Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Подготовка фиксированных drosophila Oocytes для иммуностиминга: метод высокой пропускной способности для исправления и удаления внешней мембраны

Overview

Иммуностинирование ооцитов дрозофилы на поздней стадии может оказаться сложной задачей из-за окружающих мембран яйцеклеток. Это видео описывает метод высокой пропускной способности для получения яйцеклеток, их фиксации и удаления мембран для иммуностимления. Рекомендуемый протокол демонстрирует эти методы с поздней стадии ооцитов, используемых для визуализации различных стадий мейоза.

Protocol

Этот протокол выдержки из Рэдфорд и Макким, Методы для визуализации прометазы и метафазы мейоза I в фиксированных drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры выполняются при комнатной температуре, если не указано иное. Контролируемые температурой инкубаторы используются для поддержания температуры для выращивания мух и крестов, если не указано иное.

1. Подготовка

  1. Подготовь мух.
    1. Коллекции ооцитов, обогащенных прометафазом.
      1. Очистить взрослых мух из здоровых, молодых запасов или перекрестных культур. Возраст бутылки в течение двух дней при 25 градусов по Цельсию.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, две здоровые бутылки будет достаточно, хотя больше может потребоваться для некоторых перекрестных культур.
      2. Через два дня соберите из бутылок от 100 до 300 самок (на данный момент от 0 до 2 дней). Самки не должны быть девственницами. Добавить мазок дрожжевой пасты в сторону флакона и место 30 женщин и от 10 до 15 мужчин каждый в дрожжевых флаконов. Возраст флаконов в течение двух дней при 25 градусов по Цельсию.
    2. Метафаз-обогащенные коллекции Oocyte.
      1. Соберите от 100 до 300 женщин из фондовых или перекрестных культур. Добавить мазок дрожжевой пасты в сторону флакона и место 30 женщин каждый (без мужчин добавил) в дрожжевых флаконов. Возраст флаконов в течение трех-пяти дней при 25 градусов по Цельсию.
  2. Подготовь решения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Решения могут храниться бесконечно при комнатной температуре, если не указано иное.
    1. Подготовка модифицированного буфера Робба (5x): 500 мМ HEPES, 500 мм сахарозы, 275 мм ацетата натрия, 200 мМ ацетата калия, 50 мМ глюкозы, 6 мм хлорида магния и 5 мм хлорида кальция. Используйте 10 N 11:8 гидроксида натрия: гидроксид калия довести рН до 7,4. Стерилизовать путем фильтрации; не автоклав. Хранить при -20 градусов по Цельсию. Оттепель по мере необходимости, чтобы подготовить 200 мл 1x Робб в oocyte подготовки.
    2. Решения по фиксации.
      1. Вариант #1: Подготовка фиксации формальдегида/гептана. Подготовка Фиксация Буфер: 1x фосфат-буферный солевой раствор (PBS) плюс 150 мМ сахарозы. Чтобы использовать, сделать свежие с 687,5 мкл Фиксация буфера и 312,5 мкл 16% формальдегида на ооцит подготовки.
        ВНИМАНИЕ: Носите перчатки при использовании растворов формальдегида в дымовом капюшоне. Утилизация отходов в соответствии с институциональными руководящими принципами.
      2. Вариант #2: Подготовка фиксации формальдегида/какодилата. Приготовить Fix Mix: сахарозу 250 мМ, ацетат калия 100 мМ (рН 7,5), ацетат натрия 25 мМ (рН 7,0) и 25 мМ ЕГТА (рН 8,0). Чтобы использовать, сделать свежие с 400 йл Fix Mix, 100 йл калия какодилат (1 М, рН 7,2), и 500 йл 16% формальдегида на ооцит подготовки.
        ВНИМАНИЕ: Какодилат калия содержит мышьяк.
    3. Подготовка PBS/Triton X-100: 1x PBS плюс 1% или 0,05% Triton X-100. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
    4. Подготовка PBS-Tween 20-Bovine сыворотки Альбумин (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v), и 0,1% Tween-20. Может храниться при 4 градусах Цельсия в течение одной недели.

2. Коллекция поздней стадии Drosophila Oocytes

  1. Как Drosophila яйцеклеток с мембранами нетронутыми будет придерживаться пластика и стекла, предварительно пальто внутри одного 5 мл трубки и один Пастер пипетки на яйцеклетки подготовки с ПТБ.
  2. Обезболивать всех дрожжевых мух с углекислым газом от 100 до 300 евро и добавить в блендер, содержащий буфер 100 мл 1x Robb's Buffer. Пульс три раза (по 1 сек каждый). Держите ооциты в Робб для Lt;20 мин, чтобы избежать активации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, яйцеклетки могут быть вручную расчленены у самок. Преимущество этого метода заключается в том, что он требует меньше женщин. Тем не менее, необходимо позаботиться, чтобы ограничить воздействие двуокиси углерода лишь несколько минут, чтобы избежать артефактов, связанных с гипоксией.
  3. Фильтр через большую сетку (1500 мкм) в 250 мл стакана для удаления больших частей тела. Если многие нетронутые животы остаются на сетке, повторно измельчить материал с помощью дополнительного буфера Робба, и фильтр снова. Пусть урегулировать 2 мин, а затем аспирировать от верхнего слоя, удаляя как можно больше крупных частей тела, как это возможно.
  4. Фильтр через небольшую сетку (300 мкм) в стакан 250 мл. Промыть оставшиеся яйцеклетки из первого стакана с помощью дополнительных Робб и покрытием Пастер пипетки. Пусть урегулировать 3 мин; яйцеклетки будут осесел. Аспирировать все, кроме 10 мл.
  5. Налейте столько из 10 мл, как будет вписываться в покрытием 5 мл трубки. Пусть оседают, удалить жидкость, и повторить с остатком. Промыть оставшиеся яйцеклетки из стакана с помощью дополнительных Робб и покрытием Пастер пипетки. Пусть поселиться в 5 мл трубки в течение 3-5 мин.

3. Лекарственное лечение (по желанию)

  1. Пальто второй 5 мл трубки с ПТБ для каждого яйцеклетки подготовки. Добавьте соответствующий растворитель (контроль) или препарат по 1 мл Робба для каждого подготовителя яйцеклеток(таблица 1).
  2. Разделите ооциты на вторую трубку с покрытием 5 мл. Пусть поселиться, удалить жидкость, и добавить 1 мл Робб плюс растворитель в одну трубку и 1 мл Робб плюс препарат во вторую трубку. Орех для соответствующего количества времени для лечения наркомании(таблица 1). Пусть успокоится.

4. Фиксация

  1. Аспирировать всю жидкость и сразу же добавить 1 мл Fix.
  2. Вариант #1: Фиксация формальдегида/гептана (Fixation Buffer плюс 5% формальдегида).
    1. Исправить в течение 2,5 мин на nutator. Добавьте 1 мл гептана и вихря 1 мин. Пусть урегулировать 1 мин.
    2. Удалите всю жидкость, а затем добавьте 1 мл 1x PBS. Вихрь 30 сек. Пусть урегулировать 1 мин.
    3. Удалите всю жидкость, а затем заполнить трубку с 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Oocytes можно использовать немедленно или держать на nutator на несколько часов на комнатной температуре.
  3. Вариант #2: Фиксация формальдегида/какодилата (Fix Mix плюс 8% формальдегида и 100 мМ какодилат).
    1. Исправить в течение 6 минут на nutator. Пусть поселиться 2 мин. Удалить жидкость, а затем заполнить трубку с 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Oocytes можно использовать немедленно или держать на nutator на несколько часов на комнатной температуре.

5. Удаление мембран ("Роллинг")

  1. Используя трубу Pasteur с покрытием, добавьте от 500 до 1000 яйцеклеток в матовую (песчаную) часть стеклянной горки. Удалите все части тела и посторонний материал с помощью типсов. Не позволяйте яйцеклетки высохнуть; добавить 1x PBS по мере необходимости.
  2. Поместите крышку поверх ооцитов и аккуратно "ролл" яйцеклетки, пока все мембраны удаляются (перетаскивание края крышки через яйцеклетки работает лучше всего). Периодически проверяйте прогресс под микроскопом, добавляя при необходимости более 1x PBS. Позаботьтесь, как слишком большое давление уничтожит яйцеклетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

лекарство растворитель Концентрация запасов Окончательная концентрация Время лечения эффект
Колхицин этанол 125 мМ 150 МКМ 10 мин или 30 мин дестабилизировать не кинетохор (10 мин)
или все (30 мин) микротрубоконы
paclitaxel Дмсо 10 мМ 10 МКМ 10 мин. стабилизировать микротрубоконы
Бинуклеин 2 Дмсо 25 мМм 25 МКМ 20 мин. ингибировать Аврора B киназы

Таблица 1: Лечение наркомании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers Various
5 ml tubes Various
active dry yeast Various mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2 Sigma B1186 HAZARDOUS
blender Various
bovine serum albumin Sigma A4161
calcium chloride Various
colchicine Sigma C-9754 HAZARDOUS
coverslips VWR 48366-227 No. 1 1/2
DMSO Various
EGTA Various
ethanol Various
forceps Ted Pella, Inc. 5622 Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides VWR 48312-003
glucose Various
HEPES VWR EM-5330 available from several venders
magnesium chloride Various
large mesh (~1,500 µm) VWR AA43657-NK variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm) Spectrum labs 146 424 variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator Various
Pasteur pipets Various
potassium acetate Various
Cacodylic acid Sigma C0125 HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide Various
sodium acetate Various
sodium hydroxide Various
sucrose Various
taxol (paclitaxel) Sigma T1912 HAZARDOUS
Triton X-100 Fisher PI-28314
Tween 20 Fisher PI-28320
vortex Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Пустое значение выпуск
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter