בדיקת חום מקומית: שיטה להערכת Nociception של טמפרטורות גבוהות בזחלים Drosophila

Overview

לזחלים של דרוזופילה יש נוירונים חושיים ייעודיים – nociceptors– שתגובתם לגירויים תרמיים שעלולים להזיק מעוררת התנהגויות מרתיעות-או מה שמכונה "nocifensive"-behaviors בבעלי החיים. וידאו זה מתאר שיטה להערכת nociception תרמית על ידי הקלטת התנהגות הזחל בתגובה ליישום מקומי של גשוש חום על הקוטיקל. שיטה זו נקראת, אם כן, בדיקת בדיקת החום המקומית.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Chattopadhyay ואח ',שיטות מקומיות וגלובליות להערכת Nociception תרמית בזחלים Drosophila, J. Vis. Exp. (2012).

1. בדיקת חום מקומית

אנו מספקים גירוי תרמי רעיל לפלח גוף זחל בודד באמצעות בדיקה תרמית שנבנתה בהתאמה אישית המיוצרת על ידי Pro-Dev Engineering (ראה טבלת חומרים). למרות בדיקה זו יש תכונות עיצוב אופטימלי (קצה מתכת קטן של ~ .07 מ"מ² שטח ואת היכולת לשמור במדויק על טמפרטורת נקודה מוגדרת מ 23 °C (70 °F) באופן עקרוני כל כלי עם קצה קטן שניתן לחמם לטמפרטורה מוגדרת לתקופה של עד 20 שניות צריך להספיק. קצה הבדיקה משמש להמרצת זחלים^{אינסטארים תלת-צדדיים} מוקדמים בדיוק בקו האמצע הגבי בקטע הבטן A4 (ראו איור 1). בתגובה לגירוי תרמי זה, הזחלים יציגו בדרך כלל התנהגות נסיגה מרתיעה של גלגול לרוחב על ידי 360 מעלות או יותר. התנהגות זו נבדלת מתגובת המגע הקל שלהם לבדיקת מתכת בטמפרטורת החדר שאינה רעילה, אשר בדרך כלל כרוכה בהפסקה קצרה בפעילות הלוקומוטורית שלהם.

פרוטוקול לבדיקת החום:

1. טמפרטורה מוגדרת מראש של הגשוש התרמי לנקודת ההגדרה הרצויה.
2. השתמש מברשת צבע או מלקחיים בעדינות להעביר זחל בודד על פלטפורמה שטוחה (אנחנו בדרך כלל להשתמש חתיכה קטנה של ויניל לחתוך קלסר) שבו הזחלים יהיה מגורה לאחר מכן. הזחל צריך להיות מכוסה על ידי סרט דק של מים לפני מגע עם החללית התרמית. סרט המים המכסה את הזחל צריך להיות קטן ככל האפשר ולכסות לחלוטין את הזחל, תוך הקפדה על כך שהזחל אינו יבש כאשר נוגעים בויניל.
3. לחץ בעדינות על קצה הבדיקה כנגד הזחל במקטע A4 והפעל לחץ אור עם הקצה בזווית של כ-45° בין הגשוש לפני השטח של הזחל (ראו איור 1). הלחץ צריך לגרום חודר קל על פני השטח של הזחל ובדרך כלל יהיה מספיק כדי למנוע תנועה. אם הזחל ממשיך לנוע, להפעיל קצת יותר לחץ וזה בדרך כלל יפסיק. אל תתעד נתונים מזחלים החורגים משדה הראייה או שעבורם לא ניתן להשיג מגע בדיקה קבוע עד לתגובה או לניתוק 20 s.
4. המשך לעורר את הזחל עד שתגובת נסיגה מוצגת או עד שיגיע הקיצוץ של 20 השניות, לפי המוקדם מביניהם. זחלים מגיבים בדרך כלל מראים תחילה התנהגות ראשונית של הרמת הראש והזנב. זה בדרך כלל ואחריו את התנהגות הנסיגה של גלגול לפחות 360 מעלות. רק גליל שלם של 360 מעלות הוא הבקיע כמו התנהגות nocifensive (ראש ראשוני או זנב להעלות הוא לא).
5. לאחר אופן הפעולה נסיגה הוא יזם לשחרר קשר עם החללית ולתעד את ההשהיה או זמן הנסיגה. אם לא נצפתה התנהגות נסיגה בתוך 20 שניות, הזחל הוא לא מגיב. ניתן לחלק את המגיבים לשתי קטגוריות נוספות. אם התנהגות הנסיגה מוצגת תוך 5 שניות, הזחל מגיב במהירות. אם התנהגות הנסיגה מוצגת בין 5-20 שניות, הזחל הוא מגיב איטי (ראה איור 1 ב Babcock et al., Curr. בביול, ביול. (2009)).

Representative Results

איור 1: הגדרה ניסיונית לבדיקת בדיקת חום מקומית. גשושית החום נשלטת על ידי יחידת בקרה תרמית המשמשת להגדרה ולשמירה על טמפרטורת הגשוש. הגשוש מוחזק בניצב לציר האנטרו-פוסטריורי ומשמש להמרצת הזחל בזווית של 45° לאופקי. מגע בדיקה נעשה במיוחד בקטע הבטן A4 כפי שמוצג. על המשתמש לשמור על מגע זה בלחץ עדין עד לניתוק של 20 שניות או עד לתחילת ההתנהגות המתגלגלת. אם הטמפרטורה נתפסת כמזיקה, הזחל יראה התנהגות נסיגה מרתיעה המאופיינת בגליל אחד לפחות של 360 מעלות. מספר הלחמניות יכול להיות יחיד או כפול (ראו איור 2B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: כימות של תגובה התנהגותית באמצעות בדיקת בדיקת החום. (A) התוויה של אחוז המגיבים השייכים לכל קטגוריה (מהיר, איטי, ולא מגיבים) לעומת טמפרטורה. (B) העלילה של ההשהיה להתנהגות נסיגה מרתיעה לעומת מספר לחמניות כל זחל הציג בארבע טמפרטורות בדיקה שונות של רעילות גוברת (42 °C (42 °C (70 °F), 44 °C (60 °F), 46 °C (70 °F), 50 °C (70 °F) ו 52 °C (70 °F). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermal Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Contact information can be provided on request
Leica DFC290 12v/400mA Color camera	Leica Microsystems	12730080	Any equivalent camera will do.
Leica MZ6 microscope	Leica Microsystems	Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614
Schott Ace Modulamp Unit	Schott AG	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott AG	Schott A08575
Thermal Control Unit	TSCI corp.	Custom Built	Details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do.
Forceps	Fine Science Tools	FS-1670
Paintbrush	Blick Art Materials	06762-1002
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon BD	351008	We have not tested alternative dishes.
Piece of vinyl	Office Depot	480009