Overview
Дрозофила плодовых мушек может различать небольшие изменения температуры и, следовательно, выбрать среды с благоприятными тепловыми условиями. Это видео описывает поведенческий анализ, который проверяет температурные предпочтения личинок дрозофилы на линейном тепловом градиенте.
Protocol
Этот протокол является выдержкой из Лю и др. Оценка температуры для определения тепловых предпочтений Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2018).
1. Установка градиента температуры
- Подготовка однона направление градиента
- Для создания влажной окружающей среды во время анализа поместите два алюминиевых блока, соединенных с двумя водяными ваннами, на мокрые бумажные полотенца, разделенные на 10 см(рисунок 1A).
- Включите две водяные ванны 2 ч до начала анализа, чтобы дать достаточно времени для того, чтобы температура алюминиевых блоков была равновесной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется провести макет эксперимента по определению температуры каждой водяной ванны, необходимой для достижения желаемого линейного температурного градиента. Некоторые типичные пары температуры для того чтобы установить ванны воды перечислены в таблице 1. Однако обратите внимание, что температура поверхности зависит от температуры окружающей среды. Длина труб также влияет на температуру, как есть охлаждение в трубах. Длина труб в нашей установке составляет 1,5 м. - Микроволновая печь 100 мл 1% агарозы при высокой мощности настройки в 500 мл круглый широко рот бутылку и залить 25 мл / анализ пластины на уровне скамейке. Подготовь две анализные пластины, которые можно разместить на алюминиевых блоках одновременно(рисунок 1A).
- После того, как агароза затвердевает (10-20 мин), аккуратно протрите каждую поверхность агарозы стандартной кухонной губкой или меламиновой губкой, чтобы сделать поверхность агарозы слегка грубой, так что при распылении воды на агарозном геле будет создана гладкая тонкая водяная мембрана, и никакие капли воды не образуются.
- Полностью погрузите пластины в контейнер с дистиллированной водой до тех пор, пока анализ не будет готов к исполнению, чтобы предотвратить высохать пластин.
- Подготовка двунаправленного градиента (по желанию)
- Чтобы создать влажную окружающую среду во время анализа, поместите три алюминиевых блока на 8 см друг от друга(рисунок 1B) на мокрые бумажные полотенца.
- Включите две водяные ванны 2 ч до начала анализа, чтобы дать достаточно времени для того, чтобы температура алюминиевых блоков была равновесной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется провести макет эксперимента по определению температуры каждой водяной ванны для двунаправленного градиента. Некоторые типичные пары температуры для того чтобы установить ванны воды перечислены в таблице 2. Однако обратите внимание, что температура поверхности зависит от температуры окружающей среды. Длина труб также влияет на температуру, как есть охлаждение в трубах. Длина труб в нашей установке составляет 1,5 м. - Чтобы агароза не вылилась из пластины, оберните края алюминиевой пластины лентой для маркировки, чтобы сформировать стену высотой 10 мм(рисунок 1B).
- Используя высокую мощность настройки, микроволновая печь 200 мл 1% агарозы в 500 мл круглый широко рт бутылку и залить 120 мл на анализ пластины.
- После того, как агароза затвердевает (30 мин), аккуратно протрите каждую поверхность агарозы стандартной кухонной губкой или меламиновой губкой, чтобы сделать поверхность агарозы слегка грубой, так что при распылении воды на агарозном геле создается гладкая тонкая водяная мембрана и не образуются капли воды.
- Полностью погрузите анализные пластины в контейнер с дистиллированной водой до тех пор, пока анализ не будет готов к исполнению, чтобы предотвратить их высыхание.
- Настройка однона направление градиента
- Подготовка реагентов и предметов на скамейке рядом с градиентным аппаратом анализа (см. таблицу материалов).
- Для содействия эффективной передаче температуры, заполнить любые пробелы между алюминиевыми блоками и анализ пластин путем распыления воды на стыке между блоками и пластины.
- Используя перчатки, удалите анализные пластины из контейнера с водой. Если вода вторгается между гелем агарозы и пластиной и вызывает шишки, чтобы сформировать на поверхности, удалить воду с P1000 микропайп.
- Поместите анализ пластин на алюминиевые блоки так, что демаркации, которые 2 см от любого края точно соответствуют краям алюминиевых блоков (Рисунок 1A,C).
- Спрей воды на поверхность пластины (тонкая мембрана воды, покрывающая поверхность агарозы достаточно), чтобы предотвратить агарозовый гель от высыхания. Убедитесь, что мембрана воды непрерывна и не имеет капель воды, так как личинки могут попасть в ловушку капель воды.
- Обложка градиентной системы с картонной коробкой, чтобы уменьшить испарение воды и помочь стабилизировать температуру поверхности геля. Подождите 5-10 минут, чтобы температура была равновесной.
- Проверьте температуру поверхности в 12 точках на пластине(рисунок 1C). Возьмите два измерения в каждой зоне, чтобы установить, есть ли изменчивость в пределах зоны. Убедитесь, что температура в обоих местах находится ± пределах 0,2 градуса по Цельсию от желаемой температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вариативность в пределах зоны обычно происходит потому, что точные расстояния двух пятен до края алюминиевых блоков не идентичны. Отрегулируйте положение пластины на алюминиевых блоках, чтобы убедиться, что демаркации, которые 2 см от любого края точно соответствуют краям алюминиевых блоков. - Если измеренный градиент температуры отклоняется от желаемого градиента, увеличьте или уменьшите температуру водяной ванны (ы) и перепроверьте температуру поверхности после того, как температура водяной ванны (ы) стабилизируется (ы).
- Обложка градиентной системы с картонной коробкой до начала анализа.
- Настройка двухнаправленного градиента (по желанию)
- Подготовка реагентов и предметов на скамейке рядом с градиентным аппаратом анализа (см. таблицу материалов).
- Спрей воды на поверхностях трех алюминиевых блоков для содействия эффективной передачи температуры от алюминиевых блоков на анализ пластин, заполнив любые пробелы между поверхностями.
- Снимите анализные пластины тщательно из контейнера с водой и поместите на алюминиевые блоки. Если вода вторгается между гель агарозы и пластины, которые могут вызвать шишки, чтобы сформировать на поверхности, удалить воду с P1000 микропайп.
- Поместите анализ пластины на алюминиевые блоки так, что средние линии первой и последней зон от любого края точно совпадают края двух боковых алюминиевых блоков (Рисунок 1B,D).
- Спрей воды на поверхность пластины (тонкая мембрана воды, покрывающая поверхность агарозы достаточно), чтобы предотвратить агарозовый гель от высыхания. Убедитесь, что мембрана воды непрерывна и свободна от капель воды, так как личинки могут попасть в ловушку капель воды.
- Обложка градиентной системы с картонной коробкой, чтобы уменьшить испарение воды и помочь стабилизировать температуру поверхности геля. Подождите 5-10 мин, чтобы температура была равновесной.
- Проверьте температуру поверхности в двух точках вдоль средней линии каждой из 10 зон(рисунок 1D). Возьмите два измерения в каждой зоне, чтобы установить, есть ли изменчивость в пределах зоны. Убедитесь, что температура в обоих местах находится ± пределах 0,2 градуса по Цельсию от желаемой температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вариативность в пределах зоны обычно происходит потому, что точные расстояния двух пятен до края алюминиевых блоков не идентичны. Отрегулируйте положение пластины на алюминиевых блоках, чтобы убедиться, что средние линии первой и последней зон, ближайших к каждому краю, точно соответствуют краям двух боковых алюминиевых блоков. - Если измеренный градиент температуры отклоняется от желаемого градиента, отрегулируйте температуру водяной ванны (ы) и перепроверьте температуру поверхности после стабилизации температуры водяной ванны (ы).
- Обложка блоков с картонной коробкой до начала анализа.
2. Анализ и расчет
- Удалите картонную коробку и проверьте температуру поверхности геля непосредственно перед передачей личинок на тарелку. Свести к минимуму время, что картонная коробка открыта для предотвращения нарушения равновесия температуры. Если поверхность сухая, распылите небольшое количество воды на поверхность.
- Распределение 150 ± 50 личинок вблизи центра каждой пластины (между зонами 3 и 4 из 6 зон) для однона направление градиента (зона высвобождения; Рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для двунаправленного градиента распределите 200-400 личинок вдоль средней зоны каждой половины(рисунок 1D). - Поместите крышку микроплюса над каждой анализной пластиной, чтобы личинки не выползли. Обложка установки с картонной коробкой для предотвращения воздействия света, которые могут повлиять на выбор личинки на агарозы гель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для двунаправленного градиента не обязательно покрывать пластину крышкой, так как пластина больше, а предпочтительная температура личинок находится в средней зоне. Следовательно, несколько личинок накапливаются по краям и имеют возможность выползти. - Разрешить анализ продолжать в течение 10-30 мин для однонаправленного градиента, и в течение 15-35 мин для двунаправленного градиента, в зависимости от возраста личинок (Таблица 3).
- Снимите картонную коробку и крышку микроплюа. Фотография пластин сверху с помощью цифровой камеры. Сделай две фотографии каждой анализной пластины, чтобы следователь выбрал ее с лучшим контрастом и яркостью для анализа.
- Удалите все личинки из анализных пластин и в любом месте за пределами пластин стремлением.
- Очистите анализные пластины, трубки и клеточный ситечко с дистиллированной водой. Повторное использование анализных пластин, подготовленных в тот день, если поверхность агарозы не повреждена.
- Рассчитайте процентное распределение личинок в каждой зоне.
- Откройте фотографическое изображение результатов анализа с помощью любого программного обеспечения, которое позволяет добавлять маркировку на изображение. Чтобы указать зоны анализа, нарисуйте вертикальные линии каждые 2 см на основе демаркаций на анализной пластине.
- Подсчитайте количество личинок в каждой зоне и замитмийте их количество. Не подсчитывайте личинки в регионах 0,5 см от любой из стен. Гель толще возле стен, и температура поверхности не являются линейными в этих регионах.
- Для однона направление градиента вычислите процентное распределение в каждой зоне следующим образом:
(количество личинок в данной 2-сантиметровой зоне)/ (общее количество личинок в 6 зонах) x 100. - Для двухнаправленного градиента вычислите процентное распределение в каждой зоне следующим образом:
(количество личинок в данной 2-сантиметровой зоне)/ (общее количество личинок в 5 зонах по обе стороны градиента) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1: Однонаправленные и двунаправленные установки анализа градиентов. (A) Однонаправлениюная градиентная установка с двумя алюминиевыми анализными пластинами на двух алюминиевых блоках. Температура алюминиевых блоков контролируется циркулирующей водой из двух водяных ванн. b) расположение трех алюминиевых блоков, водяных ванн и алюминиевой пластины (250 х 220 мм) для двунаправленного градиента. Левый и правый блоки соединены с одной и той же водяной баней, а средний блок соединен с другой водяной баней. Алюминиевая анализная пластина обернута лентой, чтобы сформировать 10-мм стену, чтобы содержать 1% агарозу. (C) Позиции для проверки температуры (указанной точками) и высвобождения личинок на тарелку. Прежде чем инициировать эксперимент, проверьте температуру в двух точках в каждой зоне, чтобы подтвердить, что установлен желаемый линейный температурный градиент. Личинки высвобождаются в указанной области вблизи средней линии. Личинки учитываются в каждой из 2-сантиметровых зон. (D) Позиции для проверки температур (указанных точками) и зоны высвобождения личинок на двунаправленном градиенте. Равное количество личинок высвобождается вдоль средней линии каждой половины двунаправленного градиента. Количество личинок подсчитывается в каждой из 10 (2 см) зон. Показан один типичный набор температур (18 градусов по Цельсию) на поверхности агарозы. (E) Температура, измеряемая вдоль пограничных линий и средних линий каждой зоны в выборку однонавечных градиентов. Данные представляют средние температуры ± SD. n No 8 анализов (150 ± 50 личинок/анализов). Части этой фигуры воспроизводятся из Sokabe et al. с небольшими изменениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Температурный градиент на агарозной плите (наклон) | Температура водных ванн | Температура алюминиевых блоков |
| 10,0-25,0 градусов по Цельсию (1,5 градусов по Цельсию/см) | 6,5-7 градусов по Цельсию/28,5 градусов по Цельсию | 8,5 градусов по Цельсию/26,8 градусов по Цельсию |
| 18,0-28,0 градусов по Цельсию (1 градус по Цельсию/см) | 16,8 градусов по Цельсию/31,0 градусов по Цельсию | 17,8 градусов по Цельсию/ 29,7 градусов по Цельсию |
| 14,0-34,0 градусов по Цельсию (2 градуса по Цельсию/см) | 10,0 градусов по Цельсию/40,0 градусов по Цельсию | 11,8 градусов по Цельсию/36,8 градусов по Цельсию |
| 12,5-42,0 градусов по Цельсию (2,95 градусов по Цельсию/см) | 7,0 градусов по Цельсию/55,0 градусов по Цельсию | 9,4 градуса по Цельсию/49,4 градусов по Цельсию |
Таблица 1: Типичные температурные градиенты и соответствующие температуры водяных ванн и алюминиевых блоков для однонауходного градиента.
| Температурный градиент на агарозной пластине | Температура водных ванн | Температура алюминиевых блоков |
| 22-10-22 градусов по Цельсию (1,5 градусов по Цельсию/см) | 5,0 градусов по Цельсию / 25,0 градусов по Цельсию | 7,5 градусов по Цельсию/24,0 градусов по Цельсию |
| 26-18-26 градусов по Цельсию (1 градус по Цельсию/см) | 15,8 градуса по Цельсию / 30,6 градусов по Цельсию | 16,9 градусов по Цельсию/28,4 градусов по Цельсию |
| 30-14-30 градусов по Цельсию (2 градуса по Цельсию/см) | 8,5 градусов по Цельсию / 36,4 градусов по Цельсию | 10,9 градусов по Цельсию/32,8 градусов по Цельсию |
| 36-12,5-36 градусов по Цельсию (2,95 градусов по Цельсию/см) | 5,0 градусов по Цельсию / 47,2 градусов по Цельсию | 7,9 градусов по Цельсию/ 40,9 градусов по Цельсию |
Таблица 2: Типичные температурные градиенты и соответствующие температуры водяных ванн и алюминиевых блоков для двунаправленных градиентов.
| Возраст ларваля (AEL) | Время анализа (единое направление) | Время анализа (двунаправленное) |
| 24 ч | 30 мин. | 35 мин. |
| 48 ч | 22 мин. | 27 мин. |
| 72 ч | 16 мин. | 21 мин. |
| 96 ч | 13 мин. | 18 мин. |
| 120 ч | 10 мин. | 15 мин. |
Таблица 3: Различные возрасты личинок (AEL) и соответствующие времена анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 |
