Sıcaklık Gradyan Testi: Drosophila Larvalarında Sıcaklık Tercihini Test Etmek İçin Bir Yöntem

Overview

Drosophila meyve sinekleri sıcaklıktaki küçük değişiklikleri ayırt edebilir ve bu nedenle uygun termal koşullara sahip ortamları seçebilir. Bu video, Drosophila larvalarının sıcaklık tercihini doğrusal bir termal gradyan üzerinde test eden davranışsal bir testi açıklar.

Protocol

Bu protokol Liu ve ark.'dan bir alıntıdır. Drosophila Larvalarının Termal Tercihlerini Belirlemek için Sıcaklık Gradyan Tahlili, J. Vis. Exp. (2018).

1. Sıcaklık Gradyan Kurulumu

1. Tek yönlü degrade hazırlama
   1. Tahliller sırasında nemli bir ortam ortamı oluşturmak için, iki su banyosuna bağlı iki alüminyum bloğu 10 cm (Şekil 1A)ile ayrılmış ıslak kağıt havlularayerleştirin.
   2. Alüminyum blokların sıcaklığının dengelenebilmesi için yeterli zaman tanımak için tahlil başlatmadan önce iki su banyoyu ~2 saat açın.
      NOT: İstenilen doğrusal sıcaklık gradyanını elde etmek için gereken her su banyosunun sıcaklığını belirlemek için sahte bir deney yapılması önerilir. Su banyolarını ayarlamak için bazı tipik sıcaklık çiftleri Tablo 1'delistelenmiştir. Bununla birlikte, yüzey sıcaklıklarının ortam sıcaklığından etkilendiğini unutmayın. Tüplerde soğutma olduğu için boru uzunluğu da sıcaklıkları etkiler. Kurulumumuzdaki boru uzunluğu 1,5 m'dir.
   3. Mikrodalga 100 mL% 1 agarose yüksek güç ayarında 500 mL yuvarlak geniş ağız şişesinde ve 25 mL / tahlil plakasını düz bir tezgah üzerine dökün. Alüminyum bloklara aynı anda yerleştirilebilen iki tahlil plakası hazırlayın (Şekil 1A).
   4. Agarose katılaştıktan sonra (10-20 dk), agarose yüzeyini hafifçe kaba hale getirmek için her bir agarose yüzeyini standart bir mutfak süngeri veya bir melamin süngeri ile hafifçe ovalayın, böylece agarose jeline su püskürtürken pürüzsüz bir ince su zarı oluşturulur ve su damlacıkları oluşmaz.
   5. Plakaların kurumasını önlemek için test yapılmaya hazır olana kadar plakaları damıtılmış su ile bir kaba tamamen batırın.
2. Çift yönlü degrade hazırlama (isteğe bağlı)
   1. Tahliller sırasında nemli bir ortam ortamı oluşturmak için ıslak kağıt havluların üzerine 8 cm arayla üç alüminyum blok (Şekil 1B)yerleştirin.
   2. Alüminyum blokların sıcaklığının dengelenebilmesi için yeterli zaman tanımak için tahlil başlatmadan önce iki su banyoyu ~2 saat açın.
      NOT: İki yönlü gradyan için her su banyosunun sıcaklığını belirlemek için sahte bir deney yapılması önerilir. Su banyolarını ayarlamak için bazı tipik sıcaklık çiftleri Tablo 2'delistelenmiştir. Bununla birlikte, yüzey sıcaklıklarının ortam sıcaklığından etkilendiğini unutmayın. Tüplerde soğutma olduğu için boru uzunluğu da sıcaklıkları etkiler. Kurulumumuzdaki boru uzunluğu 1,5 m'dir.
   3. Agarose'un plakadan dökülmesini önlemek için, alüminyum plakanın kenarlarını 10 mm yüksekliğinde bir duvar oluşturmak için etiketleme bandı ile sarın (Şekil 1B).
   4. Yüksek güç ayarını kullanarak, mikrodalga 500 mL yuvarlak geniş ağız şişesinde% 1 agarose 200 mL ve bir test plakasına 120 mL dökün.
   5. Agarose katılaştıktan sonra (~ 30 dk), agarose yüzeyini hafifçe kaba hale getirmek için her agarose yüzeyini standart bir mutfak süngeri veya bir melamin süngeri ile hafifçe ovalayın, böylece agarose jeline su püskürtürken pürüzsüz bir ince su zarı oluşturulur ve su damlacıkları oluşmaz.
   6. Test plakalarını, kurumasını önlemek için test yapılmaya hazır olana kadar damıtılmış su ile bir kaba tamamen batırın.
3. Tek yönlü degrade ayarlama
   1. Reaktifleri ve öğeleri degrade test cihazının yanındaki bir bankta hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Verimli sıcaklık transferini teşvik etmek için, bloklar ve plaka arasındaki arayüze su püskürterek alüminyum bloklar ve test plakaları arasındaki boşlukları doldurun.
   3. Eldiven kullanarak, test plakalarını su kabından çıkarın. Su agarose jel ve plaka arasında istila ederse ve yüzeyde çarpmaların oluşmasına neden olursa, suyu bir P1000 mikropipette ile çıkarın.
   4. Test plakalarını alüminyum blokların üzerine yerleştirin, böylece her iki kenardan 2 cm uzaklıktaki sınırlayıcılar alüminyum blokların kenarlarıyla tam olarak eşleşir (Şekil 1A,C).
   5. Agarose jelinin kurumasını önlemek için plakanın yüzeyine su püskürtün (agarose yüzeyini kaplayan ince bir su zarı yeterlidir). Larvalar su damlacıklarına hapsolabildiğinden su zarının sürekli ve su damlacıklarından arındırılmış olduğundan emin olun.
   6. Su buharlaşmasını azaltmak ve jel yüzeyinin sıcaklığını dengelemeye yardımcı olmak için degrade sistemini bir karton kutu ile örtün. Sıcaklığın dengeyi sağlaması için 5-10 dakika bekleyin.
   7. Plaka üzerinde 12 noktada yüzey sıcaklığını kontrol edin(Şekil 1C). Bir bölge içinde değişkenlik olup olmadığını belirlemek için her bölge içinde iki ölçüm alın. Her iki noktadaki sıcaklığın istenen sıcaklığın ± 0,2 °C içinde olduğundan emin olun.
      NOT: Bir bölge içindeki değişkenlik genellikle iki noktanın alüminyum blokların kenarına olan tam mesafeleri aynı olmadığından oluşur. Her iki kenardan 2 cm uzaklıktaki sınırlayıcıların alüminyum blokların kenarlarıyla tam olarak eşleştiğından emin olmak için plakanın alüminyum bloklar üzerindeki konumunu ayarlayın.
   8. Ölçülen sıcaklık gradyanı istenen degradeden sapıyorsa, su banyosu sıcaklık ayarlarını artırın veya azaltın ve su banyolarının sıcaklığı stabilize edildikten sonra yüzey sıcaklığını yeniden kontrol edin.
   9. Teste başlayana kadar degrade sistemini bir karton kutu ile örtün.
4. Çift yönlü degradeyi ayarlama (isteğe bağlı)
   1. Reaktifleri ve öğeleri degrade test cihazının yanındaki bir bankta hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Yüzeyler arasındaki boşlukları doldurarak alüminyum bloklardan test plakalarına verimli sıcaklık transferini teşvik etmek için üç alüminyum bloğun yüzeylerine su püskürtün.
   3. Test plakalarını su kabından dikkatlice çıkarın ve alüminyum blokların üzerine yerleştirin. Su, yüzeyde çarpmalara neden olabilecek agarose jel ve plaka arasında istila ederse, suyu bir P1000 mikropipette ile çıkarın.
   4. Test plakasını alüminyum blokların üzerine yerleştirin, böylece her iki kenardan ilk ve son bölgelerin orta çizgileri iki yan alüminyum bloğun kenarlarıyla tam olarak eşleşir (Şekil 1B,D).
   5. Agarose jelinin kurumasını önlemek için plakanın yüzeyine su püskürtün (agarose yüzeyini kaplayan ince bir su zarı yeterlidir). Su zarının sürekli ve su damlacıklarından arındırılmış olduğundan emin olun, çünkü larvalar su damlacıklarına hapsolabilir.
   6. Su buharlaşmasını azaltmak ve jel yüzeyinin sıcaklığını dengelemeye yardımcı olmak için degrade sistemini bir karton kutu ile örtün. Sıcaklığın dengelenebilmesi için 5-10 dakika bekleyin.
   7. 10 bölgenin her birinin orta çizgisi boyunca iki noktada yüzey sıcaklığını kontrol edin(Şekil 1D). Bir bölge içinde değişkenlik olup olmadığını belirlemek için her bölge içinde iki ölçüm alın. Her iki noktadaki sıcaklığın istenen sıcaklığın ± 0,2 °C içinde olduğundan emin olun.
      NOT: Bir bölge içindeki değişkenlik genellikle iki noktanın alüminyum blokların kenarına olan tam mesafeleri aynı olmadığından oluşur. Her kenara en yakın ilk ve son bölgelerin orta çizgilerinin iki yan alüminyum bloğun kenarlarıyla tam olarak eşleştiğından emin olmak için plakanın alüminyum bloklar üzerindeki konumunu ayarlayın.
   8. Ölçülen sıcaklık gradyanı istenen degradeden sapıyorsa, su banyosu sıcaklık ayarlarını ayarlayın ve su banyolarının sıcaklığı stabilize edildikten sonra yüzey sıcaklığını yeniden kontrol edin.
   9. Test başlayana kadar blokları bir karton kutu ile örtün.

2. Tahlil ve Hesaplama

1. Karton kutuyu çıkarın ve larvaları plakaya aktarmadan hemen önce jel yüzey sıcaklığını kontrol edin. Sıcaklık dengesini bozmak için karton kutunun açık olduğu süreyi en aza indirin. Yüzey kuruysa, yüzeye az miktarda su püskürtün.
2. Tek yönlü degrade (serbest bırakma bölgesi) için her plakanın merkezine (6 bölgeden 3 ve 4 bölgeleri arasında) yakın 150 ± 50 larva dağıtın; Şekil 1C).
   NOT: Çift yönlü gradyan için, her yarının orta bölgesi boyunca 200-400 larva dağıtın (Şekil 1D).
3. Larvaların sürünerek çıkmasını önlemek için her test plakasının üzerine bir mikro plaka kapağı yerleştirin. Agarose jel üzerinde larva seçimini etkileyebilecek ışığa maruz kalmayı önlemek için kurulumu bir karton kutu ile örtün.
   NOT: Çift yönlü gradyan için, plakayı bir kapakla örtmek gerekli olmamalıdır, çünkü plaka daha büyüktür ve larvaların tercih edilen sıcaklığı orta bölgededir. Sonuç olarak, kenarlarda az sayıda larva birikir ve sürünerek çıkma fırsatına sahiptir.
4. Tahlilin tek yönlü gradyan için 10-30 dakika ve larvaların yaşına bağlı olarak çift yönlü gradyan için 15-35 dakika devam etmesine izin verin(Tablo 3).
5. Karton kutuyu ve mikro plaka kapağını çıkarın. Dijital kamera kullanarak plakaları yukarıdan fotoğraflayın. Araştırmacının analiz için daha iyi kontrast ve parlaklığa sahip olanı seçebilmesi için her test plakasının iki fotoğrafını çekin.
6. Tüm larvaları test plakalarından ve plakaların dışındaki herhangi bir yerden aspirasyonla çıkarın.
7. Tahlil plakalarını, tüpleri ve hücre süzgecini damıtılmış suyla iyice temizleyin. Agarose yüzeyi zarar görmediği sürece o gün hazırlanan tahlil plakalarını tekrar kullanın.
8. Her bölgedeki larvaların yüzde dağılımını hesaplayın.
   1. Görüntüye işaret eklemeye izin veren herhangi bir yazılım kullanarak test sonuçlarının fotoğraf görüntüsünü açın. Test bölgelerini belirtmek için, test plakasındaki sınırlara göre her 2 cm'de bir dikey çizgiler çizin.
   2. Her bölgedeki larva sayısını sayın ve sayıları kaydedin. Duvarların herhangi birinden 0,5 cm uzaklıktaki bölgelerde larvaları sayma. Jel duvarların yakınında daha kalındır ve yüzey sıcaklıkları bu bölgelerde doğrusal değildir.
   3. Tek yönlü degrade için, her bölgedeki yüzde dağılımını aşağıdaki gibi hesaplayın:
      (belirli bir 2 cm'lik bölgedeki larva sayısı)/ (6 bölgedeki toplam larva sayısı) x 100.
   4. Çift yönlü degrade için, her bölgedeki yüzde dağılımını aşağıdaki gibi hesaplayın:
      (belirli bir 2 cm'lik bölgedeki larva sayısı)/ (degradenin her iki tarafındaki 5 bölgedeki toplam larva sayısı) x 100.

Representative Results

Şekil 1: Tek ve çift yönlü degrade test kurulumları. (A) İki alüminyum blok üzerinde iki alüminyum test plakası ile tek yönlü gradyan kurulumu. Alüminyum blokların sıcaklıkları, iki su banyosundan gelen suyun sirkülasyonu ile kontrol edilir. (B) Üç alüminyum bloğun, su banyolarının ve alüminyum plakanın (250 x 220 mm) çift yönlü gradyan için düzenlenmesi. Sol ve sağ bloklar aynı su banyosuna, orta blok ise diğer su banyosuna bağlanır. Alüminyum test plakası, % 1 agarose'yi içerecek şekilde 10 mm'lik bir duvar oluşturmak için bantla sarılır. (C) Sıcaklıkları kontrol etmek (noktalarla gösterilen) ve tabakta larvaları serbest bırakmak için konumlar. Bir deney başlatmadan önce, istenen doğrusal sıcaklık gradyaninin kurulduğunu onaylamak için her bölgedeki iki noktadaki sıcaklığı kontrol edin. Larvalar, orta çizgiye yakın belirtilen alanda salınr. Larvalar 2 cm'lik bölgelerin her birinde sayılır. (D) İki yönlü bir degrade üzerinde larvalar için sıcaklıkları (noktalarla gösterilen) ve salınım bölgelerini kontrol etmek için konumlar. İki yönlü gradyanın her yarısının orta çizgisi boyunca eşit sayıda larva salınır. Larvaların sayısı 10 (2 cm) bölgelerin her birinde sayılır. Agarose yüzeyinde tipik bir sıcaklık kümesi (18 °C-26 °C) belirtilir. (E) Her bölgenin sınır çizgileri ve orta çizgileri boyunca ölçülen sıcaklıklar tek yönlü örnek bir degradede ölçülür. Veriler ortalama sıcaklıkları temsil ± SD. n = 8 tahlil (150 ± 50 larva/tahlil). Bu figürün bazı kısımları sokabe ve ark. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Agarose plakasında sıcaklık gradyani (eğim)	Su banyolarının sıcaklıkları	Alüminyum blokların sıcaklıkları
10,0-25,0°C (1,5°C/cm)	~6,5-7°C/~28,5°C	~8,5°C/~26,8°C
18,0-28,0°C (1°C/cm)	~16,8°C/~31,0°C	~17,8°C/~29,7°C
14,0-34,0°C (2°C/cm)	~10,0°C/~40,0°C	~11,8°C/~36,8°C
12,5-42,0°C (2,95°C/cm)	~7,0°C/~55,0°C	~9,4°C/~49,4°C

Tablo 1: Tipik sıcaklık gradyanları ve tek yönlü degradeler için su banyolarının ve alüminyum blokların karşılık gelen sıcaklıkları.

Agarose plakasında sıcaklık gradyani	Su banyolarının sıcaklıkları	Alüminyum blokların sıcaklıkları
22-10-22°C (1,5°C/cm)	~5,0°C /~25,0°C	~7,5°C/~24,0°C
26-18-26°C (1°C/cm)	~15,8°C /~30,6°C	~16,9°C/~28,4°C
30-14-30°C (2°C/cm)	~8,5°C /~36,4°C	~10,9°C/~32,8°C
36-12,5-36°C (2,95°C/cm)	~5,0°C /~47,2°C	~7,9°C/~40,9°C

Tablo 2: Tipik sıcaklık gradyanları ve iki yönlü gradyanlar için su banyolarının ve alüminyum blokların karşılık gelen sıcaklıkları.

Larva yaşı (AEL)	Tahlil süresi (tek yönlü)	Tahlil zamanı (çift yönlü)
24 saat	30 dk	35 dk
48 saat	22 dk	27 dk
72 saat	16 dk	21 dk
96 saat	13 dk	18 dk
120 saat	10 dk	15 dk

Tablo 3: Farklı larva yaşları (AEL) ve ilgili test süreleri.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124