因为太多的压力会破坏卵母细胞。

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Representative Results

溶剂 库存集中度 最终浓度 治疗时间 影响
秋水仙碱 乙醇 125立方米 150 微米 10分钟或30分钟 破坏非基尼托科雷的稳定 (10 分钟)
或所有(30分钟)微管
帕利塔塞尔 德姆索 10米 10 微米 10 分钟 稳定微管
双核素 2 德姆索 25米 25 微米 20 分钟 抑制极光 B 激酶

表1:药物治疗。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers Various
5 ml tubes Various
active dry yeast Various mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2 Sigma B1186 HAZARDOUS
blender Various
bovine serum albumin Sigma A4161
calcium chloride Various
colchicine Sigma C-9754 HAZARDOUS
coverslips VWR 48366-227 No. 1 1/2
DMSO Various
EGTA Various
ethanol Various
forceps Ted Pella, Inc. 5622 Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides VWR 48312-003
glucose Various
HEPES VWR EM-5330 available from several venders
magnesium chloride Various
large mesh (~1,500 µm) VWR AA43657-NK variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm) Spectrum labs 146 424 variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator Various
Pasteur pipets Various
potassium acetate Various
Cacodylic acid Sigma C0125 HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide Various
sodium acetate Various
sodium hydroxide Various
sucrose Various
taxol (paclitaxel) Sigma T1912 HAZARDOUS
Triton X-100 Fisher PI-28314
Tween 20 Fisher PI-28320
vortex Various

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资料来源:拉德福德,S.J.,麦金,K.S. 成像蛋白酶和元相的美化I在固定 的磷酸 卵母细胞J. 维斯 (2016).

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