Préparation d’ovocytes fixes de drosophile pour l’immunostaining : méthode à haut débit pour fixer et enlever la membrane externe

Overview

L’immunostaining des ovocytes de phase tardive de Drosophila peut s’avérer provocant dû aux membranes environnantes des ovocytes. Cette vidéo décrit une méthode à haut débit pour l’obtention des ovocytes, leur fixation, et l’enlèvement des membranes pour l’immunostaining. Le protocole présenté démontre ces techniques avec des ovocytes à un stade avancé utilisés pour visualiser différents stades de la méiose.

Protocol

Ce protocole est extrait de Radford et McKim, Techniques for Imaging Prometaphase et Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

REMARQUE: Les procédures sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Les incubateurs à température contrôlée sont utilisés pour maintenir les températures d’élevage et de croisement des mouches, sauf indication contraire.

1. Préparations

1. Préparez les mouches.
   1. Collections d’ovocytes enrichies de prométhée.
      1. Dégagez les mouches adultes des cultures saines, jeunes ou croisées. Bouteilles d’âge pendant deux jours à 25 °C.
         REMARQUE: En général, deux bouteilles saines suffiront, bien que d’autres puissent être nécessaires pour certaines cultures croisées.
      2. Après deux jours, recueillir ~ 100 à 300 femelles (qui sont de 0 à 2 jours à ce stade) à partir des bouteilles. Les femelles n’ont pas besoin d’être vierges. Ajouter une touche de pâte de levure sur le côté d’un flacon et placer 30 femelles et 10 à 15 mâles chacun dans les flacons yeastés. Flacons d’âge pendant deux jours à 25 °C.
   2. Collections d’ovocytes enrichies de méthaphase.
      1. Recueillir ~ 100 à 300 femelles de stock ou de cultures croisées. Ajouter un peu de pâte de levure sur le côté d’un flacon et placer 30 femelles chacune (sans mâles ajoutés) dans les flacons yeastés. Flacons d’âge pendant trois à cinq jours à 25 °C.
2. Préparez des solutions.
   REMARQUE: Les solutions peuvent être stockées indéfiniment à température ambiante, sauf indication contraire.
   1. Préparer le tampon modifié de Robb (5x) : 500 mM HEPES, 500 mM de saccharose, 275 mM d’acétate de sodium, 200 mM d’acétate de potassium, 50 mM de glucose, 6 mM de chlorure de magnésium et 5 mM de chlorure de calcium. Utilisez 10 N 11:8 hydroxyde de sodium: hydroxyde de potassium pour porter le pH à 7,4. Stériliser par filtration; ne pas autoclave. Conserver à -20 °C. Décongeler au besoin pour préparer ~200 ml de 1x Robb’s par préparation d’ovocytes.
   2. Solutions de fixation.
      1. Option #1 : Préparer la fixation du formaldéhyde/heptane. Préparer fixation tampon: 1x saline tamponné phosphate (PBS) plus 150 mM saccharose. Pour l’utiliser, faire frais avec 687,5 μl fixation tampon et 312,5 μl 16% formaldéhyde par préparation des ovocytes.
         MISE EN GARDE: Portez des gants tout en utilisant des solutions de formaldéhyde dans une hotte de fumée. Éliminer les déchets conformément aux lignes directrices institutionnelles.
      2. Option #2 : Préparer la fixation formaldéhyde/cacodylate. Préparer fix mix: 250 mM saccharose, 100 mM d’acétate de potassium (pH 7,5), 25 mM d’acétate de sodium (pH 7,0), et 25 mM EGTA (pH 8,0). Pour l’utiliser, faire frais avec 400 μl Fix Mix, 100 μl de cacodylate de potassium (1 M, pH 7,2), et 500 μl 16% de formaldéhyde par préparation des ovocytes.
         MISE EN GARDE: Le cacodylate de potassium contient de l’arsenic.
   3. Préparer PBS/Triton X-100: 1x PBS plus 1% ou 0,05% Triton X-100. Conserver à 4 °C.
   4. Préparer PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0.5% BSA (w/v), et 0.1% Tween-20. Peut être stocké à 4 °C pendant une semaine.

2. Collection d’ovocytes drosophiles à un stade avancé

1. Comme les ovocytes Drosophila avec des membranes intactes colleront au plastique et au verre, pré-enrober l’intérieur d’un tube de 5 ml et d’un pipet Pasteur par préparation d’ovocyte avec PTB.
2. Anesthésier toutes les mouches à levures ~ 100 à 300 avec du dioxyde de carbone et ajouter à un mélangeur contenant ~ 100 ml 1x Robb’s Buffer. Pulsez trois fois (~1 sec chacun). Gardez les ovocytes dans Robb’s pendant 20 min pour éviter l’activation.
   REMARQUE: Alternativement, les ovocytes peuvent être disséqués à la main des femelles. L’avantage de cette méthode est qu’elle nécessite moins de femelles. Cependant, il faut prendre soin de limiter l’exposition au dioxyde de carbone à seulement quelques minutes pour éviter les artefacts associés à l’hypoxie.
3. Filtrer à travers une grande maille (~1 500 μm) dans un bécher de 250 ml pour enlever les grandes parties du corps. Si de nombreux abdomens intacts restent en maille, re-broyer le matériau à l’aide de tampon robb supplémentaire, et filtrer à nouveau. Laissez régler ~ 2 min, puis aspirer hors couche supérieure, en enlevant autant de grandes parties du corps que possible.
4. Filtrer à travers une petite maille (~300 μm) dans un bécher de 250 ml. Rincer les ovocytes restants du premier bécher à l’aide d’un tuyau Pasteur supplémentaire robb’s et enduit. Laisser régler ~3 min; les ovocytes s’installeront. Aspirer hors tout sauf ~ 10 ml.
5. Verser autant de 10 ml que ce qui s’insaîtra dans le tube enduit de 5 ml. Laisser se déposer, retirer le liquide et répéter avec le reste. Rincer les ovocytes restants du bécher à l’aide d’un tuyau Pasteur supplémentaire robb’s et enduit. Laisser s’installer dans un tube de 5 ml pendant ~3-5 min.

3. Traitements médicamenteux (facultatif)

1. Enrober un deuxième tube de 5 ml de PTB pour chaque préparation des ovocytes. Ajouter le solvant (contrôle) ou le médicament approprié à 1 ml de Robb’s chacun pour chaque préparation des ovocytes (tableau 1).
2. Diviser les ovocytes en deuxième tube enduit de 5 ml. Laisser s’installer, retirer le liquide et ajouter 1 ml de robb’s plus solvant dans un tube et 1 ml de drogue Robb’s plus dans le deuxième tube. Nutate pour la quantité appropriée de temps pour le traitement de la drogue( Tableau 1). Laissez-vous installer.

4. Fixation

1. Aspirer tout liquide et ajouter immédiatement 1 ml Fix.
2. Option #1: Fixation formaldéhyde/heptane (Fixation Buffer plus 5% formaldéhyde).
   1. Fixer pendant 2,5 min sur un nutator. Ajouter 1 ml d’heptane et vortex 1 min. Laisser régler ~ 1 min.
   2. Retirer tout le liquide, puis ajouter 1 ml 1 x PBS. Vortex 30 sec. Laisser régler ~ 1 min.
   3. Retirer tout le liquide, puis remplir le tube avec 1x PBS.
      REMARQUE: Les ovocytes peuvent être utilisés immédiatement ou conservés sur le nutator pendant plusieurs heures à température ambiante.
3. Option #2: Fixation formaldéhyde/cacodylate (Fix Mix plus 8% de formaldéhyde et 100 mM de cacodylate).
   1. Fixer pendant 6 min sur un nutator. Laisser régler 2 min. Retirer le liquide, puis remplir le tube avec 1x PBS.
      REMARQUE: Les ovocytes peuvent être utilisés immédiatement ou conservés sur le nutator pendant plusieurs heures à température ambiante.

5. Enlever les membranes (« Roulant »)

1. À l’aide d’un pipet Pasteur enduit, ajouter environ 500 à 1 000 ovocytes à la partie givrée (sablé) d’une glissade en verre. Retirez toutes les parties du corps et les matières superflues à l’aide de forceps. Ne laissez pas les ovocytes sécher; ajouter 1x PBS si nécessaire.
2. Placez un coverslip sur les ovocytes et roulez doucement les ovocytes jusqu’à ce que toutes les membranes soient enlevées (faire glisser le bord du coverslip sur les ovocytes fonctionne le mieux). Vérifiez périodiquement les progrès au microscope, en ajoutant plus de 1x PBS au besoin. Prenez soin car trop de pression détruira les ovocytes.

Representative Results

drogue	solvant	Concentration des stocks	Concentration finale	Heure du traitement	effet
colchicine	éthanol	125 mM	150 μM	10 min ou 30 min	déstabiliser le non-kinetochore (10 min) ou tous les microtubules (30 min)
paclitaxel paclitaxel	Dmso	10 mM	10 μM (10 μM)	10 min	stabiliser les microtubules
Binucléine 2	Dmso	25 mM	25 μM (25 μM)	20 min	inhiber Aurora B kinase

Tableau 1 : Traitement médicamenteux.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various