Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Forberedelse af faste Drosophila Oocytes til immunostaining: En high-throughput metode til at fastgøre og fjerne den ydre membran

Overview

Immunostaining af Drosophila sene stadie oocytter kan vise sig udfordrende på grund af oocytternes omgivende membraner. Denne video beskriver en high-throughput metode til at opnå oocytter, deres fiksering, og membraner 'fjernelse for immunostaining. Den fremhævede protokol demonstrerer disse teknikker med sene oocytter, der bruges til at visualisere forskellige stadier af meiose.

Protocol

Denne protokol er uddrag fra Radford og McKim, Teknikker til Imaging Prometaphase og Metaphase af Meiosis I i Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

BEMÆRK: Procedurer udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Temperaturstyrede inkubatorer bruges til at opretholde temperaturer til flueopdræt og kryds, medmindre andet er angivet.

1. Præparater

  1. Forbered fluer.
    1. Prometaphase-berigede oocytsamlinger.
      1. Ryd voksne fluer fra sunde, unge bestand eller tværs kulturer. Aldersflasker i to dage ved 25 °C.
        BEMÆRK: Generelt vil to sunde flasker være tilstrækkeligt, selv om der kan være behov for mere for nogle krydskulturer.
      2. Efter to dage skal du samle ~ 100 til 300 kvinder (som er 0 til 2 dage gamle på dette tidspunkt) fra flaskerne. Hunnerne behøver ikke at være jomfruer. Tilsæt en dab af gær pasta til siden af et hætteglas og sted 30 kvinder og 10 til 15 mænd hver i gærede hætteglas. Aldersglas i to dage ved 25 °C.
    2. Metafaseberigede Oocyte-samlinger.
      1. Saml ~ 100 til 300 kvinder fra lager eller på tværs af kulturer. Tilsæt en dab af gær pasta til siden af et hætteglas og sted 30 kvinder hver (uden mænd tilføjet) i gærede hætteglas. Aldersglas i tre til fem dage ved 25 °C.
  2. Forbered løsninger.
    BEMÆRK: Opløsninger kan opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
    1. Forbered Modified Robb's Buffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM saccharose, 275 mM natriumacetat, 200 mM kaliumacetat, 50 mM glukose, 6 mM magnesiumchlorid og 5 mM calciumchlorid. Brug 10 N 11:8 natriumhydroxid:kaliumhydroxid for at bringe pH til 7,4. Steriliseres ved filtrering; må ikke autoklavere. Opbevares ved -20 °C. Tø efter behov for at forberede ~ 200 ml af 1x Robb's per oocyte prep.
    2. Fikseringsløsninger.
      1. Mulighed #1: Forbered formaldehyd / heptane fiksering. Forbered fikseringsbuffer: 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) plus 150 mM saccharose. Til brug skal du lave frisk med 687,5 μl fikseringsbuffer og 312,5 μl 16% formaldehyd pr. oocytforberedelse.
        ADVARSEL: Brug handsker, mens du bruger formaldehydopløsninger i en røghætte. Affald bortskaffes i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer.
      2. Mulighed #2: Forbered formaldehyd/cacodylatfiksering. Forbered Fix Mix: 250 mM saccharose, 100 mM kaliumacetat (pH 7,5), 25 mM natriumacetat (pH 7,0) og 25 mM EGTA (pH 8,0). Til brug skal du lave frisk med 400 μl Fix Mix, 100 μl kaliumkakodilat (1 M, pH 7,2) og 500 μl 16% formaldehyd pr. oocytforberedelse.
        ADVARSEL: Kaliumkakodilat indeholder arsen.
    3. Forbered PBS/Triton X-100: 1x PBS plus 1% eller 0,05% Triton X-100. Opbevares ved 4 °C.
    4. Forbered PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) og 0,1% Tween-20. Kan opbevares ved 4 °C i en uge.

2. Indsamling af late-stage Drosophila Oocytes

  1. Som Drosophila oocytes med membraner intakt vil holde sig til plast og glas, pre-coat indersiden af en 5 ml rør og en Pasteur pipet per oocyte prep med PTB.
  2. Bedøve alle ~ 100 til 300 gæret fluer med kuldioxid og tilføje til en blender, der indeholder ~ 100 ml 1x Robb's Buffer. Puls tre gange (~1 sek hver). Hold oocytes i Robb's for <20 min for at undgå aktivering.
    BEMÆRK: Alternativt kan oocytter være hånd-dissekeret fra kvinder. Fordelen ved denne metode er, at det kræver mindre kvinder. Der skal dog sørges for at begrænse eksponeringen for kuldioxid til kun et par minutter for at undgå artefakter forbundet med hypoxi.
  3. Filter gennem store net (~1.500 μm) i 250 ml bægerglas for at fjerne store kropsdele. Hvis mange intakte maver forbliver på mesh, re-male materiale ved hjælp af yderligere Robb's Buffer, og filtrere igen. Lad afregne ~ 2 min, så indsug off øverste lag, fjerne så mange af de store kropsdele som muligt.
  4. Filtreres gennem småmasker (~300 μm) i et 250 ml bægerglas. Skyl resterende oocytter ud af første bægerglas ved hjælp af yderligere Robb's og belagt Pasteur pipet. Lad afregne ~ 3 min; Oocytes vil slå sig ned. Aspirat off alle, men ~ 10 ml.
  5. Hæld så meget af de 10 ml, som vil passe ind i belagt 5 ml rør. Lad afregne, fjern væske, og gentag med resten. Skyl resterende oocytter ud af bægerglas ved hjælp af yderligere Robb's og belagt Pasteur pipet. Lad bosætte sig i 5 ml rør i ~ 3-5 min.

3. Medicinske behandlinger (valgfrit)

  1. Coat en anden 5 ml rør med PTB for hver oocyt prep. Der tilsættes passende opløsningsmiddel (kontrol) eller lægemiddel til 1 ml Robb's hver for hver oocytforberedelse (tabel 1).
  2. Split oocytter i andet belagt 5 ml rør. Lad afregne, fjerne væske, og tilsæt 1 ml Robb's plus opløsningsmiddel i et rør og 1 ml Robb's plus stof i andet rør. Nutate for passende tid til narkotikabehandling(tabel 1). Lad os slå os ned.

4. Fiksering

  1. Aspirat af al væske og tilsæt straks 1 ml Fix.
  2. Mulighed #1: Formaldehyd/heptane fiksering (fikseringsbuffer plus 5% formaldehyd).
    1. Fix for 2,5 min på en nutator. Der tilsættes 1 ml heptane og vortex 1 min. Lad afregne ~ 1 min.
    2. Fjern al væske, og tilsæt derefter 1 ml 1x PBS. Hvirvel 30 sek. Lad afregne ~ 1 min.
    3. Fjern al væske, og fyld derefter røret med 1x PBS.
      BEMÆRK: Oocytter kan anvendes med det samme eller opbevares på tælleren i flere timer ved stuetemperatur.
  3. Mulighed #2: Formaldehyd/cacodylatfiksering (Fix Mix plus 8% formaldehyd og 100 mM cacodylat).
    1. Fix i 6 min på en nutator. Lad afregne 2 min. Fjern væske, og fyld derefter røret med 1x PBS.
      BEMÆRK: Oocytter kan anvendes med det samme eller opbevares på tælleren i flere timer ved stuetemperatur.

5. Fjernelse af membraner ("Rullende")

  1. Brug belagt Pasteur pipet, tilføje ~ 500 til 1.000 oocytter til den matterede (sand-sprængt) del af et glas dias. Fjern alle kropsdele og fremmed materiale ved hjælp af pincet. Lad ikke oocytter tørre ud; tilføje 1x PBS efter behov.
  2. Placer en coverslip på toppen af oocytter og forsigtigt "roll" oocytter, indtil alle membraner er fjernet (trække kanten af coverlip på tværs af oocytter fungerer bedst). Kontroller regelmæssigt fremskridt under mikroskopet, og tilsæt mere 1x PBS efter behov. Pas på, da for meget pres vil ødelægge oocytterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stof Opløsningsmiddel Koncentration af bestanden Endelig koncentration Tidspunkt for behandlingen Effekt
Colchicin Ethanol 125 mM 150 μM 10 min. eller 30 min. destabilisere ikke-kinetochore (10 min)
eller alle (30 min) mikrotubuli
paclitaxel Dmso 10 mM 10 μM 10 min. stabilisere mikrotubuli
Binucleine 2 Dmso 25 mM 25 μM 20 min. hæmmer Aurora B kinase

Tabel 1: Narkotikabehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers Various
5 ml tubes Various
active dry yeast Various mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2 Sigma B1186 HAZARDOUS
blender Various
bovine serum albumin Sigma A4161
calcium chloride Various
colchicine Sigma C-9754 HAZARDOUS
coverslips VWR 48366-227 No. 1 1/2
DMSO Various
EGTA Various
ethanol Various
forceps Ted Pella, Inc. 5622 Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides VWR 48312-003
glucose Various
HEPES VWR EM-5330 available from several venders
magnesium chloride Various
large mesh (~1,500 µm) VWR AA43657-NK variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm) Spectrum labs 146 424 variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator Various
Pasteur pipets Various
potassium acetate Various
Cacodylic acid Sigma C0125 HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide Various
sodium acetate Various
sodium hydroxide Various
sucrose Various
taxol (paclitaxel) Sigma T1912 HAZARDOUS
Triton X-100 Fisher PI-28314
Tween 20 Fisher PI-28320
vortex Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Tom værdi Problem
Forberedelse af faste <em>Drosophila</em> Oocytes til immunostaining: En high-throughput metode til at fastgøre og fjerne den ydre membran
Play Video
DOWNLOAD MATERIALS LIST
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter