Lokal varmesondeanalyse: En metode for å vurdere nociception av høye temperaturer i Drosophila larver

Overview

Drosophila larver har dedikerte sensoriske nevroner -nociceptorer - hvis respons på potensielt skadelige termiske stimuli utløser aversive - eller såkalte "nocifensive" -atferd i dyret. Denne videoen beskriver en metode for å vurdere termisk nociception ved å registrere larval oppførsel som svar på lokal påføring av en varmesonde på kutikylen. Denne metoden kalles derfor den lokale varmesondeanalysen.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Chattopadhyay et al.,Lokale og globale metoder for å vurdere termisk nociception i Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).

1. Lokal varmesondeanalyse

Vi leverer en skadelig termisk stimulans til et individuelt larvhussegment ved hjelp av en spesialbygd termisk sonde produsert av Pro-Dev Engineering (se Materialfortegnelse). Selv om denne sonden har optimale designfunksjoner (en liten metallspiss på ~ 0,07 mm^2-området og evnen til å opprettholde en innstilt punkttemperatur nøyaktig fra 23 °C til 65 °C) bør i prinsippet ethvert verktøy med en liten spiss som kan varmes opp til en definert temperatur i en periode på opptil 20 sekunder være tilstrekkelig. Sondespissen brukes til å stimulere tidlige 3^rd instar larver nøyaktig på dorsal midtlinjen ved buksegment A4 (se figur 1). Som svar på denne termiske stimulansen vil larver generelt vise en aversiv abstinensadferd for å rulle lateralt med 360 grader eller mer. Denne oppførselen skiller seg fra deres lette berøringsrespons på en ikke-skadelig romtemperaturmetallsonde som generelt innebærer en kort pause i deres lokomotoriske aktivitet.

Protokoll for varmesondeanalysen:

1. Den termiske sondens forhåndsinnstilte temperatur til ønsket innstilt punkt.
2. Bruk en pensel eller tang for å forsiktig overføre en individuell larve til en flat plattform (vi bruker vanligvis et lite stykke vinylkutt fra en bindemiddel) som larvene senere vil bli stimulert på. Larven skal dekkes av en tynn film av vann før kontakt med termisk sonde. Filmen av vann som dekker larven skal være så lite som mulig og helt dekke larven, samtidig som larven ikke er tørr når du berører vinylen.
3. Trykk forsiktig sondespissen mot larven i segment A4 og påfør lett trykk med spissen i omtrent 45° vinkel mellom sonden og larvens overflate (se figur 1). Trykket skal forårsake en liten innrykk på overflaten av larven og vil vanligvis være tilstrekkelig til å forhindre bevegelse. Hvis larven fortsetter å bevege seg, bruk litt mer trykk, og det vil vanligvis stoppe. Ikke registrer data fra larver som beveger seg utover synsfeltet eller som konstant sondekontakt ikke kan oppnås før respons eller 20-s cutoff.
4. Fortsett å stimulere larven til en abstinensrespons er utstilt eller til 20 sekunders avskjæring er nådd, avhengig av hva som skjer først. Responderende larver viser vanligvis først en foreløpig oppførsel for å løfte hodet og halen. Dette etterfølges vanligvis av abstinensadferden ved å rulle minst 360 grader. Bare en komplett rulle på 360 grader scores som nocifensiv oppførsel (det foreløpige hodet eller halehevingen er det ikke).
5. Når uttaksatferden er igangsatt, frigjør du kontakt med sonden og registrerer ventetiden eller tiden for å trekke seg tilbake. Hvis ingen abstinensadferd observeres innen 20 sekunder, er larven en ikke-responder. Responderne kan videre deles inn i 2 kategorier. Hvis abstinensadferden vises innen 5 sekunder, er larven en rask responder. Hvis abstinensadferden er vist mellom 5-20 sekunder, er larven en sakte responder (se figur 1 i Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).

Representative Results

Figur 1: Eksperimentelt oppsett for lokal varmesondeanalyse. Varmesonden styres av en termisk kontrollenhet som brukes til å stille inn og opprettholde probens temperatur. Sonden holdes vinkelrett på anteroposterioraksen og brukes til å stimulere larven i en vinkel på 45° til horisontalen. Sondekontakt er laget spesielt på buksegment A4 som vist. Brukeren må opprettholde denne kontakten med forsiktig trykk opp til 20 sekunders avstengning eller til rulleadferden starter. Hvis temperaturen oppfattes som skadelig, vil larven vise en aversiv abstinensadferd preget av minst en 360 ° rulle. Antall ruller kan være enkelt eller flere (se figur 2B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Kvantifisering av atferdsrespons ved hjelp av varmesondeanalysen. (A) Plott av prosentandelen av respondere som tilhører hver kategori (hurtig-, sakte- og ikke-respondere) kontra temperatur. (B) Plott av ventetiden til aversiv abstinensadferd kontra antall ruller hver larve utstilt ved fire forskjellige testtemperaturer med økende skadelighet (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C og 52 °C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermal Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Contact information can be provided on request
Leica DFC290 12v/400mA Color camera	Leica Microsystems	12730080	Any equivalent camera will do.
Leica MZ6 microscope	Leica Microsystems	Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614
Schott Ace Modulamp Unit	Schott AG	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott AG	Schott A08575
Thermal Control Unit	TSCI corp.	Custom Built	Details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do.
Forceps	Fine Science Tools	FS-1670
Paintbrush	Blick Art Materials	06762-1002
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon BD	351008	We have not tested alternative dishes.
Piece of vinyl	Office Depot	480009