Forberedelse av faste Drosophila Oocytes for immunostaining: En høy gjennomstrømningsmetode for å fikse og fjerne den ytre membranen
Published: April 30, 2023
Abstract
Kilde: Radford, S. J., McKim, K. S. Teknikker for imaging Prometaphase og Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J. Vis. Utt. (2016).
Immunostaining av Drosophila senfase oocytter kan vise seg utfordrende på grunn av oocyttene rundt membraner. Denne videoen beskriver en metode for høy gjennomstrømning for å oppnå oocytter, fiksering og membraners fjerning for immunstaining. Den omtalte protokollen demonstrerer disse teknikkene med senfase oocytter som brukes til å visualisere ulike stadier av meiosis.
Protocol
Denne protokollen er hentet fra Radford og McKim, Teknikker for imaging Prometaphase og Metafase av Meiosis I i Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016). MERK: Prosedyrer utføres ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Temperaturkontrollerte inkubatorer brukes til å opprettholde temperaturer for flueoppdrett og kryss med mindre annet er angitt. 1. Forberedelser Forbered fluer. Prometapha…
Representative Results
Stoffet Løsemiddel Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon Tidspunkt for behandling Effekt kolchicin Etanol 125 mM 150 μM 10 min eller 30 min destabilisere ikke-kinetochore (10 min)eller alle …
Materials
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| magnesium chloride | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
Cite This Article
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).