Voorbereiding van vaste Drosophila-oöcyten voor immunostaining: een methode met hoge doorvoer om het buitenste membraan te repareren en te verwijderen

Overview

Immunostaining van Drosophila late-stage oöcyten kan een uitdaging zijn vanwege de omliggende membranen van de oöcyten. Deze video beschrijft een methode met hoge doorvoer voor het verkrijgen van oöcyten, hun fixatie en het verwijderen van membranen voor immunostaining. Het aanbevolen protocol demonstreert deze technieken met laat stadium oöcyten die worden gebruikt om verschillende stadia van meiose te visualiseren.

Protocol

Dit protocol is overgenomen uit Radford en McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

OPMERKING: Procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Temperatuurgecontroleerde incubators worden gebruikt om temperaturen voor vliegopfok en kruisen te handhaven, tenzij anders vermeld.

1. Voorbereidingen

1. Bereid vliegen voor.
   1. Prometaphase-verrijkte oöcytcollecties.
      1. Duidelijke volwassen vliegen van gezonde, jonge stam of dwarsculturen. Verouder flessen gedurende twee dagen bij 25 °C.
         OPMERKING: Over het algemeen volstaan twee gezonde flessen, hoewel er meer nodig kan zijn voor sommige kruisingsculturen.
      2. Verzamel na twee dagen ~ 100 tot 300 vrouwtjes (die op dit moment 0 tot 2 dagen oud zijn) uit de flessen. De vrouwtjes hoeven geen maagden te zijn. Voeg een beetje gistpasta toe aan de zijkant van een flacon en plaats 30 vrouwtjes en 10 tot 15 mannetjes elk in de gegiste flacons. Verouder flacons gedurende twee dagen bij 25 °C.
   2. Met metafase verrijkte oöcytcollecties.
      1. Verzamel ~ 100 tot 300 vrouwtjes uit stam- of kruisingsculturen. Voeg een beetje gistpasta toe aan de zijkant van een flacon en plaats elk 30 vrouwtjes (zonder mannetjes toegevoegd) in de gegiste flacons. Verouder flacons gedurende drie tot vijf dagen bij 25 °C.
2. Oplossingen voorbereiden.
   OPMERKING: Oplossingen mogen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard, tenzij anders vermeld.
   1. Bereid gemodificeerde Robb's Buffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sucrose, 275 mM natriumacetaat, 200 mM kaliumacetaat, 50 mM glucose, 6 mM magnesiumchloride en 5 mM calciumchloride. Gebruik 10 N 11:8 natriumhydroxide:kaliumhydroxide om de pH op 7,4 te brengen. Steriliseren door filtratie; niet autoclaaf. Bewaren bij -20 °C. Ontdooi indien nodig om ~200 ml 1x Robb's per oöcyt prep te bereiden.
   2. Fixatie oplossingen.
      1. Optie #1: Bereid formaldehyde/heptaanfixatie voor. Fixatiebuffer voorbereiden: 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) plus 150 mM sacharose. Te gebruiken, vers maken met 687,5 μl Fixatie buffer en 312,5 μl 16% formaldehyde per oöcyt prep.
         LET OP: Draag handschoenen tijdens het gebruik van formaldehyde-oplossingen in een zuurkast. Gooi afval weg volgens de institutionele richtlijnen.
      2. Optie #2: Bereid formaldehyde/cacodylaat fixatie voor. Prepare Fix Mix: 250 mM sucrose, 100 mM kaliumacetaat (pH 7,5), 25 mM natriumacetaat (pH 7,0) en 25 mM EGTA (pH 8,0). Te gebruiken, vers maken met 400 μl Fix Mix, 100 μl kalium cacodylaat (1 M, pH 7,2) en 500 μl 16% formaldehyde per oöcyt prep.
         LET OP: Kaliumcacodylaat bevat arseen.
   3. Pbs/Triton X-100 voorbereiden: 1x PBS plus 1% of 0,05% Triton X-100. Bewaren bij 4 °C.
   4. Bereid PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumine (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) en 0,1% Tween-20. Kan een week bij 4 °C worden bewaard.

2. Verzameling drosophila-oöcyten in een laat stadium

1. Aangezien Drosophila-oöcyten met intacte membranen aan plastic en glas blijven plakken, moet u de binnenkant van één buis van 5 ml en één Pasteur-pipet per oöcytvoorbereiding voorschilderen met PTB.
2. Verdoof alle ~100 tot 300 gegiste vliegen met kooldioxide en voeg toe aan een blender met ~100 ml 1x Robb's Buffer. Pulseer drie keer (~ 1 sec elk). Houd oöcyten in Robb's gedurende <20 min om activering te voorkomen.
   OPMERKING: Als alternatief kunnen oöcyten met de hand worden ontleed van vrouwtjes. Het voordeel van deze methode is dat het minder vrouwtjes vereist. Er moet echter voor worden gezorgd dat de blootstelling aan kooldioxide tot slechts een paar minuten wordt beperkt om artefacten in verband met hypoxie te voorkomen.
3. Filtreer door groot gaas (~ 1.500 μm) in een bekerglas van 250 ml om grote lichaamsdelen te verwijderen. Als er veel intacte buiken op gaas achterblijven, maalt u het materiaal opnieuw met extra Robb's Buffer en filtert u opnieuw. Laat ~2 min bezinken, aspireer dan van de bovenste laag en verwijder zoveel mogelijk van de grote lichaamsdelen.
4. Filtreer door klein gaas (~300 μm) in een bekerglas van 250 ml. Spoel de resterende oöcyten uit het eerste bekerglas met extra Robb's en gecoate Pasteur pipet. Laat ~3 min; oöcyten zullen zich vestigen. Aspireer alles behalve ~ 10 ml.
5. Giet zoveel mogelijk van de 10 ml als in een gecoate buis van 5 ml past. Laat bezinken, verwijder vloeistof en herhaal met rest. Spoel de resterende oöcyten uit het bekerglas met extra Robb's en gecoate Pasteur pipet. Laat bezinken in 5 ml buis voor ~ 3-5 min.

3. Medicamenteuze behandelingen (optioneel)

1. Bekleed een tweede tube van 5 ml met PTB voor elke oöcytvoorbereiding. Voeg het juiste oplosmiddel (controlemiddel) of medicijn toe aan 1 ml Robb's elk voor elke oöcytvoorbereiding (Tabel 1).
2. Splits oöcyten in een tweede gecoate buis van 5 ml. Laat bezinken, verwijder vloeistof en voeg 1 ml Robb's plus oplosmiddel toe aan één tube en 1 ml Robb's plus drug in de tweede tube. Nutaat gedurende de juiste tijd voor medicamenteuze behandeling (Tabel 1). Laat je schikken.

4. Fixatie

1. Aspireer alle vloeistof en voeg onmiddellijk 1 ml Fix toe.
2. Optie #1: Formaldehyde/heptaanfixatie (Fixatiebuffer plus 5% formaldehyde).
   1. Fix gedurende 2,5 min op een nutator. Voeg 1 ml heptaan en vortex 1 min toe. Laat ~1 min.
   2. Verwijder alle vloeistof en voeg vervolgens 1 ml 1x PBS toe. Vortex 30 sec. Laat ~1 min.
   3. Verwijder alle vloeistof en vul de buis met 1x PBS.
      OPMERKING: Oöcyten kunnen onmiddellijk worden gebruikt of enkele uren bij kamertemperatuur op de nutator worden bewaard.
3. Optie #2: Formaldehyde/cacodylaat fixatie (Fix Mix plus 8% formaldehyde en 100 mM cacodylaat).
   1. Fix gedurende 6 minuten op een nutator. Laat 2 min. bezinken. Verwijder de vloeistof en vul de buis met 1x PBS.
      OPMERKING: Oöcyten kunnen onmiddellijk worden gebruikt of enkele uren bij kamertemperatuur op de nutator worden bewaard.

5. Membranen verwijderen ("Rollen")

1. Voeg met behulp van gecoate Pasteur pipet ~ 500 tot 1.000 oöcyten toe aan het berijpte (gezandstraalde) deel van een glazen glijbaan. Verwijder alle lichaamsdelen en vreemde materialen met een tang. Laat oöcyten niet uitdrogen; voeg indien nodig 1x PBS toe.
2. Plaats een coverslip bovenop de oöcyten en "rol" voorzichtig oöcyten totdat alle membranen zijn verwijderd (het slepen van de rand van de coverslip over de oöcyten werkt het beste). Controleer regelmatig de voortgang onder de microscoop en voeg indien nodig meer 1x PBS toe. Wees voorzichtig, want te veel druk zal de oöcyten vernietigen.

Representative Results

Drug	Oplosmiddel	Voorraadconcentratie	Eindconcentratie	Tijdstip van de behandeling	Effect
colchicine	Ethanol	125 mM	150 μM	10 min of 30 min	destabiliseren niet-kinetochore (10 min) of alle (30 min) microtubuli
paclitaxel	Dmso	10 mM	10 μM	10 min	microtubuli stabiliseren
Binucleine	Dmso	25 mM	25 μM	20 min	remmen Aurora B kinase

Tabel 1: Medicamenteuze behandeling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various