Preparación de Oocitos drosophila fijos para inmunodetención: Un método de alto rendimiento para fijar y eliminar la membrana externa
Published: April 30, 2023
Abstract
Fuente: Radford, S. J., McKim, K. S. Técnicas de Prometafase por imágenes y Metafase de Meiosis I en Oocitos Drosophila Fijos. J. Vis. (2016).
La inmunodetención de ocitos en etapa tardía de Drosophila puede resultar difícil debido a las membranas circundantes de los ocitos. Este video describe un método de alto rendimiento para obtener ocitos, su fijación y la eliminación de membranas para la inmunodetención. El protocolo destacado demuestra estas técnicas con ocitos en etapa tardía utilizados para visualizar diferentes etapas de la meiosis.
Protocol
Este protocolo se extrae de Radford y McKim, Técnicas para la Prometafase por Imágenes y Metafase de Meiosis I en Oocitos Drosophila Fijos, J. Vis. Exp. (2016). NOTA: Los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Las incubadoras con temperatura controlada se utilizan para mantener las temperaturas para la cría de moscas y cruces a menos que se indique lo contrario. 1. Prep…
Representative Results
droga solvente Concentración de existencias Concentración final Tiempo de tratamiento efecto colchicina etanol 125 mM 150 μM 10 min o 30 min desestabilizar non-kinetochore (10 min)o todos (30 …
Materials
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| magnesium chloride | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
Cite This Article
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).