Preparación de Oocitos drosophila fijos para inmunodetención: Un método de alto rendimiento para fijar y eliminar la membrana externa

Overview

La inmunodetención de ocitos en etapa tardía de Drosophila puede resultar difícil debido a las membranas circundantes de los ocitos. Este video describe un método de alto rendimiento para obtener ocitos, su fijación y la eliminación de membranas para la inmunodetención. El protocolo destacado demuestra estas técnicas con ocitos en etapa tardía utilizados para visualizar diferentes etapas de la meiosis.

Protocol

Este protocolo se extrae de Radford y McKim, Técnicas para la Prometafase por Imágenes y Metafase de Meiosis I en Oocitos Drosophila Fijos, J. Vis. Exp. (2016).

NOTA: Los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Las incubadoras con temperatura controlada se utilizan para mantener las temperaturas para la cría de moscas y cruces a menos que se indique lo contrario.

1. Preparativos

1. Prepara moscas.
   1. Colecciones de ocitos enriquecidos con prometafasa.
      1. Moscas adultas claras de cultivos sanos, jóvenes o transversales. Biberones de edad durante dos días a 25 °C.
         NOTA: Generalmente, dos botellas saludables serán suficientes, aunque se puede necesitar más para algunos cultivos cruzados.
      2. Después de dos días, recoger ~ 100 a 300 hembras (que tienen de 0 a 2 días de edad en este punto) de las botellas. Las hembras no necesitan ser vírgenes. Agregue un poco de pasta de levadura al lado de un vial y coloque 30 hembras y de 10 a 15 machos cada uno en los viales con levadura. Viales de edad durante dos días a 25 °C.
   2. Colecciones de Oocitos enriquecidas con metafase.
      1. Recoger ~ 100 a 300 hembras de las culturas de stock o cross. Agregue un poco de pasta de levadura al lado de un vial y coloque 30 hembras cada una (sin machos añadidos) en los viales con levadura. Viales de edad de tres a cinco días a 25 °C.
2. Preparar soluciones.
   NOTA: Las soluciones pueden almacenarse indefinidamente a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
   1. Preparar tampón de robo modificado (5x): 500 mM HEPES, 500 mM de sacarosa, acetato de sodio de 275 mM, acetato de potasio de 200 mM, glucosa de 50 mM, cloruro de magnesio de 6 mM y cloruro de calcio de 5 mM. Utilice 10 N 11:8 hidróxido de sodio:hidróxido de potasio para llevar el pH a 7,4. Esterilizar por filtración; no autoclave. Conservar a -20 °C. Descongelar según sea necesario para preparar ~200 ml de 1x Robb's por preparación de ocitos.
   2. Soluciones de fijación.
      1. Opción #1: Preparar la fijación formaldehído/heptano. Prepare el búfer de fijación: solución salina (PBS) con búfer de fosfato de 1x más sacarosa de 150 mM. Para su uso, hacer fresco con 687.5 μl Fixation Buffer y 312.5 μl 16% formaldehído por preparación de ocitos.
         PRECAUCIÓN: Use guantes mientras usa soluciones de formaldehído en una campana de humo. Deseche los residuos de acuerdo con las directrices institucionales.
      2. Opción #2: Preparar la fijación formaldehído/cacodilato. Preparar fix mix: sacarosa de 250 mM, acetato de potasio de 100 mM (pH 7.5), acetato de sodio de 25 mM (pH 7.0) y EGTA de 25 mM (pH 8.0). Para su uso, hacer fresco con 400 μl Fix Mix, 100 μl cacodilato de potasio (1 M, pH 7.2) y 500 μl 16% formaldehído por preparación de oocitos.
         PRECAUCIÓN: El cacodilato de potasio contiene arsénico.
   3. Prepare PBS/Triton X-100: 1x PBS más 1% o 0.05% Tritón X-100. Conservar a 4 °C.
   4. Prepare PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0.5% BSA (w/v) y 0.1% Tween-20. Puede almacenarse a 4 °C durante una semana.

2. Colección de Oocitos Drosophila en etapa tardía

1. Como los ocitos de Drosophila con membranas intactas se adhieren al plástico y el vidrio, pre-cubren el interior de un tubo de 5 ml y un pipete Pasteur por preparación de ocitos con PTB.
2. Anestesia todas las moscas con dióxido de carbono ~100 a 300 yeasted y añade a una licuadora que contiene ~100 ml 1x Robb's Buffer. Pulso tres veces (~1 seg cada uno). Mantenga los ocitos en Robb's durante <20 min para evitar la activación.
   NOTA: Alternativamente, los ocitos pueden ser diseccionados a mano de las hembras. La ventaja de este método es que requiere menos hembras. Sin embargo, se debe tener cuidado de limitar la exposición al dióxido de carbono a solo unos minutos para evitar artefactos asociados con la hipoxia.
3. Filtre a través de malla grande (~1.500 μm) en vaso de precipitados de 250 ml para eliminar piezas grandes del cuerpo. Si muchos abdomens intactos permanecen en malla, vuelva a moler el material usando el búfer adicional de Robb y filtre de nuevo. Deje que se asiente ~ 2 min, luego aspirar fuera de la capa superior, eliminando tantas partes grandes del cuerpo como sea posible.
4. Filtre a través de malla pequeña (~300 μm) en un vaso de precipitados de 250 ml. Enjuague los ócitos restantes del primer vaso de precipitados usando pipete adicional de Robb y Pasteur recubierto. Deje que se asiente ~3 min; los ocitos se asentarán. Aspirar fuera de todos menos ~ 10 ml.
5. Vierta la mayor cantidad de los 10 ml que caben en el tubo recubierto de 5 ml. Deje que se asiente, retire el líquido y repita con el resto. Enjuague los ócitos restantes del vaso de precipitados con un pipete adicional de Robb y Pasteur recubierto. Deje instalarse en tubo de 5 ml durante ~3-5 min.

3. Tratamientos farmacológicos (opcional)

1. Cubra un segundo tubo de 5 ml con PTB para cada preparación de ocitos. Agregue el disolvente (control) o el medicamento apropiado a 1 ml de Robb cada uno para cada preparación de ocitos (Tabla 1).
2. Divida los ocitos en el segundo tubo recubierto de 5 ml. Deje que se asiente, retire el líquido y agregue 1 ml más disolvente en un tubo y 1 ml más droga en el segundo tubo. Nutate para una cantidad adecuada de tiempo para el tratamiento farmacológico (Tabla 1). Deja que te conformes.

4. Fijación

1. Aspirar fuera de todo líquido y añadir inmediatamente 1 ml Fix.
2. Opción #1: Fijación de formaldehído/heptano (búfer de fijación más 5% de formaldehído).
   1. Fijar durante 2,5 minutos en un nutator. Añadir 1 ml de heptano y vórtice 1 min. Deje que se asiente ~1 min.
   2. Retire todo el líquido y, a continuación, agregue 1 ml 1x PBS. Vórtice 30 seg. Deje que se asiente ~1 min.
   3. Retire todo el líquido y, a continuación, llene el tubo con 1x PBS.
      NOTA: Los ocitos se pueden utilizar inmediatamente o mantenerse en el nutator durante varias horas a temperatura ambiente.
3. Opción #2: Fijación formaldehído/cacodilato (Fix Mix más 8% formaldehído y cacodilato de 100 mM).
   1. Fijar durante 6 minutos en un nutator. Deje que se asiente 2 min. Retire el líquido y, a continuación, llene el tubo con 1x PBS.
      NOTA: Los ocitos se pueden utilizar inmediatamente o mantenerse en el nutator durante varias horas a temperatura ambiente.

5. Extracción de membranas ("Rodando")

1. Usando pipete Pasteur recubierto, agrega ~500 a 1,000 ócitos a la parte esmerilada (bulada por arena) de un tobogán de vidrio. Retire todas las partes del cuerpo y el material extraño utilizando fórceps. No deje que los ocitos se sequen; añadir 1x PBS según sea necesario.
2. Coloque un tubo de cubierta en la parte superior de los ocitos y "enrolle" suavemente los ocitos hasta que se retiren todas las membranas (arrastrar el borde del tubo de cubierta a través de los ócitos funciona mejor). Revise periódicamente el progreso bajo el microscopio, añadiendo más 1x PBS según sea necesario. Cuídate ya que demasiada presión destruirá los ocitos.

Representative Results

droga	solvente	Concentración de existencias	Concentración final	Tiempo de tratamiento	efecto
colchicina	etanol	125 mM	150 μM	10 min o 30 min	desestabilizar non-kinetochore (10 min) o todos (30 min) microtúbulos
paclitaxel	Dmso	10 mM	10 μM	10 min	estabilizar microtúbulos
Binucleina 2	Dmso	25 mM	25 μM	20 min	inhibir aurora B quinasa

Tabla 1: Tratamiento farmacológico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various