Préparation d’ovocytes fixes de drosophile pour l’immunostaining : méthode à haut débit pour fixer et enlever la membrane externe
Published: April 30, 2023
Abstract
Source : Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase et Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (2016).
L’immunostaining des ovocytes de phase tardive de Drosophila peut s’avérer provocant dû aux membranes environnantes des ovocytes. Cette vidéo décrit une méthode à haut débit pour l’obtention des ovocytes, leur fixation, et l’enlèvement des membranes pour l’immunostaining. Le protocole présenté démontre ces techniques avec des ovocytes à un stade avancé utilisés pour visualiser différents stades de la méiose.
Protocol
Ce protocole est extrait de Radford et McKim, Techniques for Imaging Prometaphase et Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016). REMARQUE: Les procédures sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Les incubateurs à température contrôlée sont utilisés pour maintenir les températures d’élevage et de croisement des mouches, sauf indication contraire. 1. Pré…
Representative Results
drogue solvant Concentration des stocks Concentration finale Heure du traitement effet colchicine éthanol 125 mM 150 μM 10 min ou 30 min déstabiliser le non-kinetochore (10 min)ou tous les mic…
Materials
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| magnesium chloride | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
Cite This Article
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).