免疫染色のための固定 ショウジョウバエ の調製:外膜を固定・除去する高スループット法

Overview

ショウジョウバエ後期卵母細胞の免疫染色は、卵母細胞の周囲の膜のために困難であることが証明できる。このビデオでは、卵母細胞、それらの固定、および免疫染色のための膜の除去を得るためのハイスループット方法について説明します。注目のプロトコルは、異なる段階のmeiosisを視覚化するために使用される後期卵母細胞を用いてこれらの技術を示す。

Protocol

このプロトコルは、ラドフォードとマッキムから抜粋されています, イメージング前形相と Meiosis Iのメタフェーズのための技術は、固定ショウジョウバエオオサイテスで, J. Vis. Exp.(2016).

注: 手順は、特に明記されていない限り、室温で行われます。温度管理インキュベーターは、特に断らない限り、フライの飼育と交差のための温度を維持するために使用されます。

1. 準備

1. ハエを準備します。
   1. プロメタフェーズエンリッチ化卵母細胞コレクション。
      1. 健康で若いストックやクロスカルチャーから明確な大人のハエ。25°Cで2日間ボトルを飼育。
         注: 一般的に、2つの健康なボトルで十分ですが、いくつかのクロスカルチャーのためにもっと必要な場合があります。
      2. 2日後、ボトルから100~300名(この時点で生後0~2日)を回収します。女性は処女である必要はありません。バイアルの側面に酵母ペーストのダブを追加し、酵母バイアルにそれぞれ30メスと10〜15人の男性を置きます。バイアルを25°Cで2日間年齢を重る。
   2. メタフェーズエンリッチ化された卵細胞コレクション。
      1. ストックまたはクロスカルチャーから〜100〜300人の女性を収集します。バイアルの側面に酵母ペーストのダブを追加し、酵母バイアルにそれぞれ30匹の女性(男性を加えなし)を入れる。バイアルを25°Cで3~5日間年齢を重ります。
2. ソリューションを準備します。
   注: 特に断らない限り、溶液は室温で無期限に保存されてもよい。
   1. 改良されたロブのバッファーを準備する(5x):500 mM HEPES、500 mMスクロース、275 mM酢酸ナトリウム、200 mM酢酸カリウム、50 mMグルコース、6 mM塩化マグネシウム、および5 mM塩化カルシウム。10 N 11:8 水酸化ナトリウム:水酸化カリウムを使用してpHを7.4に持ち込む。ろ過によって殺菌;オートクレーブをしないでください。-20°Cで保管してください。 必要に応じて解凍して、卵母細胞の準備あたり1x Robbの約200mlを準備します。
   2. 固定ソリューション。
      1. オプション#1:ホルムアルデヒド/ヘプタン固定を準備します。固定バッファーを準備する:1xリン酸緩衝生理食塩分(PBS)プラス150 mMスクロース。使用するには、687.5 μl固定バッファーと312.5 μl 16%ホルムアルデヒド1個当たりの卵母細胞準備で新鮮にしてください。
         注意: ヒュームフードにホルムアルデヒド溶液を使用しながら手袋を着用してください。制度上のガイドラインに従って廃棄物を処分する。
      2. オプション#2:ホルムアルデヒド/カコジレート固定を準備します。準備の修正ミックス:250 mMスクロース、100 mM酢酸カリウム(pH 7.5)、25 mM酢酸ナトリウム(pH 7.0)、および25 mM EGTA(pH 8.0)。使用するには、400 μlのフィックスミックス、100 μlのカコジレートカリウム(1 M,pH 7.2)、500 μl 16%ホルムアルデヒド(卵母細胞準備)で新鮮にしてください。
         注意: カコチル酸カリウムはヒ素を含む。
   3. PBS/トリトンX-100を準備する:1x PBSプラス1%または0.05%トリトンX-100。4 °Cで保管。
   4. PBS-Tween 20-ウシ血清アルブミン(BSA)(PTB):1x PBS、0.5%BSA(w/v)、および0.1%トゥイーン-20を準備します。4°Cで1週間保存することがあります。

2. 後期 ショウジョウバエオ サイテスのコレクション

1. 膜をそのまま持つ ショウジョウバエ の卵母細胞がプラスチックとガラスに貼り付けられるので、PTBで1つの5mlチューブと1つのパスツールピペットを卵母細胞の準備ごとに事前にコーティングします。
2. すべての〜100〜300酵母ハエを二酸化炭素で麻酔し、〜100 ml 1x Robb'sバッファーを含むブレンダーに追加します。パルス3回(各1秒〜1秒)。アクティベーションを避けるために、<20分間、ロブの卵母細胞に保管してください。
   注: あるいは、卵母細胞は女性から手で解剖されてもよい。この方法の利点は、それが少ない女性を必要とすることです.しかし、低酸素症に関連する人工物を避けるために、二酸化炭素への暴露をわずか数分に制限するよう注意する必要があります。
3. 大きなメッシュ(約1,500 μm)を通して250 mlビーカーにフィルターを入れ、大きなボディパーツを除去します。メッシュ上に多くの無傷の腹部が残っている場合は、追加の Robb's Buffer を使用して材料を再研磨し、再度フィルターします。~2分落ち着いてから、上層から吸い出し、できるだけ多くの大きな身体部分を取り除きます。
4. 小さなメッシュ(約300 μm)を通して250 mlビーカーにフィルターします。追加のロブを使用して最初のビーカーから残る卵母細胞をすすいで、パスツールピペットをコーティングしました。〜3分を落ち着かせてください。卵母細胞は落ち着くでしょう。10mlを除くすべての吸引。
5. コーティングされた5mlチューブに収まる限り10mlの多くを注ぎます。落ち着いて、液体を取り除き、残りの部分で繰り返しましょう。追加のロブとコーティングパスツールピペットを使用してビーカーから残る卵母細胞をすすい。5 ml チューブに約 3~5 分間落ち着かせましょう。

3. 薬物治療(オプション)

1. 卵母細胞の準備ごとに2番目の5mlチューブにPTBをコーティングします。適切な溶媒(制御)または薬剤を各卵母細胞準備ごとにそれぞれ1ml Robbに加える(表1)。
2. 卵母細胞を第2のコーティングされた5ml管に分割する。沈め、液体を取り除き、1mlのロブのプラス溶媒を1本のチューブに加え、1mlのロブのプラスドラッグを2番目のチューブに加えます。薬物治療のための適切な時間のためのヌテート(表1)。落ち着きましょう。

4. 固定

1. すべての液体を吸引し、すぐに1 mlの修正を加えます。
2. オプション#1:ホルムアルデヒド/ヘプタン固定(固定バッファープラス5%ホルムアルデヒド)。
   1. ヌテタで2.5分固定します。1 mlのヘプタンと渦を1分加えます。~1分落ち着きましょう。
   2. すべての液体を取り出し、1ml 1x PBSを加えます。渦30秒。~1分落ち着きましょう。
   3. すべての液体を取り出し、チューブを1x PBSで満たします。
      注: 卵母細胞は、すぐに使用するか、または室温で数時間ヌテレーターに保管してもよい。
3. オプション#2:ホルムアルデヒド/カコジレート固定(フィックスミックスプラス8%ホルムアルデヒドおよび100 mMカコジレート)。
   1. ヌテタで6分間固定します。2分落ち着きましょう。液体を取り除き、チューブを1x PBSで満たします。
      注: 卵母細胞は、すぐに使用するか、または室温で数時間ヌテレーターに保管してもよい。

5. 膜の除去(「ローリング」)

1. コーティングされたパスツールピペットを使用して、ガラススライドの曇り(砂吹き)部分に〜500〜1,000の卵母細胞を追加します。鉗子を使用して、すべてのボディパーツと無関係な材料を除去します。卵母細胞を乾燥させないでください。必要に応じて 1x PBS を追加します。
2. 卵母細胞の上にカバースリップを置き、すべての膜が取り除かれるまで卵母細胞をそっと「ロール」します(卵母細胞を横切ってカバースリップの端をドラッグするのが最も効果的です)。顕微鏡下で定期的に進捗状況を確認し、必要に応じてさらに1倍のPBSを追加します。あまりにも多くの圧力が卵母細胞を破壊するので注意してください。

Representative Results

薬	溶媒	在庫集中	最終濃度	治療時間	影響
コルヒチン	エタノール	125 mM	150 μM	10分または30分	非キネトコレを不安定化させる(10分) またはすべて(30分)微小管
パクリタキセル	DMSO	10mM	10 μM	10分	微小管を安定させる
二核球2	DMSO	25mM	25 μM	20分	オーロラBキナーゼを阻害する

表1:薬物治療。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various