Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Forberedelse av faste Drosophila Oocytes for immunostaining: En høy gjennomstrømningsmetode for å fikse og fjerne den ytre membranen

Overview

Immunostaining av Drosophila senfase oocytter kan vise seg utfordrende på grunn av oocyttene rundt membraner. Denne videoen beskriver en metode for høy gjennomstrømning for å oppnå oocytter, fiksering og membraners fjerning for immunstaining. Den omtalte protokollen demonstrerer disse teknikkene med senfase oocytter som brukes til å visualisere ulike stadier av meiosis.

Protocol

Denne protokollen er hentet fra Radford og McKim, Teknikker for imaging Prometaphase og Metafase av Meiosis I i Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

MERK: Prosedyrer utføres ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Temperaturkontrollerte inkubatorer brukes til å opprettholde temperaturer for flueoppdrett og kryss med mindre annet er angitt.

1. Forberedelser

  1. Forbered fluer.
    1. Prometaphase-beriket oocytt samlinger.
      1. Klar voksen flyr fra sunn, ung bestand eller krysskulturer. Aldersflasker i to dager ved 25 °C.
        MERK: Generelt vil to sunne flasker være tilstrekkelig, selv om det kan være behov for mer for noen krysskulturer.
      2. Etter to dager, samle ~ 100 til 300 kvinner (som er 0 til 2 dager gamle på dette tidspunktet) fra flaskene. Hunnene trenger ikke å være jomfruer. Tilsett en dab gjærpasta på siden av et hetteglass og legg 30 kvinner og 10 til 15 menn hver i gjærede hetteglass. Alder hetteglass i to dager ved 25 °C.
    2. Metafaseberikede Oocyte-samlinger.
      1. Samle ~ 100 til 300 kvinner fra lager eller krysskulturer. Tilsett en dab gjærpasta på siden av et hetteglass og legg 30 kvinner hver (uten menn tilsatt) i gjærede hetteglass. Hetteglass i alderen tre til fem dager ved 25 °C.
  2. Forbered løsninger.
    MERK: Løsninger kan lagres på ubestemt tid ved romtemperatur, med mindre annet er angitt.
    1. Forbered modifisert robbs buffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sukrose, 275 mM natriumacetat, 200 mM kaliumacetat, 50 mM glukose, 6 mM magnesiumklorid og 5 mM kalsiumklorid. Bruk 10 N 11:8 natriumhydroksid:kaliumhydroksid for å bringe pH til 7,4. Steriliser ved filtrering; ikke autoklaver. Oppbevars ved -20 °C. Tine etter behov for å forberede ~ 200 ml 1x Robbs per oocyttforberedelse.
    2. Løsningsløsninger for fiksering.
      1. Alternativ #1: Forbered formaldehyd/heptanfiksering. Klargjør fikseringsbuffer: 1x fosfatbufret saltvann (PBS) pluss 150 mM sukrose. For bruk, gjør frisk med 687.5 μl Fiksering Buffer og 312.5 μl 16% formaldehyd per oocytt prep.
        FORSIKTIG: Bruk hansker mens du bruker formaldehydløsninger i en avtrekkshette. Avfall skal avhendes i henhold til institusjonelle retningslinjer.
      2. Alternativ #2: Forbered formaldehyd/kaktocylatfiksering. Klargjør fix mix: 250 mM sukrose, 100 mM kaliumacetat (pH 7,5), 25 mM natriumacetat (pH 7,0) og 25 mM EGTA (pH 8,0). For å bruke, gjør frisk med 400 μl Fix Mix, 100 μl kaliumkakroktylat (1 M, pH 7,2) og 500 μl 16% formaldehyd per oocyttforberedelse.
        FORSIKTIG: Kaliumkakroktylat inneholder arsen.
    3. Forbered PBS/Triton X-100: 1x PBS pluss 1 % eller 0,05 % Triton X-100. Oppbevars ved 4 °C.
    4. Forbered PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) og 0,1% Tween-20. Kan oppbevares ved 4 °C i én uke.

2. Innsamling av sen-stage Drosophila Oocytes

  1. Som Drosophila oocytter med membraner intakt vil holde seg til plast og glass, pre-coat innsiden av en 5 ml rør og en Pasteur pipet per oocytt prep med PTB.
  2. Bedøv alle ~ 100 til 300 gjærede fluer med karbondioksid og legg til en blender som inneholder ~ 100 ml 1x Robb's Buffer. Puls tre ganger (~1 sek hver). Hold oocytter i Robb's i <20 min for å unngå aktivering.
    MERK: Alternativt kan oocytter bli hånd dissekert fra kvinner. Fordelen med denne metoden er at den krever færre kvinner. Det må imidlertid utvises forsiktighet for å begrense eksponeringen for karbondioksid til bare noen få minutter for å unngå artefakter forbundet med hypoksi.
  3. Filtrer gjennom stort nett (~ 1500 μm) i 250 ml beger for å fjerne store kroppsdeler. Hvis mange intakte underliv forblir på nettet, slip materiale på nytt ved hjelp av ekstra Robb's Buffer, og filtrer igjen. La bosette ~ 2 min, deretter aspirere av topplaget, fjerne så mange av de store kroppsdelene som mulig.
  4. Filtrer gjennom små netting (~300 μm) i et 250 ml beger. Skyll de resterende oocyttene ut av det første begeret med ekstra Robb's og belagt Pasteur pipet. La bosette ~ 3 min; oocytter vil slå seg til ro. Aspirer av alle unntatt ~ 10 ml.
  5. Hell så mye av 10 ml som passer inn i belagt 5 ml rør. La bosette, fjerne væske og gjenta med resten. Skyll de resterende oocyttene ut av begeret med ekstra Robb's og belagt Pasteur pipet. La bosette seg i 5 ml rør i ~ 3-5 min.

3. Narkotikabehandlinger (valgfritt)

  1. Belegge et ekstra 5 ml rør med PTB for hver oocyttforberedelse. Tilsett passende løsningsmiddel (kontroll) eller legemiddel til 1 ml Robb's hver for hver oocyttforberedelse (Tabell 1).
  2. Del oocytter i andre belagt 5 ml rør. La bosette, fjerne væske, og tilsett 1 ml Robbs pluss løsningsmiddel i ett rør og 1 ml Robbs pluss stoff i andre rør. Næringsat for passende tid til legemiddelbehandling (Tabell 1). La oss slå oss til ro.

4. Fiksering

  1. Aspirer av all væske og tilsett umiddelbart 1 ml Fix.
  2. Alternativ #1: Formaldehyd /heptane fiksering (Fikseringsbuffer pluss 5% formaldehyd).
    1. Fest i 2,5 min på en mutter. Tilsett 1 ml heptan og virvel 1 min. La bosette ~ 1 min.
    2. Fjern all væske, og tilsett deretter 1 ml 1x PBS. Virvel 30 sek. La bosette ~ 1 min.
    3. Fjern all væske, og fyll deretter røret med 1x PBS.
      MERK: Oocytter kan brukes umiddelbart eller oppbevart på mutteren i flere timer ved romtemperatur.
  3. Alternativ #2: Formaldehyd/kaktolylatfiksering (Fix Mix pluss 8% formaldehyd og 100 mM kaktocylat).
    1. Fest i 6 min på en mutter. La bosette seg 2 min. Fjern væsken, og fyll deretter røret med 1x PBS.
      MERK: Oocytter kan brukes umiddelbart eller oppbevart på mutteren i flere timer ved romtemperatur.

5. Fjerne membraner ("Rulle")

  1. Bruk belagt Pasteur pipet, tilsett ~ 500 til 1000 oocytter til den frostede (sandblåsede) delen av en glasssklie. Fjern alle kroppsdeler og fremmed materiale ved hjelp av tang. Ikke la oocytter tørke ut; tilsett 1x PBS etter behov.
  2. Plasser en deksler på toppen av oocyttene og rull forsiktig oocytter til alle membraner er fjernet (dra kanten av dekslene over oocyttene fungerer best). Kontroller regelmessig fremdriften under mikroskopet, og legg til mer 1x PBS etter behov. Pass på at for mye press vil ødelegge oocyttene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stoffet Løsemiddel Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon Tidspunkt for behandling Effekt
kolchicin Etanol 125 mM 150 μM 10 min eller 30 min destabilisere ikke-kinetochore (10 min)
eller alle (30 min) mikrotubuler
paclitaksel Dmso 10 mM 10 μM 10 min stabilisere mikrotubuler
Binuklein 2 Dmso 25 mM 25 μM 20 min hemme Aurora B kinase

Tabell 1: Legemiddelbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers Various
5 ml tubes Various
active dry yeast Various mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2 Sigma B1186 HAZARDOUS
blender Various
bovine serum albumin Sigma A4161
calcium chloride Various
colchicine Sigma C-9754 HAZARDOUS
coverslips VWR 48366-227 No. 1 1/2
DMSO Various
EGTA Various
ethanol Various
forceps Ted Pella, Inc. 5622 Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides VWR 48312-003
glucose Various
HEPES VWR EM-5330 available from several venders
magnesium chloride Various
large mesh (~1,500 µm) VWR AA43657-NK variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm) Spectrum labs 146 424 variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator Various
Pasteur pipets Various
potassium acetate Various
Cacodylic acid Sigma C0125 HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide Various
sodium acetate Various
sodium hydroxide Various
sucrose Various
taxol (paclitaxel) Sigma T1912 HAZARDOUS
Triton X-100 Fisher PI-28314
Tween 20 Fisher PI-28320
vortex Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Tom verdi Problem
Forberedelse av faste <em>Drosophila</em> Oocytes for immunostaining: En høy gjennomstrømningsmetode for å fikse og fjerne den ytre membranen
Play Video
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Kilde: Radford, S. J., McKim, K. S. Teknikker for imaging Prometaphase og Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J. Vis. Utt. (2016).

View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter