Forberedelse af faste Drosophila Oocytes til immunostaining: En high-throughput metode til at fastgøre og fjerne den ydre membran
Published: April 30, 2023
Abstract
Kilde: Radford, SJ, McKim, KS Teknikker til Imaging Prometaphase og Metaphase af Meiosis I i Fixed Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (2016).
Immunostaining af Drosophila sene stadie oocytter kan vise sig udfordrende på grund af oocytternes omgivende membraner. Denne video beskriver en high-throughput metode til at opnå oocytter, deres fiksering, og membraner ‘fjernelse for immunostaining. Den fremhævede protokol demonstrerer disse teknikker med sene oocytter, der bruges til at visualisere forskellige stadier af meiose.
Protocol
Denne protokol er uddrag fra Radford og McKim, Teknikker til Imaging Prometaphase og Metaphase af Meiosis I i Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016). BEMÆRK: Procedurer udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Temperaturstyrede inkubatorer bruges til at opretholde temperaturer til flueopdræt og kryds, medmindre andet er angivet. 1. Præparater Forbered fluer. Prometaphase-ber…
Representative Results
Stof Opløsningsmiddel Koncentration af bestanden Endelig koncentration Tidspunkt for behandlingen Effekt Colchicin Ethanol 125 mM 150 μM 10 min. eller 30 min. destabilisere ikke-kinetochore (10 min…
Materials
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| magnesium chloride | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
Cite This Article
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).