Beredning av fasta Drosophila-oocyter för immunostaining: En metod med hög genomströmning för att fixa och ta bort det yttre membranet
Published: April 30, 2023
Abstract
Källa: Radford, S. J., McKim, K. S. Tekniker för bildbehandling prometafas och metafas av meios I i fasta Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (2016).
Immunostaining av Drosophila sena oocyter kan visa sig utmanande på grund av äggcellerna omgivande membran. Den här videon beskriver en metod med hög genomströmning för att erhålla oocyter, deras fixering och membranens avlägsnande för immunostaining. Det presenterade protokollet visar dessa tekniker med sena äggceller som används för att visualisera olika stadier av meios.
Protocol
Detta protokoll är utdraget från Radford och McKim, Techniques for Imaging Prometaphase och Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016). OBS: Procedurer utförs vid rumstemperatur om inget annat anges. Temperaturkontrollerade inkubatorer används för att bibehålla temperaturer för fluguppfödning och korsningar om inget annat anges. 1. Förberedelser Förbered flugor. <li…
Representative Results
Läkemedel Lösningsmedel Lagerkoncentration Slutlig koncentration Behandlingstid Effekt kolchicine Etanol 125 mM 150 μM 10 min eller 30 min destabilisera icke-kinetochore (10 min)eller alla (30…
Materials
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| magnesium chloride | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
Cite This Article
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).