Lokale hittesondetest: een methode om nociceptie van hoge temperaturen bij Drosophila-larven te beoordelen

Overview

Drosophila-larven hebben speciale sensorische neuronen - nociceptoren - waarvan de reactie op potentieel schadelijke thermische stimuli aversief - of zogenaamd "nocifensief" - gedrag bij het dier veroorzaakt. Deze video beschrijft een methode om thermische nociceptie te beoordelen door larvaal gedrag op te nemen als reactie op lokale toepassing van een warmtesonde op de cuticula. Deze methode wordt daarom de lokale hittesondetest genoemd.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).

1. Lokale hittesondetest

We leveren een schadelijke thermische stimulus aan een individueel larvaal lichaamssegment met behulp van een op maat gemaakte thermische sonde vervaardigd door Pro-Dev Engineering (zie tabel met materialen). Hoewel deze sonde optimale ontwerpkenmerken heeft (een kleine metalen punt van ~ .07 mm² gebied en de mogelijkheid om een ingestelde punttemperatuur nauwkeurig te handhaven van 23 °C tot 65 °C) moet in principe elk gereedschap met een kleine punt dat kan worden verwarmd tot een gedefinieerde temperatuur gedurende een periode van maximaal 20 seconden volstaan. De sondetip wordt gebruikt om vroege 3^rd instar larven precies op de dorsale middellijn bij buiksegment A4 te stimuleren (zie figuur 1). Als reactie op deze thermische stimulus vertonen larven over het algemeen een aversief terugtrekkingsgedrag van lateraal rollen met 360 graden of meer. Dit gedrag onderscheidt zich van hun lichte aanrakingsreactie op een niet-schadelijke metalen sonde op kamertemperatuur, die over het algemeen een korte pauze in hun locomotory-activiteit inhoudt.

Protocol voor de hittesondetest:

1. Stel de temperatuur van de thermische sonde vooraf in op het gewenste instelpunt.
2. Gebruik een penseel of tang om een individuele larve voorzichtig over te brengen op een plat platform (we gebruiken meestal een klein stukje vinyl gesneden uit een bindmiddel) waarop de larven vervolgens worden gestimuleerd. De larve moet worden bedekt met een dunne waterfilm voordat hij in contact komt met de thermische sonde. De waterfilm die de larve bedekt, moet zo min mogelijk zijn en de larve volledig bedekken, terwijl ervoor wordt gezorgd dat de larve niet droog is bij het aanraken van het vinyl.
3. Druk de sondepunt voorzichtig tegen de larve in segment A4 en oefen lichtdruk uit met de punt in een hoek van ongeveer 45° tussen de sonde en het oppervlak van de larve (zie figuur 1). De druk moet een lichte inkeping op het oppervlak van de larve veroorzaken en zal meestal voldoende zijn om voortbeweging te voorkomen. Als de larve blijft bewegen, oefen dan iets meer druk uit en deze stopt meestal. Registreer geen gegevens van larven die zich buiten het gezichtsveld bewegen of waarvoor constant contact met de sonde niet kan worden bereikt tot de reactie of de 20 s cutoff.
4. Blijf de larve stimuleren totdat een ontwenningsreactie wordt getoond of totdat de 20 seconden cutoff is bereikt, afhankelijk van wat het eerst optreedt. Reagerende larven vertonen meestal eerst een voorlopig gedrag van het opheffen van het hoofd en de staart. Dit wordt meestal gevolgd door het terugtrekkingsgedrag van het rollen van ten minste 360 graden. Slechts een volledige rol van 360 graden wordt gescoord als nocifensief gedrag (de voorlopige kop- of staartverhoging niet).
5. Zodra het opname gedrag is geïnitieerd, geeft u contact met de sonde vrij en registreert u de latentie of tijd tot opname. Als er binnen 20 seconden geen ontwenningsgedrag wordt waargenomen, is de larve een niet-responder. De responders kunnen verder worden onderverdeeld in 2 categorieën. Als het ontwenningsgedrag binnen 5 seconden wordt weergegeven, is de larve een snelle responder. Als het ontwenningsgedrag tussen 5-20 seconden wordt getoond, is de larve een slow-responder (zie figuur 1 in Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).

Representative Results

Figuur 1: Experimentele opstelling voor lokale warmtesondetest. De warmtesonde wordt aangestuurd door een thermische regeleenheid die wordt gebruikt om de temperatuur van de sonde in te stellen en te handhaven. De sonde wordt loodrecht op de anteroposterior-as gehouden en gebruikt om de larve onder een hoek van 45° ten opzichte van het horizontale vlak te stimuleren. Sondecontact wordt specifiek gemaakt bij abdominale segment A4 zoals getoond. De gebruiker moet dit contact met zachte druk onderhouden tot de afsluiting van 20 seconden of totdat het rolgedrag begint. Als de temperatuur als schadelijk wordt ervaren, zal de larve een aversief terugtrekkingsgedrag vertonen dat wordt gekenmerkt door ten minste één rol van 360 °. Het aantal rollen kan enkel of meervoudig zijn (zie figuur 2B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Kwantificering van de gedragsrespons met behulp van de hittesondetest. (A) Plot van het percentage responders dat tot elke categorie behoort (snelle, langzame en niet-responders) versus temperatuur. (B) Plot van de latentie tot aversief onttrekkingsgedrag versus het aantal rollen dat elke larve vertoonde bij vier verschillende testtemperaturen van toenemende schadelijkheid (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C en 52 °C). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermal Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Contact information can be provided on request
Leica DFC290 12v/400mA Color camera	Leica Microsystems	12730080	Any equivalent camera will do.
Leica MZ6 microscope	Leica Microsystems	Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614
Schott Ace Modulamp Unit	Schott AG	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott AG	Schott A08575
Thermal Control Unit	TSCI corp.	Custom Built	Details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do.
Forceps	Fine Science Tools	FS-1670
Paintbrush	Blick Art Materials	06762-1002
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon BD	351008	We have not tested alternative dishes.
Piece of vinyl	Office Depot	480009