درجة الحرارة الانحدار المقايسة: طريقة لاختبار درجة الحرارة تفضيل في يرقات Drosophila

Overview

يمكن لذباب الفاكهة Drosophila التمييز بين التغيرات الصغيرة في درجة الحرارة وبالتالي اختيار البيئات ذات الظروف الحرارية المواتية. يصف هذا الفيديو المقايسة السلوكية التي تختبر تفضيل درجة الحرارة ليرقات دروسوفيلا على تدرج حراري خطي.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من ليو وآخرون. اختبار تدرج درجة الحرارة لتحديد التفضيلات الحرارية ليرقات دروسوفيلا، J. Vis. Exp. (2018).

1. إعداد تدرج درجة الحرارة

1. إعداد تدرج أحادي الاتجاه
   1. لخلق بيئة رطبة المحيطة خلال المقايسات، وضع كتل الألومنيوم اثنين متصلة اثنين من الحمامات المائية على المناشف الورقية الرطبة، مفصولة 10 سم(الشكل 1A).
   2. بدوره على اثنين من حمامات المياه ~ 2 ساعة قبل بدء الفحص لإتاحة الوقت الكافي لدرجة حرارة كتل الألومنيوم إلى equilibrate.
      ملاحظة: من المستحسن إجراء تجربة وهمية لتحديد درجة حرارة كل حمام مائي مطلوب لتحقيق تدرج درجة الحرارة الخطية المطلوبة. يتم سرد بعض أزواج درجة الحرارة النموذجية لتعيين حمامات المياه في الجدول 1. ومع ذلك، لاحظ أن درجات الحرارة السطحية تتأثر بدرجة الحرارة المحيطة. طول الأنابيب يؤثر أيضا على درجات الحرارة كما أن هناك تبريد في الأنابيب. طول الأنابيب في الإعداد لدينا هو 1.5 متر.
   3. ميكروويف 100 مل من 1٪ agarose في إعداد الطاقة العالية في زجاجة 500 مل مستديرة واسعة الفم وصب 25 مل / طبق المقايسة على سطح مقاعد البدلاء المستوى. إعداد اثنين من لوحات المقايسة، والتي يمكن وضعها على كتل الألومنيوم في نفس الوقت(الشكل 1A).
   4. بعد أن توطدت agarose (10-20 دقيقة) ، وفرك بلطف كل سطح agarose مع اسفنجة المطبخ القياسية أو اسفنجة الميلامين لجعل سطح agarose خشنة قليلا ، بحيث عند رش الماء على هلام agarose ، سيتم إنشاء غشاء الماء رقيقة على نحو سلس ، وسوف تشكل أي قطرات الماء.
   5. غمر تماما لوحات في وعاء مع الماء المقطر حتى المقايسة على استعداد لإجراء لمنع لوحات من الحصول على المجففة.
2. إعداد تدرج ثنائي الاتجاه (اختياري)
   1. لخلق بيئة رطبة المحيطة أثناء المقايسات، ضع ثلاث كتل الألومنيوم 8 سم عن بعضها البعض (الشكل 1B) على المناشف الورقية الرطبة.
   2. بدوره على اثنين من حمامات المياه ~ 2 ساعة قبل بدء الفحص لإتاحة الوقت الكافي لدرجة حرارة كتل الألومنيوم إلى equilibrate.
      ملاحظة: من المستحسن إجراء تجربة وهمية لتحديد درجة حرارة كل حمام مائي للتدرج ثنائي الاتجاه. يتم سرد بعض أزواج درجة الحرارة النموذجية لتعيين حمامات المياه في الجدول 2. ومع ذلك، لاحظ أن درجات الحرارة السطحية تتأثر بدرجة الحرارة المحيطة. طول الأنابيب يؤثر أيضا على درجات الحرارة كما أن هناك تبريد في الأنابيب. طول الأنابيب في الإعداد لدينا هو 1.5 متر.
   3. لمنع agarose من تسرب من لوحة، التفاف حواف لوحة الألومنيوم مع شريط وضع العلامات لتشكيل جدار 10 ملم عالية (الشكل 1B).
   4. باستخدام الإعداد عالية الطاقة، والميكروويف 200 مل من 1٪ agarose في زجاجة 500 مل جولة واسعة الفم وصب 120 مل على لوحة المقايسة.
   5. بعد أن توطدت agarose (~ 30 دقيقة) ، وفرك بلطف كل سطح agarose مع اسفنجة المطبخ القياسية أو اسفنجة الميلامين لجعل سطح agarose خشنة قليلا ، بحيث عند رش الماء على هلام agarose ، يتم إنشاء غشاء الماء رقيقة على نحو سلس وليس شكل قطرات الماء.
   6. غمر تماما لوحات المقايسة في وعاء مع الماء المقطر حتى يتم إجراء الفحص لمنعهم من الجفاف.
3. إعداد تدرج أحادي الاتجاه
   1. إعداد الكواشف والعناصر على مقاعد البدلاء بجانب جهاز الفحص المتدرجة (انظر جدول المواد).
   2. لتعزيز كفاءة نقل درجة الحرارة، وملء أي فجوات بين كتل الألومنيوم ولوحات المقايسة عن طريق رش المياه في واجهة بين الكتل ولوحة.
   3. باستخدام القفازات، قم بإزالة لوحات المقايسة من حاوية المياه. إذا كان الماء يغزو بين هلام agarose ولوحة ويسبب المطبات لتشكيل على السطح، وإزالة المياه مع P1000 micropipette.
   4. وضع لوحات المقايسة على كتل الألومنيوم بحيث الترسيمات التي هي 2 سم من أي حافة تطابق تماما حواف كتل الألومنيوم (الشكل 1A, C).
   5. رش الماء على سطح اللوحة (غشاء الماء رقيقة تغطي سطح agarose كافية) لمنع هلام agarose من الجفاف. تأكد من أن غشاء الماء مستمر وخالي من قطرات الماء لأن اليرقات يمكن أن تحاصر في قطرات الماء.
   6. قم بتغطية نظام التدرج بصندوق من الورق المقوى لتقليل تبخر الماء والمساعدة في تثبيت درجة حرارة سطح الجل. انتظر لمدة 5-10 دقائق للسماح لدرجة الحرارة بالتوازن.
   7. تحقق من درجة حرارة السطح عند 12 نقطة على اللوحة (الشكل 1C). خذ قياسين داخل كل منطقة لتحديد ما إذا كان هناك تباين داخل المنطقة أم لا. تأكد من أن درجة الحرارة في كلا البقعتين في حدود ± 0.2 درجة مئوية من درجة الحرارة المطلوبة.
      ملاحظة: يحدث التقلب داخل المنطقة عادة لأن المسافات الدقيقة للبقعتين إلى حافة كتل الألومنيوم ليست متطابقة. ضبط موقف لوحة على كتل الألومنيوم للتأكد من أن الترسيمات التي هي 2 سم من أي حافة تطابق تماما حواف كتل الألومنيوم.
   8. إذا انحرف تدرج درجة الحرارة المقاس عن التدرج المطلوب، قم بزيادة أو تقليل درجة حرارة حمام الماء وإعادة فحص درجة حرارة السطح بعد استقرار درجة حرارة حمام الماء (حمامه).
   9. قم بتغطية نظام التدرج بصندوق من الورق المقوى حتى بدء الفحص.
4. إعداد تدرج ثنائي الاتجاه (اختياري)
   1. إعداد الكواشف والعناصر على مقاعد البدلاء بجانب جهاز الفحص المتدرجة (انظر جدول المواد).
   2. رش الماء على أسطح كتل الألومنيوم الثلاثة لتعزيز كفاءة نقل درجة الحرارة من كتل الألومنيوم إلى لوحات المقايسة عن طريق سد أي فجوات بين الأسطح.
   3. إزالة لوحات المقايسة بعناية من حاوية المياه ووضعها على كتل الألومنيوم. إذا كان الماء يغزو بين هلام agarose ولوحة، والتي قد تسبب المطبات لتشكيل على السطح، وإزالة المياه مع P1000 micropipette.
   4. ضع لوحة المقايسة على كتل الألومنيوم بحيث تتطابق خطوط الوسط في المناطق الأولى والأخيرة من أي من الحافة تماما مع حواف كتل الألومنيوم الجانبية(الشكل 1B, D).
   5. رش الماء على سطح اللوحة (غشاء الماء رقيقة تغطي سطح agarose كافية) لمنع هلام agarose من الجفاف. تأكد من أن غشاء الماء مستمر وخالي من قطرات الماء ، حيث يمكن أن تحاصر اليرقات في قطرات الماء.
   6. قم بتغطية نظام التدرج بصندوق من الورق المقوى لتقليل تبخر الماء والمساعدة في تثبيت درجة حرارة سطح الجل. الانتظار 5-10 دقيقة للسماح لدرجة الحرارة إلى التوازن.
   7. تحقق من درجة حرارة السطح عند نقطتين على طول خط الوسط لكل منطقة من المناطق العشر(الشكل 1D). خذ قياسين داخل كل منطقة لتحديد ما إذا كان هناك تباين داخل المنطقة أم لا. تأكد من أن درجة الحرارة في كلا البقعتين في حدود ± 0.2 درجة مئوية من درجة الحرارة المطلوبة.
      ملاحظة: يحدث التقلب داخل المنطقة عادة لأن المسافات الدقيقة للبقعتين إلى حافة كتل الألومنيوم ليست متطابقة. ضبط موقف لوحة على كتل الألومنيوم للتأكد من أن خطوط الوسط من المناطق الأولى والأخيرة أقرب كل حافة تطابق تماما حواف كتل الألومنيوم الجانبين.
   8. إذا انحرف تدرج درجة الحرارة المقاس عن التدرج المطلوب، فاضبط إعداد درجة حرارة حمام الماء (إعداداته) ثم أعد فحص درجة حرارة السطح بعد استقرار درجة حرارة حمام (حمام) الماء.
   9. قم بتغطية الكتل بصندوق من الورق المقوى حتى بداية الفحص.

2. المقايسة والحساب

1. قم بإزالة صندوق الورق المقوى وتحقق من درجة حرارة سطح الجل مباشرة قبل نقل اليرقات إلى اللوحة. قلل من الوقت الذي يكون فيه صندوق الورق المقوى مفتوحا لمنع تعطيل توازن درجة الحرارة. إذا كان السطح جافا، قم برش كمية صغيرة من الماء على السطح.
2. توزيع 150 ± 50 يرقة بالقرب من مركز كل صفيحة (بين المنطقتين 3 و4 من أصل 6 مناطق) للتدرج أحادي الاتجاه (منطقة الإطلاق؛ الشكل 1جيم).
   ملاحظة: بالنسبة للتدرج ثنائي الاتجاه ، قم بتوزيع 200-400 يرقة على طول المنطقة الوسطى من كل نصف(الشكل 1D).
3. ضع غطاء مجهري فوق كل لوحة مقايسة لمنع اليرقات من الزحف إلى الخارج. قم بتغطية الإعداد بصندوق من الورق المقوى لمنع التعرض للضوء ، مما قد يؤثر على اختيار اليرقات على هلام الآغاروز.
   ملاحظة: بالنسبة للتدرج ثنائي الاتجاه ، لا ينبغي أن يكون من الضروري تغطية اللوحة بغطاء ، لأن اللوحة أكبر ، ودرجة الحرارة المفضلة لليرقات في المنطقة الوسطى. ونتيجة لذلك ، تتراكم يرقات قليلة على الحواف وفرصة للزحف.
4. السماح للمقايسة المضي قدما لمدة 10-30 دقيقة للتدرج أحادي الاتجاه، و15-35 دقيقة للتدرج ثنائي الاتجاه، اعتمادا على عمر اليرقات (الجدول 3).
5. قم بإزالة صندوق الورق المقوى والغطاء الصغير. تصوير لوحات من فوق باستخدام كاميرا رقمية. التقاط صورتين من كل لوحة المقايسة بحيث يمكن للمحقق اختيار واحد مع أفضل التباين والسطوع للتحليل.
6. إزالة جميع اليرقات من لوحات المقايسة وفي أي مكان خارج لوحات عن طريق الطموح.
7. تنظيف لوحات المقايسة، والأنابيب، ومصفاة الخلية جيدا مع الماء المقطر. إعادة استخدام لوحات المقايسة التي أعدت في ذلك اليوم ما لم يتضرر سطح الآغاروز.
8. حساب النسبة المئوية لتوزيع اليرقات في كل منطقة.
   1. افتح الصورة الفوتوغرافية لنتائج الفحص باستخدام أي برنامج يسمح بإضافة علامات إلى الصورة. للإشارة إلى مناطق الفحص، ارسم خطوطا عمودية كل 2 سم استنادا إلى الترسيمات على لوحة الفحص.
   2. عد عدد اليرقات في كل منطقة وسجل الأرقام. لا تحسب اليرقات في المناطق 0.5 سم من أي من الجدران. الجل هو أكثر سمكا بالقرب من الجدران، ودرجات الحرارة السطحية ليست خطية في هذه المناطق.
   3. بالنسبة للتدرج أحادي الاتجاه، احسب توزيع النسبة المئوية في كل منطقة على النحو التالي:
      (عدد اليرقات في منطقة معينة 2 سم) / (العدد الإجمالي لليرقات في 6 مناطق) × 100.
   4. بالنسبة للتدرج ثنائي الاتجاه، احسب توزيع النسبة المئوية في كل منطقة على النحو التالي:
      (عدد اليرقات في منطقة معينة 2 سم) / (العدد الإجمالي لليرقات في 5 مناطق على كل جانب من التدرج) × 100.

Representative Results

الشكل 1: إعدادات المقايسة التدرج أحادية و ثنائية الاتجاه. (أ) إعداد التدرج أحادي الاتجاه مع اثنين من لوحات قياس الألومنيوم على كتلتين من الألومنيوم. يتم التحكم في درجات حرارة كتل الألومنيوم عن طريق تعميم المياه من اثنين من حمامات المياه. (ب) ترتيب كتل الألومنيوم الثلاثة وحمامات المياه ولوحة الألومنيوم (250 × 220 ملم) لتدرج ثنائي الاتجاه. ترتبط الكتل اليسرى واليمينية بنفس حمام الماء ويتصل المبنى الأوسط بحمام مائي آخر. يتم تغليف لوحة فحص الألومنيوم بشريط لتشكيل جدار 10 ملم لاحتواء 1٪ agarose. (ج) مواقع للتحقق من درجات الحرارة (المشار إليها بالنقاط) وإطلاق اليرقات على اللوحة. قبل بدء التجربة، تحقق من درجة الحرارة عند نقطتين داخل كل منطقة للتأكد من أن تدرج درجة الحرارة الخطية المطلوبة يتم تأسيسه. يتم إطلاق اليرقات داخل المنطقة المشار إليها بالقرب من خط الوسط. يتم احتساب اليرقات داخل كل منطقة من المناطق التي يبلغ حجمها 2 سم. (D) مواقع للتحقق من درجات الحرارة (المشار إليها بالنقاط) ومناطق إطلاق اليرقات على تدرج ثنائي الاتجاه. يتم إطلاق عدد متساو من اليرقات على طول الخط الوسطي لكل نصف من التدرج ثنائي الاتجاه. يتم حساب أعداد اليرقات في كل منطقة من المناطق العشر (2 سم). يشار إلى مجموعة نموذجية واحدة من درجات الحرارة (18 درجة مئوية -26 درجة مئوية) على سطح الآغاروز. (ه) درجات الحرارة المقاسة على طول خطوط الحدود والخطوط الوسطى لكل منطقة في نموذج تدرج أحادي الاتجاه. تمثل البيانات متوسط درجات الحرارة ± SD. n = 8 مقايسات (150 ± 50 يرقة / فحص). وتستنسخ أجزاء من هذا الرقم من سوكابي وآخرين مع تعديلات طفيفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تدرج درجة الحرارة على لوحة الآغاروز (المنحدر)	درجات حرارة حمامات المياه	درجات حرارة كتل الألومنيوم
10.0-25.0 درجة مئوية (1.5 درجة مئوية/سم)	~6.5-7°C/~28.5°C	~ 8.5 درجة مئوية / ~ 26.8 درجة مئوية
18.0-28.0 درجة مئوية (1 درجة مئوية/سم)	~ 16.8 درجة مئوية / ~ 31.0 درجة مئوية	~ 17.8 درجة مئوية / ~ 29.7 درجة مئوية
14.0-34.0 درجة مئوية (2 درجة مئوية/سم)	~ 10.0 درجة مئوية / ~ 40.0 درجة مئوية	~ 11.8 درجة مئوية / ~ 36.8 درجة مئوية
12.5-42.0 درجة مئوية (2.95 درجة مئوية/سم)	~ 7.0 درجة مئوية / ~ 55.0 درجة مئوية	~ 9.4 درجة مئوية / ~ 49.4 درجة مئوية

الجدول 1: تدرجات درجات الحرارة النموذجية ودرجات الحرارة المقابلة لحمامات المياه وكتل الألومنيوم للتدرجات الاتجاهية الواحدة.

تدرج درجة الحرارة على لوحة الآغاروز	درجات حرارة حمامات المياه	درجات حرارة كتل الألومنيوم
22-10-22 درجة مئوية (1.5 درجة مئوية/سم)	~ 5.0 درجة مئوية / ~ 25.0 درجة مئوية	~ 7.5 درجة مئوية / ~ 24.0 درجة مئوية
26-18-26 درجة مئوية (1 درجة مئوية/سم)	~ 15.8 درجة مئوية / ~ 30.6 درجة مئوية	~ 16.9 درجة مئوية / ~ 28.4 درجة مئوية
30-14-30 درجة مئوية (2 درجة مئوية/سم)	~ 8.5 درجة مئوية / ~ 36.4 درجة مئوية	~ 10.9 درجة مئوية / ~ 32.8 درجة مئوية
36-12.5-36 درجة مئوية (2.95 درجة مئوية/سم)	~ 5.0 درجة مئوية / ~ 47.2 درجة مئوية	~ 7.9 درجة مئوية / ~ 40.9 درجة مئوية

الجدول 2: تدرجات درجات الحرارة النموذجية ودرجات الحرارة المقابلة لحمامات المياه وكتل الألومنيوم للتدرجات ثنائية الاتجاه.

عمر اليرقات (AEL)	وقت الفحص (اتجاه واحد)	وقت المقايسة (ثنائي الاتجاه)
24 ساعة	30 دقيقة	35 دقيقة
48 ساعة	22 دقيقة	27 دقيقة
72 ساعة	16 دقيقة	21 دقيقة
96 ساعة	13 دقيقة	18 دقيقة
120 ساعة	10 دقائق	15 دقيقة

الجدول 3: أعمار اليرقات المختلفة (AEL) وأوقات الفحص المقابلة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124