Ensayo de gradiente de temperatura: un método para probar la preferencia de temperatura en larvas de Drosophila

Overview

Las moscas de la fruta drosophila pueden distinguir pequeños cambios de temperatura y, por lo tanto, seleccionar ambientes con condiciones térmicas favorables. Este video describe un ensayo conductual que prueba la preferencia de temperatura de las larvas de Drosophila en un gradiente térmico lineal.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Liu et al. Un ensayo de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila, J. Vis. Exp. (2018).

1. Configuración del gradiente de temperatura

1. Preparar gradiente monodireccional
   1. Para crear un ambiente húmedo durante los ensayos, coloque los dos bloques de aluminio conectados a dos baños de agua sobre toallas de papel mojado, separados por 10 cm(Figura 1A).
   2. Encienda los dos baños de agua ~2 h antes de iniciar el ensayo para dar suficiente tiempo para que la temperatura de los bloques de aluminio se equilible.
      NOTA: Se recomienda realizar un experimento simulado para determinar la temperatura de cada baño de agua que se necesita para lograr el gradiente de temperatura lineal deseado. Algunos pares de temperatura típicos para establecer los baños de agua se enumeran en la Tabla 1. Sin embargo, tenga en cuenta que las temperaturas superficiales se ven afectadas por la temperatura ambiente. La longitud del tubo también afecta a las temperaturas, ya que hay enfriamiento en los tubos. La longitud del tubo en nuestra configuración es de 1,5 m.
   3. Microondas 100 ml de 1% de agarose en el ajuste de alta potencia en una botella redonda de boca ancha redonda de 500 ml y vierta 25 ml/placa de ensayo en una sobremesa nivelada. Prepare dos placas de ensayo, que se pueden colocar en los bloques de aluminio al mismo tiempo(Figura 1A).
   4. Después de que la agarose se ha solidificado (10-20 min), frote suavemente cada superficie de agarose con una esponja de cocina estándar o una esponja de melamina para hacer que la superficie de la agarose sea ligeramente gruesa, de modo que al rociar agua en el gel de agarose, se creará una membrana de agua fina y suave, y no se formarán gotas de agua.
   5. Sumerja completamente las placas en un recipiente con agua destilada hasta que el ensayo esté listo para ser realizado para evitar que las placas se desecen.
2. Preparar un degradado bidireccional (opcional)
   1. Para crear un ambiente húmedo durante los ensayos, coloque tres bloques de aluminio a 8 cm de distancia(Figura 1B)en toallas de papel mojado.
   2. Encienda los dos baños de agua ~2 h antes de iniciar el ensayo para dar suficiente tiempo para que la temperatura de los bloques de aluminio se equilible.
      NOTA: Se recomienda realizar un experimento simulado para determinar la temperatura de cada baño de agua para el gradiente bidireccional. Algunos pares de temperatura típicos para establecer los baños de agua se enumeran en la Tabla 2. Sin embargo, tenga en cuenta que las temperaturas superficiales se ven afectadas por la temperatura ambiente. La longitud del tubo también afecta a las temperaturas, ya que hay enfriamiento en los tubos. La longitud del tubo en nuestra configuración es de 1,5 m.
   3. Para evitar que la agarose se derrame fuera de la placa, envuelva los bordes de la placa de aluminio con cinta adhesiva para formar una pared de 10 mm de altura (Figura 1B).
   4. Usando el ajuste de alta potencia, microondas 200 mL de 1% de agarose en una botella redonda de boca ancha de 500 ml y vierta 120 ml en una placa de ensayo.
   5. Después de que la agarose se ha solidificado (~30 min), frote suavemente cada superficie de agarose con una esponja de cocina estándar o una esponja de melamina para hacer que la superficie de la agarose sea ligeramente gruesa, de modo que al rociar agua en el gel de agarose, se crea una membrana de agua fina y suave y sin forma de gotas de agua.
   6. Sumerja completamente las placas de ensayo en un recipiente con agua destilada hasta que el ensayo esté listo para realizarse para evitar que se sequen.
3. Configurar un gradiente monodireccional
   1. Prepare reactivos y objetos en un banco junto al aparato de ensayo de degradado (consulte la Tabla de materiales).
   2. Para promover una transferencia de temperatura eficiente, llene cualquier hueco entre los bloques de aluminio y las placas de ensayo rociando agua en la interfaz entre los bloques y la placa.
   3. Con guantes, retire las placas de ensayo del recipiente de agua. Si el agua invade entre el gel de agarose y la placa y hace que se formen protuberancias en la superficie, retire el agua con un micropipette P1000.
   4. Coloque las placas de ensayo en los bloques de aluminio para que las demarcaciones que están a 2 cm de cada borde coincidan exactamente con los bordes de los bloques de aluminio(Figura 1A,C).
   5. Rocíe agua sobre la superficie de la placa (una membrana fina de agua que cubre la superficie de la agarose es suficiente) para evitar que el gel de agarose se seque. Asegúrese de que la membrana de agua esté continua y libre de gotas de agua, ya que las larvas pueden quedar atrapadas en gotas de agua.
   6. Cubra el sistema de gradiente con una caja de cartón para reducir la evaporación del agua y ayudar a estabilizar la temperatura de la superficie del gel. Espere 5-10 minutos para permitir que la temperatura se equilible.
   7. Compruebe la temperatura superficial en 12 puntos de la placa (Figura 1C). Tome dos mediciones dentro de cada zona para establecer si hay o no variabilidad dentro de una zona. Asegúrese de que la temperatura en ambos puntos está dentro ± 0.2 ° C de la temperatura deseada.
      NOTA: La variabilidad dentro de una zona suele ocurrir porque las distancias exactas de los dos puntos hasta el borde de los bloques de aluminio no son idénticas. Ajuste la posición de la placa en los bloques de aluminio para asegurarse de que las demarcaciones que están a 2 cm de cada borde coincidan exactamente con los bordes de los bloques de aluminio.
   8. Si el gradiente de temperatura medido se desvía del gradiente deseado, aumente o disminuya el ajuste de temperatura del baño de agua y vuelva a comprobar la temperatura superficial después de que la temperatura de los baños de agua se estabilice.
   9. Cubra el sistema de degradado con una caja de cartón hasta iniciar el ensayo.
4. Configurar degradado bidireccional (opcional)
   1. Prepare reactivos y objetos en un banco junto al aparato de ensayo de degradado (consulte la Tabla de materiales).
   2. Rocíe agua en las superficies de los tres bloques de aluminio para promover una transferencia eficiente de la temperatura de los bloques de aluminio a las placas de ensayo llenando cualquier hueco entre las superficies.
   3. Retire las placas de ensayo cuidadosamente del recipiente de agua y colóquelos en los bloques de aluminio. Si el agua invade entre el gel de agarose y la placa, lo que podría hacer que se formen protuberancias en la superficie, retire el agua con un micropipette P1000.
   4. Coloque la placa de ensayo en los bloques de aluminio para que las líneas medias de la primera y la última zonas de cualquiera de las bordes coincidan exactamente con los bordes de los dos bloques de aluminio laterales (Figura 1B,D).
   5. Rocíe agua sobre la superficie de la placa (una membrana fina de agua que cubre la superficie de la agarose es suficiente) para evitar que el gel de agarose se seque. Asegúrese de que la membrana del agua esté continua y libre de gotas de agua, ya que las larvas pueden quedar atrapadas en gotas de agua.
   6. Cubra el sistema de gradiente con una caja de cartón para reducir la evaporación del agua y ayudar a estabilizar la temperatura de la superficie del gel. Espere 5-10 minutos para permitir que la temperatura se equilible.
   7. Compruebe la temperatura superficial en dos puntos a lo largo de la línea media de cada una de las 10 zonas (Figura 1D). Tome dos mediciones dentro de cada zona para establecer si hay o no variabilidad dentro de una zona. Asegúrese de que la temperatura en ambos puntos está dentro ± 0.2 ° C de la temperatura deseada.
      NOTA: La variabilidad dentro de una zona suele ocurrir porque las distancias exactas de los dos puntos hasta el borde de los bloques de aluminio no son idénticas. Ajuste la posición de la placa en los bloques de aluminio para asegurarse de que las líneas medias de la primera y la última zonas más cercanas a cada borde coincidan exactamente con los bordes de los dos bloques de aluminio laterales.
   8. Si el gradiente de temperatura medido se desvía del gradiente deseado, ajuste los ajustes de temperatura del baño de agua y vuelva a comprobar la temperatura superficial después de que la temperatura de los baños de agua se estabilice.
   9. Cubra los bloques con una caja de cartón hasta el inicio del ensayo.

2. Ensayo y cálculo

1. Retire la caja de cartón y compruebe la temperatura de la superficie del gel inmediatamente antes de transferir las larvas a la placa. Minimice el tiempo que la caja de cartón está abierta para evitar interrumpir el equilibrio de temperatura. Si la superficie está seca, rocíe una pequeña cantidad de agua en la superficie.
2. Distribuir 150 ± 50 larvas cerca del centro de cada placa (entre las zonas 3 y 4 de las 6 zonas) para el gradiente monodireccional (zona de liberación; Figura 1C).
   NOTA: Para el gradiente bidireccional, distribuya 200-400 larvas a lo largo de la zona media de cada mitad (Figura 1D).
3. Coloque una tapa de microplaca sobre cada placa de ensayo para evitar que las larvas se arrastren. Cubra la configuración con una caja de cartón para evitar la exposición a la luz, lo que podría afectar la elección larvaria en el gel de agarose.
   NOTA: Para el gradiente bidireccional, no debe ser necesario cubrir la placa con una tapa, porque la placa es más grande, y la temperatura preferida de las larvas está en la zona media. En consecuencia, pocas larvas se acumulan en los bordes y tienen la oportunidad de arrastrarse.
4. Permita que el ensayo proceda durante 10-30 min para el gradiente monodireccional, y durante 15-35 min para el gradiente bidireccional, dependiendo de la edad de las larvas (Tabla 3).
5. Retire la caja de cartón y la tapa de la microplaca. Fotografie las placas desde arriba usando una cámara digital. Tome dos fotografías de cada placa de ensayo para que el investigador pueda elegir la que tiene mejor contraste y brillo para su análisis.
6. Retire todas las larvas de las placas de ensayo y en cualquier lugar fuera de las placas por aspiración.
7. Limpie bien las placas de ensayo, los tubos y el colador celular con agua destilada. Reutilice las placas de ensayo preparadas ese día a menos que la superficie de la agarose esté dañada.
8. Calcular la distribución porcentual de larvas en cada zona.
   1. Abra la imagen fotográfica de los resultados del ensayo utilizando cualquier software que permita añadir marcas a la imagen. Para indicar las zonas de ensayo, dibuje líneas verticales cada 2 cm en función de las demarcaciones de la placa de ensayo.
   2. Cuente el número de larvas en cada zona y registre los números. No cuente larvas en regiones a 0,5 cm de ninguna de las paredes. El gel es más grueso cerca de las paredes, y las temperaturas superficiales no son lineales en estas regiones.
   3. Para el degradado de una sola dirección, calcule la distribución porcentual en cada zona de la siguiente manera:
      (número de larvas en una zona dada de 2 cm)/ (número total de larvas en 6 zonas) x 100.
   4. Para el degradado bidireccional, calcule la distribución porcentual en cada zona de la siguiente manera:
      (número de larvas en una zona dada de 2 cm)/ (número total de larvas en 5 zonas a cada lado del gradiente) x 100.

Representative Results

Figura 1: Configuraciones de ensayo de degradado simples y bidireccionales. (A) Configuración de gradiente monodireccional con dos placas de ensayo de aluminio en dos bloques de aluminio. Las temperaturas de los bloques de aluminio se controlan circulando por el agua circulante desde dos baños de agua. (B) La disposición de los tres bloques de aluminio, baños de agua y una placa de aluminio (250 x 220 mm) para un gradiente bidireccional. Los bloques izquierdo y derecho están conectados al mismo baño de agua y el bloque central está conectado al otro baño de agua. La placa de ensayo de aluminio se envuelve con cinta adhesiva para formar una pared de 10 mm para contener el 1% de agarose. (C) Posiciones para comprobar las temperaturas (indicadas por puntos) y para liberar larvas en la placa. Antes de iniciar un experimento, compruebe la temperatura en dos puntos dentro de cada zona para confirmar que se ha establecido el gradiente de temperatura lineal deseado. Las larvas se liberan dentro del área indicada cerca de la línea media. Las larvas se cuentan dentro de cada una de las zonas de 2 cm. (D) Posiciones para comprobar las temperaturas (indicadas por puntos) y las zonas de liberación de las larvas en un gradiente bidireccional. Un número igual de larvas se liberan a lo largo de la línea media de cada mitad del gradiente bidireccional. El número de larvas se cuenta en cada una de las 10 (2 cm) zonas. Se indica un conjunto típico de temperaturas (18 °C-26 °C) en la superficie de la agarose. (E) Temperaturas medidas a lo largo de las líneas de borde y líneas medias de cada zona en un degradado monodireccional de muestra. Los datos representan temperaturas medias ± SD. n = 8 ensayos (150 ± 50 larvas/ensayo). Partes de esta figura se reproducen de Sokabe et al. con ligeras modificaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gradiente de temperatura en placa de agarose (pendiente)	Temperaturas de los baños de agua	Temperaturas de bloques de aluminio
10.0-25.0°C (1.5°C/cm)	~6.5-7°C/~28.5°C	~8.5°C/~26.8°C
18.0-28.0°C (1°C/cm)	~16.8°C/~31.0°C	~17.8°C/~29.7°C
14.0-34.0°C (2°C/cm)	~10.0°C/~40.0°C	~11.8°C/~36.8°C
12.5-42.0°C (2.95°C/cm)	~7.0°C/~55.0°C	~9.4°C/~49.4°C

Tabla 1: Gradientes de temperatura típicos y las temperaturas correspondientes de los baños de agua y bloques de aluminio para gradientes direccionales individuales.

Gradiente de temperatura en placa de agarose	Temperaturas de los baños de agua	Temperaturas de bloques de aluminio
22-10-22°C (1,5 °C/cm)	~5.0°C /~25.0°C	~7.5°C/~24.0°C
26-18-26°C (1°C/cm)	~15.8°C /~30.6°C	~16.9°C/~28.4°C
30-14-30°C (2°C/cm)	~8.5°C /~36.4°C	~10.9°C/~32.8°C
36-12.5-36°C (2.95°C/cm)	~5.0°C /~47.2°C	~7.9°C/~40.9°C

Tabla 2: Gradientes de temperatura típicos y las temperaturas correspondientes de los baños de agua y bloques de aluminio para gradientes bidireccionales.

Edad larvaria (AEL)	Tiempo de ensayo (direccional único)	Tiempo de ensayo (bidireccional)
24 h	30 min	35 min
48 h	22 min	27 min
72 h	16 min	21 min
96 h	13 min	18 min
120 h	10 min	15 min

Tabla 3: Diferentes edades larvarias (AEL) y los tiempos de ensayo correspondientes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124