Voorbereiding van vaste Drosophila-oöcyten voor immunostaining: een methode met hoge doorvoer om het buitenste membraan te repareren en te verwijderen
Published: April 30, 2023
Abstract
Bron: Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J.Vis. Exp. (2016).
Immunostaining van Drosophila late-stage oöcyten kan een uitdaging zijn vanwege de omliggende membranen van de oöcyten. Deze video beschrijft een methode met hoge doorvoer voor het verkrijgen van oöcyten, hun fixatie en het verwijderen van membranen voor immunostaining. Het aanbevolen protocol demonstreert deze technieken met laat stadium oöcyten die worden gebruikt om verschillende stadia van meiose te visualiseren.
Protocol
Dit protocol is overgenomen uit Radford en McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016). OPMERKING: Procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Temperatuurgecontroleerde incubators worden gebruikt om temperaturen voor vliegopfok en kruisen te handhaven, tenzij anders vermeld. 1. Voorbereidingen Bereid vlie…
Representative Results
Drug Oplosmiddel Voorraadconcentratie Eindconcentratie Tijdstip van de behandeling Effect colchicine Ethanol 125 mM 150 μM 10 min of 30 min destabiliseren niet-kinetochore (10 min)of alle (30 mi…
Materials
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| magnesium chloride | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
Cite This Article
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).