면역 스테인링을 위한 고정 Drosophila Oocytes의 준비: 외부 멤브레인을 수정하고 제거하는 고처리량 방법

Overview

Drosophila 후기 단계 난모세포의 면역 염색은 난모세포의 주변 막 때문에 도전적인 증명할 수 있습니다. 이 비디오는 면역 스테인닝을 위한 난출물, 고정 및 멤브레인제거를 얻기 위한 고처리량 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 단계의 메이오시스를 시각화하는 데 사용되는 후기 단계 난모세포로 이러한 기술을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 래드포드와 맥킴, 고정형 드로소필라 오사이클테스, J. Vis. Exp에서메이오시스 I의 이미징 프로메타페이즈와 메타상을 위한 기술에서 발췌된다. (2016).

참고: 별도로 명시되지 않는 한 절차는 실온에서 수행됩니다. 온도 조절 인큐베이터는 달리 언급하지 않는 한 플라이 리어잉 및 크로스온도를 유지하는 데 사용됩니다.

1. 준비

1. 파리를 준비합니다.
   1. 프로메타페이즈가 풍부한 오사이클 컬렉션.
      1. 맑은 성인은 건강, 젊은 주식 또는 교차 문화에서 비행. 25 °C에서 이틀 동안 에이지 병.
         참고: 일반적으로, 두 개의 건강 한 병 충분 합니다., 비록 더 많은 일부 교차 문화에 대 한 필요할 수 있습니다.
      2. 이틀 후, 병에서 ~100~300마리의 암컷(이 시점에서 0~2일)을 수집합니다. 여성은 처녀가 될 필요가 없습니다. 유리병 의 측면에 효모 페이스트 의 dab을 추가하고 효모 바이알에 각각 30 여성과 10 ~ 15 남성을 배치합니다. 나이 바이알 25 °C에서 이틀 동안.
   2. 메타페이오사이클 컬렉션.
      1. 주식 또는 교차 문화에서 ~ 100 ~ 300 여성을 수집합니다. 유리병 의 측면에 효모 페이스트 의 dab을 추가하고 효모 바이알에 각각 30 여성 (남성 추가없음)을 배치합니다. 나이 바이알은 25°C에서 3~5일 동안 바이알을 합니다.
2. 솔루션을 준비합니다.
   참고: 달리 명시되지 않는 한 솔루션은 실온에서 무기한 저장될 수 있습니다.
   1. 수정된 롭의 버퍼(5배): 500mM HEPES, 500mM 자당, 아세테이트 275m, 아세테이트 200mM 칼륨 아세테이트, 50mMM의 포도당, 염화 마그네슘 6m, 염화칼슘 5m) 10 N 11:8 수산화 나트륨:수산화 칼륨을 사용하여 pH를 7.4로 가져옵니다. 여과에 의해 살균; 자동 클라브하지 마십시오. -20 °C에 보관하십시오. 필요에 따라 해동하여 오피테 준비당 1x Robb의 200ml를 준비하십시오.
   2. 고정 솔루션.
      1. 옵션 #1: 포름알데히드/헵탄 고정을 준비합니다. 고정 버퍼 준비: 1x 인산완충식염식염수선(PBS) 플러스 150 mM 자당. 사용하려면, 687.5 μl 고정 버퍼와 312.5 μl 16% oocyte 준비 당 포름알데히드로 신선하게 하십시오.
         주의: 연기 후드에 포름알데히드 솔루션을 사용하는 동안 장갑을 착용하십시오. 제도적 지침에 따라 폐기물을 폐기합니다.
      2. 옵션 #2: 포름알데히드/코딜레이트 고정을 준비합니다. 준비 수정 믹스 : 250 mM 자당, 100 mM 칼륨 아세테이트 (pH 7.5), 25 mM 나트륨 아세테이트 (pH 7.0), 25 mM EGTA (pH 8.0). 사용하려면 400 μl Fix Mix, 100 μl 칼륨 캐코디레이트(1M, pH 7.2), 오사이클레 준비당 500 μl 16% 포름알데히드로 신선하게 만듭니다.
         주의: 칼륨 캐니콜레이트는 비소를 함유하고 있습니다.
   3. PBS/트리톤 X-100 준비: 1x PBS+ 1% 또는 0.05% 트리톤 X-100. 4 °C에 보관하십시오.
   4. PBS-Tween 20-소 세럼 알부민 (BSA) (PTB): 1 x PBS, 0.5% BSA (w/v), 0.1% 트위엔-20. 1주일 동안 4°C로 보관할 수 있다.

2. 후기 드로소필라 오사이클스 컬렉션

1. 멤브레인이 그대로 있는 Drosophila oocytes가 플라스틱과 유리에 달라붙기 때문에 5ml 튜브 1개, PTB로 오피테 준비당 파스퇴르 파이펫 1개를 미리 코팅합니다.
2. 이산화탄소로 1~100~300마리의 효모 파리를 모두 마취하고 ~ 100ml 1x 롭의 버퍼가 들어 있는 블렌더에 추가합니다. 세 번 펄스 (각 ~ 1 초). 활성화를 피하기 위해 Robb의 20 분 동안 난모세포를 유지하십시오.
   참고: 또는, 난모세포는 암컷에게서 손으로 해부될 수 있다. 이 방법의 장점은 적은 여성이 필요하다는 것입니다. 그러나 저산소증과 관련된 유물을 피하기 위해 이산화탄소에 대한 노출을 단 몇 분으로 제한하기 위해 주의를 기울여야 합니다.
3. 큰 메쉬(~1,500 μm)를 250ml 비커로 걸이면 큰 신체 부위를 제거합니다. 많은 온전한 복부가 메시에 남아 있으면 추가 롭버퍼를 사용하여 재료를 다시 갈기하고 다시 필터링합니다. ~2분 안에 정산한 다음, 상단 층을 흡인하여 가능한 한 많은 큰 신체 부위를 제거합니다.
4. 작은 메쉬(~300 μm)를 250ml 비커로 필터링합니다. 추가 롭과 코팅 파스퇴르 파이펫을 사용하여 첫 번째 비커에서 남은 난모세포를 헹구는. ~3분 정착시키세요; 난모세포가 정착됩니다. ~10ml를 제외한 모든 것을 흡입합니다.
5. 코팅 된 5 ml 튜브에 들어갈 만큼 10ml를 붓습니다. 정착하고 액체를 제거하고 남은 것으로 반복하십시오. 추가 롭과 코팅 파스퇴르 파이펫을 사용하여 비커에서 남은 난모세포를 헹구는 다. ~3-5 분 동안 5 ml 튜브에 정착하십시오.

3. 약물 치료 (선택 사항)

1. 두 번째 5ml 튜브에 PTB를 코팅하여 각 난낭처리 준비에 대해 코팅합니다. 각 난소 세포 준비(표 1)에대해 각각 1 ml Robb의 약물에 적절한 용매 (대조군) 또는 약물을 추가합니다.
2. 두 번째 코팅 된 5 ml 튜브로 난모구를 분할합니다. 정착하고, 액체를 제거하고, 1ml 롭의 플러스 용매를 하나의 튜브에 넣고 롭의 플러스 약물을 두 번째 튜브에 넣습니다. 약물 치료를 위한 적절한시간(표 1)에대한 누테이트. 정착하자.

4. 고정

1. 모든 액체를 흡입하고 즉시 1ml 수정을 추가합니다.
2. 옵션 #1: 포름알데히드/헵탄 고정(고정 버퍼+ 5% 포름알데히드).
   1. 영양사에 2.5 분 동안 수정하십시오. 1 ml 헵탄과 소용돌이 1 분 추가. ~ 1 분 정착하자.
   2. 모든 액체를 제거한 다음 1ml 1ml PBS를 추가합니다. 소용돌이 30 초. ~ 1 분 정착하자.
   3. 모든 액체를 제거한 다음 튜브를 1x PBS로 채웁니다.
      참고: 난모세포는 즉시 사용되거나 실온에서 몇 시간 동안 누에이터에 보관할 수 있습니다.
3. 옵션 #2: 포름알데히드/코딜레이트 고정(픽스 믹스+ 8% 포름알데히드 및 100mM cacodylate).
   1. 영양사에 6 분 동안 수정합니다. 2 분 정착하자. 액체를 제거한 다음 튜브를 1x PBS로 채웁니다.
      참고: 난모세포는 즉시 사용되거나 실온에서 몇 시간 동안 누에이터에 보관할 수 있습니다.

5. 멤브레인 제거 ("롤링")

1. 코팅 된 파스퇴르 파이펫을 사용하여 유리 슬라이드의 서리가 내린 (모래 폭발) 부분에 ~ 500 ~ 1,000 개의 난귀체를 추가하십시오. 집게를 사용하여 모든 신체 부위와 외부 재료를 제거합니다. 난모세포가 건조시키지 마십시오. 필요에 따라 1배 의 PBS를 추가합니다.
2. 모든 멤브레인이 제거될 때까지 뚜껑을 덮는 슬립을 온수 값 위에 놓고 모든 멤브레인이 제거될 때까지 부드럽게 "롤" 난모세포가 있습니다(뚜껑 가장자리를 난모세포에 드래그하는 것이 가장 효과적입니다). 주기적으로 현미경의 진행 상황을 확인하여 필요에 따라 1배 의 PBS를 추가합니다. 너무 많은 압력이 난모세포가 파괴될 때주의하십시오.

Representative Results

마약	용매	재고 농도	최종 농도	치료 시간	효과
콜치친	에탄올	125 mM	150 μM	10분 또는 30분	비키네토초레 불안정 (10 분) 또는 모든 (30 분) 마이크로 투부
파클리탁셀	DMSO	10mM	10 μM	10분	미세 투부 안정화
비뉴클레인 2	DMSO	25 mM	25 μM	20분	억제 오로라 B 키나아제

표 1: 약물 치료.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various