İmmünostaining için Sabit Drosophila Oositlerinin Hazırlanması: Dış Zarı Düzeltmek ve Çıkarmak için Yüksek Verimli Bir Yöntem

Overview

Drosophila geç evre oositlerin immünostaining oositler çevreleyen membranlar nedeniyle zor kanıtlayabilir. Bu videoda, oositler, fiksasyonları ve membranların immünostaining için çıkarılması için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, bu teknikleri meyozun farklı aşamalarını görselleştirmek için kullanılan geç evre oositlerle göstermektedir.

Protocol

Bu protokol Radford ve McKim, Sabit Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp'te I.Meiosis'i Görüntüleme Teknikleri ve Metafaz'dan alıntılanmıştır. (2016).

NOT: Aksi belirtilmedikçe prosedürler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Sıcaklık kontrollü inkübatörler, aksi belirtilmedikçe sinek yetiştirme ve haçlar için sıcaklıkları korumak için kullanılır.

1. Hazırlıklar

1. Sinekleri hazırlayın.
   1. Prometaphase ile zenginleştirilmiş oosit koleksiyonları.
      1. Sağlıklı, genç stoklardan veya çapraz kültürlerden yetişkin sinekleri temizleyin. 25 °C'de iki gün boyunca şişeleri yaşlayın.
         NOT: Genellikle, bazı çapraz kültürler için daha fazlasına ihtiyaç duyulabilecek olsa da, iki sağlıklı şişe yeterli olacaktır.
      2. İki gün sonra, şişelerden ~100 ila 300 dişi (bu noktada 0 ila 2 günlük olan) toplayın. Dişilerin bakire olmasına gerek yok. Bir şişenin yanına bir dab maya macunu ekleyin ve mayalı şişelerin içine her biri 30 dişi ve 10 ila 15 erkek yerleştirin. 25 °C'de iki gün boyunca yaş şişeleri.
   2. Metafaz ile zenginleştirilmiş Oosit Koleksiyonları.
      1. Stok veya çapraz kültürlerden ~ 100 ila 300 dişi toplayın. Bir şişenin yanına bir dab maya macunu ekleyin ve mayalı şişelere her biri 30 dişi (erkek eklenmeden) yerleştirin. 25 °C'de üç ila beş gün boyunca yaş şişeleri.
2. Çözümler Hazırlayın.
   NOT: Çözeltiler, aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir.
   1. Modifiye Robb Tamponu (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sakkaroz, 275 mM sodyum asetat, 200 mM potasyum asetat, 50 mM glikoz, 6 mM magnezyum klorür ve 5 mM kalsiyum klorür hazırlayın. pH'ı 7.4'e getirmek için 10 N 11:8 sodyum hidroksit:potasyum hidroksit kullanın. Filtrasyon ile sterilize edin; otomatik olarak çalıştırmayın. -20 °C'de saklayın. Oosit başına ~200 ml 1x Robb hazırlığı hazırlamak için gerektiği gibi çözün.
   2. Fiksasyon Çözümleri.
      1. Seçenek #1: Formaldehit/heptan fiksasyonu hazırlayın. Fiksasyon Tamponu Hazırlayın: 1x fosfat tamponlu salin (PBS) artı 150 mM sakkaroz. Kullanmak için, 687.5 μl Fiksasyon Tamponu ve 312.5 μl 16% formaldehit ile taze yapın.
         DİkKAT: Duman kaputunda formaldehit çözeltileri kullanırken eldiven giyin. Atıkları kurumsal yönergelere göre atın.
      2. Seçenek #2: Formaldehit/kakodylat fiksasyonunu hazırlayın. Düzeltme Karışımını Hazırlayın: 250 mM sakkaroz, 100 mM potasyum asetat (pH 7.5), 25 mM sodyum asetat (pH 7.0) ve 25 mM EGTA (pH 8.0). Kullanmak için, 400 μl Fix Mix, 100 μl potasyum kakadül (1 M, pH 7.2) ve 500 μl 16% formaldehit ile taze yapın.
         DİkKAT: Potasyum kaktüs Arsenik içerir.
   3. PBS/Triton X-100: 1x PBS artı %1 veya %0,05 Triton X-100 hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
   4. PBS-Tween 20-Bovine Serum Albümin (BSA) (PTB) hazırlayın: 1x PBS, %0,5 BSA (w/v) ve %0,1 Ara-20. Bir hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.

2. Geç Aşama Drosophila Oosytes Koleksiyonu

1. Membranları bozulmamış Drosophila oositleri plastik ve cama yapışacağından, PTB ile oosit hazırlığı başına bir 5 ml'lik tüpün ve bir Pasteur pipetin içini ön kaplama.
2. Tüm ~100 ila 300 mayalı sinekleri karbondioksitle uyuşturun ve ~100 ml 1x Robb Tamponu içeren bir karıştırıcıya ekleyin. Darbe üç kez (~1 sn her biri). Etkinleştirmeyi önlemek için Robb's'ta <20 dakika boyunca oositleri saklayın.
   NOT: Alternatif olarak, oositler dişilerden elle parçalanabilir. Bu yöntemin avantajı daha az kadın gerektirmektedir. Bununla birlikte, hipoksi ile ilişkili eserlerden kaçınmak için karbondioksite maruz kalmayı sadece birkaç dakika ile sınırlamaya özen edilmelidir.
3. Büyük gövde parçalarını çıkarmak için büyük ağdan (~1.500 μm) 250 ml'lik bir beher içine filtreleyin. Çok sayıda sağlam karın örgüde kalırsa, ek Robb Arabelleği kullanarak malzemeyi yeniden öğütün ve tekrar filtreleyin. ~2 dk yerleşmeye bırakın, ardından büyük gövde parçalarının mümkün olduğunca çoğunu çıkararak üst katmanı aspire edin.
4. Küçük ağ (~300 μm) boyunca 250 ml'lik bir behere filtreleyin. Kalan oositleri ek Robb ve kaplamalı Pasteur pipet kullanarak ilk beherden durulayın. ~3 dakika durulmasına izin verin; Oositler çözülecek. ~10 ml hariç hepsini aspire edin.
5. Kaplanmış 5 ml'lik tüpe sığacak kadar 10 ml dökün. Yerleşmeye bırakın, sıvıyı çıkarın ve kalanlarla tekrarlayın. Kalan oositleri ek Robb ve kaplamalı Pasteur pipet kullanarak beherden durulayın. ~3-5 dakika boyunca 5 ml'lik tüpe yerleşin.

3. İlaç Tedavileri (İsteğe Bağlı)

1. Her oosit hazırlığı için PTB ile ikinci bir 5 ml tüp kapla. Her oosit hazırlığı için her biri 1 ml Robb'a uygun çözücü (kontrol) veya ilaç ekleyin (Tablo 1).
2. Oositleri ikinci kaplamalı 5 ml tüpe bölün. Yerleşmeye bırakın, sıvıyı çıkarın ve bir tüpe 1 ml Robb artı çözücü ve ikinci tüpe 1 ml Robb artı ilaç ekleyin. İlaç tedavisi için uygun süre için nutate (Tablo 1). Sakin olalım.

4. Fiksasyon

1. Tüm sıvıyı epire edin ve hemen 1 ml Fix ekleyin.
2. Seçenek #1: Formaldehit/heptan fiksasyonu (Fiksasyon Tamponu artı%5 formaldehit).
   1. Bir fındık makinesinde 2,5 dakika düzeltin. 1 ml heptane ve girdap 1 dk ekleyin. Yerleşmeye izin verin ~1 dk.
   2. Tüm sıvıyı çıkarın ve ardından 1 ml 1x PBS ekleyin. Girdap 30 sn. Yerleşmeye izin verin ~1 dk.
   3. Tüm sıvıyı çıkarın ve ardından tüpü 1x PBS ile doldurun.
      NOT: Oositler hemen kullanılabilir veya oda sıcaklığında birkaç saat fındık makinesinde tutulabilir.
3. Seçenek #2: Formaldehit / kakodylat fiksasyonu (Fix Mix artı% 8 formaldehit ve 100 mM cacodylate).
   1. Bir besleyici üzerinde 6 dakika düzeltin. 2 dakika durulmasına izin verin. Sıvıyı çıkarın ve tüpü 1x PBS ile doldurun.
      NOT: Oositler hemen kullanılabilir veya oda sıcaklığında birkaç saat fındık makinesinde tutulabilir.

5. Membranların Çıkarılması ("Yuvarlanma")

1. Kaplamalı Pasteur pipet kullanarak, cam slaydın buzlu (kumlu) kısmına ~500 ila 1.000 oosit ekleyin. Tüm vücut parçalarını ve yabancı malzemeyi tokmaklar kullanarak çıkarın. Oositlerin kurumasına izin vermeyin; gerektiğinde 1x PBS ekleyin.
2. Oositlerin üzerine bir kapak ucu yerleştirin ve tüm zarlar çıkarılana kadar oositleri hafifçe "yuvarlayın" (örtünün kenarını oositler boyunca sürüklemek en iyi sonucu verir). Mikroskop altında ilerlemeyi periyodik olarak kontrol edin ve gerektiğinde daha fazla 1x PBS ekleyin. Çok fazla basınç oositleri yok edeceğine dikkat edin.

Representative Results

Uyuşturucu	Solvent	Stok konsantrasyonu	Son konsantrasyon	Tedavi zamanı	Etkisi
kolşicine	Etanol	125 mM	150 μM	10 dk veya 30 dk	kinetochore olmayan istikrarı boz (10 dk) veya tüm (30 dk) mikrotübüller
paclitaxel	DMSO	10 mM	10 μM	10 dk	mikrotübülleri stabilize etmek
Binüklein 2	DMSO	25mm	25 μM	20 dk	Aurora B kinazı inhibe

Tablo 1: İlaç tedavisi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various