Beredning av fasta Drosophila-oocyter för immunostaining: En metod med hög genomströmning för att fixa och ta bort det yttre membranet

Overview

Immunostaining av Drosophila sena oocyter kan visa sig utmanande på grund av äggcellerna omgivande membran. Den här videon beskriver en metod med hög genomströmning för att erhålla oocyter, deras fixering och membranens avlägsnande för immunostaining. Det presenterade protokollet visar dessa tekniker med sena äggceller som används för att visualisera olika stadier av meios.

Protocol

Detta protokoll är utdraget från Radford och McKim, Techniques for Imaging Prometaphase och Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

OBS: Procedurer utförs vid rumstemperatur om inget annat anges. Temperaturkontrollerade inkubatorer används för att bibehålla temperaturer för fluguppfödning och korsningar om inget annat anges.

1. Förberedelser

1. Förbered flugor.
   1. Prometaphase-berikade oocyte samlingar.
      1. Rensa vuxna flugor från friska, unga lager eller korskulturer. Åldersflaskor i två dagar vid 25 °C.
         OBS: I allmänhet räcker det med två hälsosamma flaskor, även om mer kan behövas för vissa korskulturer.
      2. Efter två dagar, samla ~ 100 till 300 honor (som är 0 till 2 dagar gamla vid denna tidpunkt) från flaskorna. Honorna behöver inte vara oskulder. Tillsätt en klick jästpasta på sidan av en flaska och placera 30 honor och 10 till 15 män vardera i de jästa injektionsflaskan. Ålder injektionsflaska i två dagar vid 25 °C.
   2. Metafasberikade Oocyte samlingar.
      1. Samla ~ 100 till 300 kvinnor från lager eller korskulturer. Tillsätt en klick jästpasta på sidan av en flaska och placera 30 honor vardera (utan tillsatta män) i de jästa injektionsflaskan. Ålder injektionsflaska i tre till fem dagar vid 25 °C.
2. Förbered lösningar.
   OBS: Lösningar kan förvaras på obestämd tid i rumstemperatur, om inget annat anges.
   1. Förbered modifierad robbbuffert (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sackaros, 275 mM natriumacetat, 200 mM kaliumacetat, 50 mM glukos, 6 mM magnesiumklorid och 5 mM kalciumklorid. Använd 10 N 11:8 natriumhydroxid: kaliumhydroxid för att få pH till 7,4. Sterilisera genom filtrering; Spara inte automatiskt. Förvara vid -20 °C. Tina efter behov för att förbereda ~ 200 ml 1x Robbs per oocyte prep.
   2. Lösningar för fixering.
      1. Alternativ #1: Förbered formaldehyd/heptanfixering. Förbered fixeringsbuffert: 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) plus 150 mM sackaros. För att använda, gör färsk med 687,5 μl fixeringsbuffert och 312,5 μl 16% formaldehyd per oocytförberedelse.
         VARNING: Använd handskar när du använder formaldehydlösningar i en rökhuv. Bortskaffa avfall enligt institutionella riktlinjer.
      2. Alternativ #2: Förbered formaldehyd/kakodylatfixering. Förbered fixblandning: 250 mM sackaros, 100 mM kaliumacetat (pH 7,5), 25 mM natriumacetat (pH 7,0) och 25 mM EGTA (pH 8,0). För att använda, gör färskt med 400 μl Fix Mix, 100 μl kaliumkrydnad (1 M, pH 7.2) och 500 μl 16% formaldehyd per oocytförberedelse.
         VARNING: Kaliumkaktylat innehåller arsenik.
   3. Förbered PBS/Triton X-100: 1x PBS plus 1% eller 0,05% Triton X-100. Förvaras vid 4 °C.
   4. Förbered PBS-Tween 20-Bovint serumalbumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) och 0,1% interpolering-20. Kan förvaras vid 4 °C i en vecka.

2. Samling av Drosophila Oocytes i sen fas

1. Som Drosophila oocytes med membran intakt kommer att hålla sig till plast och glas, förlackera insidan av en 5 ml rör och en Pasteur pipet per oocyte prep med PTB.
2. Söv alla ~100 till 300 jästflugor med koldioxid och lägg till en mixer som innehåller ~100 ml 1x Robb's Buffer. Puls tre gånger (~1 sek vardera). Förvara äggceller i Robb's i <20 min för att undvika aktivering.
   OBS: Alternativt kan oocyter handdesekeras från kvinnor. Fördelen med denna metod är att den kräver färre kvinnor. Man måste dock vara noga med att begränsa exponeringen för koldioxid till endast några minuter för att undvika artefakter i samband med hypoxi.
3. Filtrera genom stort nät (~1 500 μm) i 250 ml bägare för att ta bort stora kroppsdelar. Om många intakta bukar förblir på nätet, slipa om material med ytterligare Robb's Buffer och filtrera igen. Låt bosätta sig ~ 2 min, aspirera sedan av toppskiktet och ta bort så många av de stora kroppsdelarna som möjligt.
4. Filtrera genom litet nät (~300 μm) till en 250 ml bägare. Skölj återstående äggceller ur första bägaren med hjälp av ytterligare Robbs och belagda Pasteur-rör. Låt bosätta sig ~ 3 min; oocyter kommer att slå sig till ro. Aspirera av alla utom ~10 ml.
5. Häll så mycket av de 10 ml som passar i belagt 5 ml rör. Låt sätta sig, ta bort vätska och upprepa med resten. Skölj återstående äggceller ur bägaren med hjälp av ytterligare Robbs och belagda Pasteur-rör. Låt sätta i 5 ml rör i ~ 3-5 min.

3. Läkemedelsbehandlingar (valfritt)

1. Täck ett andra 5 ml rör med PTB för varje oocytförberedelse. Tillsätt lämpligt lösningsmedel (kontroll) eller läkemedel till 1 ml Robb's vardera för varje äggcellsprep (tabell 1).
2. Dela äggceller i andra belagda 5 ml rör. Låt sätta, ta bort vätska och tillsätt 1 ml Robbs plus lösningsmedel i ett rör och 1 ml Robbs plus drog i andra röret. Nöta under lämplig tid för läkemedelsbehandling (tabell 1). Låt oss slå oss till ro.

4. Fixering

1. Aspirera av all vätska och tillsätt omedelbart 1 ml Fix.
2. Alternativ #1: Formaldehyd/heptanfixering (fixeringsbuffert plus 5% formaldehyd).
   1. Fixera i 2,5 min på en mutter. Tillsätt 1 ml heptan och virvel 1 min. Låt sätta ~1 min.
   2. Ta bort all vätska och tillsätt sedan 1 ml 1x PBS. Virvel 30 sekunder. Låt sätta ~1 min.
   3. Ta bort all vätska och fyll sedan röret med 1x PBS.
      OBS: Oocyter kan användas omedelbart eller förvaras på muttern i flera timmar vid rumstemperatur.
3. Alternativ #2: Formaldehyd/kakodylatfixering (Fix Mix plus 8% formaldehyd och 100 mM kakodylat).
   1. Fixera i 6 min på en mutter. Låt oss bosätta oss 2 minuter. Ta bort vätska och fyll sedan röret med 1x PBS.
      OBS: Oocyter kan användas omedelbart eller förvaras på muttern i flera timmar vid rumstemperatur.

5. Ta bort membran ("Rullande")

1. Använd belagda Pasteur pipet, tillsätt ~ 500 till 1000 äggceller till den frostade (sandblästrade) delen av en glasrutschbana. Ta bort alla kroppsdelar och främmande material med tång. Låt inte äggceller torka ut; lägg till 1x PBS vid behov.
2. Placera ett locklip ovanpå äggcellerna och "rulla" försiktigt äggceller tills alla membran tas bort (att dra kanten på täckglaset över äggcellerna fungerar bäst). Kontrollera regelbundet framstegen under mikroskopet och tillsätt mer 1x PBS vid behov. Var försiktig eftersom för mycket tryck kommer att förstöra äggcellerna.

Representative Results

Läkemedel	Lösningsmedel	Lagerkoncentration	Slutlig koncentration	Behandlingstid	Effekt
kolchicine	Etanol	125 mM	150 μM	10 min eller 30 min	destabilisera icke-kinetochore (10 min) eller alla (30 min) mikrotubuli
Paclitaxel	Dmso	10 mM	10 μM	10 min	stabilisera mikrotubuli
Binuklein 2	Dmso	25 mM	25 μM	20 min	hämma Aurora B-kinas

Tabell 1: Läkemedelsbehandling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various