Denne protokollen er hentet fra Radford og McKim, Teknikker for imaging Prometaphase og Metafase av Meiosis I i Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).
MERK: Prosedyrer utføres ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Temperaturkontrollerte inkubatorer brukes til å opprettholde temperaturer for flueoppdrett og kryss med mindre annet er angitt.
1. Forberedelser
- Forbered fluer.
- Prometaphase-beriket oocytt samlinger.
- Klar voksen flyr fra sunn, ung bestand eller krysskulturer. Aldersflasker i to dager ved 25 °C.
MERK: Generelt vil to sunne flasker være tilstrekkelig, selv om det kan være behov for mer for noen krysskulturer.
- Etter to dager, samle ~ 100 til 300 kvinner (som er 0 til 2 dager gamle på dette tidspunktet) fra flaskene. Hunnene trenger ikke å være jomfruer. Tilsett en dab gjærpasta på siden av et hetteglass og legg 30 kvinner og 10 til 15 menn hver i gjærede hetteglass. Alder hetteglass i to dager ved 25 °C.
- Metafaseberikede Oocyte-samlinger.
- Samle ~ 100 til 300 kvinner fra lager eller krysskulturer. Tilsett en dab gjærpasta på siden av et hetteglass og legg 30 kvinner hver (uten menn tilsatt) i gjærede hetteglass. Hetteglass i alderen tre til fem dager ved 25 °C.
- Forbered løsninger.
MERK: Løsninger kan lagres på ubestemt tid ved romtemperatur, med mindre annet er angitt.
- Forbered modifisert robbs buffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sukrose, 275 mM natriumacetat, 200 mM kaliumacetat, 50 mM glukose, 6 mM magnesiumklorid og 5 mM kalsiumklorid. Bruk 10 N 11:8 natriumhydroksid:kaliumhydroksid for å bringe pH til 7,4. Steriliser ved filtrering; ikke autoklaver. Oppbevars ved -20 °C. Tine etter behov for å forberede ~ 200 ml 1x Robbs per oocyttforberedelse.
- Løsningsløsninger for fiksering.
- Alternativ #1: Forbered formaldehyd/heptanfiksering. Klargjør fikseringsbuffer: 1x fosfatbufret saltvann (PBS) pluss 150 mM sukrose. For bruk, gjør frisk med 687.5 μl Fiksering Buffer og 312.5 μl 16% formaldehyd per oocytt prep.
FORSIKTIG: Bruk hansker mens du bruker formaldehydløsninger i en avtrekkshette. Avfall skal avhendes i henhold til institusjonelle retningslinjer.
- Alternativ #2: Forbered formaldehyd/kaktocylatfiksering. Klargjør fix mix: 250 mM sukrose, 100 mM kaliumacetat (pH 7,5), 25 mM natriumacetat (pH 7,0) og 25 mM EGTA (pH 8,0). For å bruke, gjør frisk med 400 μl Fix Mix, 100 μl kaliumkakroktylat (1 M, pH 7,2) og 500 μl 16% formaldehyd per oocyttforberedelse.
FORSIKTIG: Kaliumkakroktylat inneholder arsen.
- Forbered PBS/Triton X-100: 1x PBS pluss 1 % eller 0,05 % Triton X-100. Oppbevars ved 4 °C.
- Forbered PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) og 0,1% Tween-20. Kan oppbevares ved 4 °C i én uke.
2. Innsamling av sen-stage Drosophila Oocytes
- Som Drosophila oocytter med membraner intakt vil holde seg til plast og glass, pre-coat innsiden av en 5 ml rør og en Pasteur pipet per oocytt prep med PTB.
- Bedøv alle ~ 100 til 300 gjærede fluer med karbondioksid og legg til en blender som inneholder ~ 100 ml 1x Robb's Buffer. Puls tre ganger (~1 sek hver). Hold oocytter i Robb's i <20 min for å unngå aktivering.
MERK: Alternativt kan oocytter bli hånd dissekert fra kvinner. Fordelen med denne metoden er at den krever færre kvinner. Det må imidlertid utvises forsiktighet for å begrense eksponeringen for karbondioksid til bare noen få minutter for å unngå artefakter forbundet med hypoksi.
- Filtrer gjennom stort nett (~ 1500 μm) i 250 ml beger for å fjerne store kroppsdeler. Hvis mange intakte underliv forblir på nettet, slip materiale på nytt ved hjelp av ekstra Robb's Buffer, og filtrer igjen. La bosette ~ 2 min, deretter aspirere av topplaget, fjerne så mange av de store kroppsdelene som mulig.
- Filtrer gjennom små netting (~300 μm) i et 250 ml beger. Skyll de resterende oocyttene ut av det første begeret med ekstra Robb's og belagt Pasteur pipet. La bosette ~ 3 min; oocytter vil slå seg til ro. Aspirer av alle unntatt ~ 10 ml.
- Hell så mye av 10 ml som passer inn i belagt 5 ml rør. La bosette, fjerne væske og gjenta med resten. Skyll de resterende oocyttene ut av begeret med ekstra Robb's og belagt Pasteur pipet. La bosette seg i 5 ml rør i ~ 3-5 min.
3. Narkotikabehandlinger (valgfritt)
- Belegge et ekstra 5 ml rør med PTB for hver oocyttforberedelse. Tilsett passende løsningsmiddel (kontroll) eller legemiddel til 1 ml Robb's hver for hver oocyttforberedelse (Tabell 1).
- Del oocytter i andre belagt 5 ml rør. La bosette, fjerne væske, og tilsett 1 ml Robbs pluss løsningsmiddel i ett rør og 1 ml Robbs pluss stoff i andre rør. Næringsat for passende tid til legemiddelbehandling (Tabell 1). La oss slå oss til ro.
4. Fiksering
- Aspirer av all væske og tilsett umiddelbart 1 ml Fix.
- Alternativ #1: Formaldehyd /heptane fiksering (Fikseringsbuffer pluss 5% formaldehyd).
- Fest i 2,5 min på en mutter. Tilsett 1 ml heptan og virvel 1 min. La bosette ~ 1 min.
- Fjern all væske, og tilsett deretter 1 ml 1x PBS. Virvel 30 sek. La bosette ~ 1 min.
- Fjern all væske, og fyll deretter røret med 1x PBS.
MERK: Oocytter kan brukes umiddelbart eller oppbevart på mutteren i flere timer ved romtemperatur.
- Alternativ #2: Formaldehyd/kaktolylatfiksering (Fix Mix pluss 8% formaldehyd og 100 mM kaktocylat).
- Fest i 6 min på en mutter. La bosette seg 2 min. Fjern væsken, og fyll deretter røret med 1x PBS.
MERK: Oocytter kan brukes umiddelbart eller oppbevart på mutteren i flere timer ved romtemperatur.
5. Fjerne membraner ("Rulle")
- Bruk belagt Pasteur pipet, tilsett ~ 500 til 1000 oocytter til den frostede (sandblåsede) delen av en glasssklie. Fjern alle kroppsdeler og fremmed materiale ved hjelp av tang. Ikke la oocytter tørke ut; tilsett 1x PBS etter behov.
- Plasser en deksler på toppen av oocyttene og rull forsiktig oocytter til alle membraner er fjernet (dra kanten av dekslene over oocyttene fungerer best). Kontroller regelmessig fremdriften under mikroskopet, og legg til mer 1x PBS etter behov. Pass på at for mye press vil ødelegge oocyttene.
