Saggio della sonda di calore locale: un metodo per valutare la nocicezione delle alte temperature nelle larve di Drosophila

Overview

Le larve di Drosophila hanno neuroni sensoriali dedicati - nocicettori - la cui risposta a stimoli termici potenzialmente dannosi innesca comportamenti avversi o cosiddetti "nocifensivi" nell'animale. Questo video descrive un metodo per valutare la nocicezione termica registrando il comportamento larvale in risposta all'applicazione locale di una sonda di calore sulla cuticola. Questo metodo è, quindi, chiamato test della sonda di calore locale.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Chattopadhyay et al., Metodi locali e globali di valutazione della nocicezione termica nelle larve di Drosophila, J. Vis. Exp. (2012).

1. Saggio della sonda di calore locale

Forniamo uno stimolo termico scioxioso a un singolo segmento del corpo larvale utilizzando una sonda termica costruita su misura prodotta da Pro-Dev Engineering (vedi Tabella dei materiali). Sebbene questa sonda abbia caratteristiche di progettazione ottimali (una piccola punta metallica di ~ .07 mm² area e la capacità di mantenere con precisione una temperatura del set point da 23 °C a 65 °C) in linea di principio qualsiasi utensile con una piccola punta che può essere riscaldato a una temperatura definita per un periodo fino a 20 secondi dovrebbe essere sufficiente. La punta della sonda viene utilizzata per stimolare le prime 3^larve di instar proprio sulla linea mediana dorsale nel segmento addominale A4 (vedi figura 1). In risposta a questo stimolo termico, le larve mostreranno generalmente un comportamento di astinenza avverso di rotolamento laterale di 360 gradi o più. Questo comportamento è distinto dalla loro risposta al tocco leggero a una sonda metallica a temperatura ambiente non negativa che generalmente comporta una breve pausa nella loro attività locomotoria.

Protocollo per il saggio della sonda di calore:

1. Pre-impostare la temperatura della sonda termica sul set point desiderato.
2. Usa un pennello o le flesse per trasferire delicatamente una singola larva su una piattaforma piatta (di solito usiamo un piccolo pezzo di vinile tagliato da un legante) su cui le larve saranno successivamente stimolate. La larva deve essere coperta da un sottile film d'acqua prima del contatto con la sonda termica. Il film d'acqua che copre la larva dovrebbe essere il meno possibile e coprire completamente la larva, assicurando al contempo che la larva non sia asciutta quando si tocca il vinile.
3. Premere delicatamente la punta della sonda contro la larva al segmento A4 applicando una pressione leggera con la punta a circa 45 ° di angolo tra la sonda e la superficie della larva (vedere figura 1). La pressione dovrebbe causare una leggera indentazione sulla superficie della larva e di solito sarà sufficiente per prevenire la locomozione. Se la larva continua a muoversi, applicare un po 'più di pressione e di solito si fermerà. Non registrare i dati delle larve che si spostano oltre il campo visivo o per le quali il contatto costante della sonda non può essere raggiunto fino alla risposta o al taglio di 20 s.
4. Continua a stimolare la larva fino a quando non viene esibita una risposta di prelievo o fino a raggiungere il taglio di 20 secondi, a seconda di quale si verifica per primo. Le larve che rispondono in genere mostrano prima un comportamento preliminare di sollevamento della testa e della coda. Questo è di solito seguito dal comportamento di astinenza del rotolamento di almeno 360 gradi. Solo un rotolo completo di 360 gradi viene valutato come comportamento nocifensivo (l'aumento preliminare della testa o della coda non lo è).
5. Una volta avviato il comportamento di prelievo, rilasciare il contatto con il probe e registrare la latenza o il tempo di recesso. Se non viene osservato alcun comportamento di prelievo entro 20 secondi, la larva è un non rispondente. I soccorritori possono essere ulteriormente suddivisi in 2 categorie. Se il comportamento di prelievo viene mostrato entro 5 secondi, la larva è un risponditore rapido. Se il comportamento di prelievo viene mostrato tra 5-20 secondi, allora la larva è un risponditore lento (vedi Figura 1 in Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).

Representative Results

Figura 1: Configurazione sperimentale per il saggio locale della sonda di calore. La sonda di calore è controllata da un'unità di controllo termico che viene utilizzata per impostare e mantenere la temperatura della sonda. La sonda è tenuta perpendicolare all'asse anteroposterior e utilizzata per stimolare la larva con un angolo di 45° rispetto all'orizzontale. Il contatto della sonda viene effettuato specificamente al segmento addominale A4 come mostrato. L'utente deve mantenere questo contatto con una pressione delicata fino al taglio di 20 secondi o fino all'inizio del comportamento di laminazione. Se la temperatura è percepita come sciocca, la larva mostrerà un comportamento di astinenza avverso caratterizzato da almeno un rotolo a 360 °. Il numero di rotoli può essere singolo o multiplo (vedere figura 2B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Quantificazione della risposta comportamentale utilizzando il saggio della sonda di calore. (A) Grafico della percentuale di risponditori appartenenti a ciascuna categoria (fast-, slow-, e non-responders) rispetto alla temperatura. (B) Grafico della latenza al comportamento di astinenza avversa rispetto al numero di rotoli che ciascuna larva ha mostrato a quattro diverse temperature di prova di aumento della nososità (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C e 52 °C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermal Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Contact information can be provided on request
Leica DFC290 12v/400mA Color camera	Leica Microsystems	12730080	Any equivalent camera will do.
Leica MZ6 microscope	Leica Microsystems	Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614
Schott Ace Modulamp Unit	Schott AG	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott AG	Schott A08575
Thermal Control Unit	TSCI corp.	Custom Built	Details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do.
Forceps	Fine Science Tools	FS-1670
Paintbrush	Blick Art Materials	06762-1002
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon BD	351008	We have not tested alternative dishes.
Piece of vinyl	Office Depot	480009