Temperaturgradientanalyse: En metode til at teste temperaturpræference i Drosophila Larver

Overview

Drosophila frugtfluer kan skelne mellem små temperaturændringer og derfor vælge miljøer med gunstige termiske forhold. Denne video beskriver en adfærdsmæssig analyse, der tester temperaturpræferencen for Drosophila larver på en lineær termisk gradient.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Liu et al. En temperaturgradientanalyse til bestemmelse af termiske præferencer for Drosophila Larver, J. Vis. Exp. (2018).

1. Opsætning af temperaturgradient

1. Forberede envejsforløb
   1. For at skabe et fugtigt omgivende miljø under assays, skal du placere de to aluminiumsblokke forbundet til to vandbade på våde papirhåndklæder, adskilt af 10 cm(Figur 1A).
   2. Tænd de to vandbade ~ 2 timer før du starter analysen for at give tilstrækkelig tid til temperaturen i aluminium blokke til at ekvilibrere.
      BEMÆRK: Det anbefales at udføre et mock eksperiment for at bestemme temperaturen på hvert vandbad, der er nødvendigt for at opnå den ønskede lineære temperaturgradient. Nogle typiske temperaturpar til at indstille vandbadene er anført i tabel 1. Bemærk dog, at overfladetemperaturerne påvirkes af omgivelsestemperaturen. Længden af slangen påvirker også temperaturerne, da der er køling i rørene. Længden af slangen i vores opsætning er 1,5 m.
   3. Mikrobølgeovn 100 mL af 1% agarose ved high-power indstilling i en 500 mL rund bred mund flaske og hæld 25 mL/assay plade på et niveau benchtop. Forbered to assay plader, som kan placeres på aluminium blokke på samme tid (Figur 1A).
   4. Når agarose er størknet (10-20 min), gnid forsigtigt hver agaroseoverflade med en standard køkkensvamp eller en melaminsvamp for at gøre agaroseoverfladen lidt grov, så der ved sprøjtning af vand på agarosegelen skabes en glat tynd vandmembran, og der vil ikke dannes vanddråber.
   5. pladerne helt ned i en beholder med destilleret vand, indtil analysen er klar til at blive udført for at forhindre, at pladerne bliver udtørret.
2. Forberede en tovejsforløb (valgfrit)
   1. For at skabe et fugtigt omgivende miljø under assays, placere tre aluminium blokke 8 cm fra hinanden(Figur 1B)på våde papirhåndklæder.
   2. Tænd de to vandbade ~ 2 timer før du starter analysen for at give tilstrækkelig tid til temperaturen i aluminium blokke til at ekvilibrere.
      BEMÆRK: Det anbefales at udføre et mock eksperiment for at bestemme temperaturen på hvert vandbad for den tovejs gradient. Nogle typiske temperaturpar til at indstille vandbadene er anført i tabel 2. Bemærk dog, at overfladetemperaturerne påvirkes af omgivelsestemperaturen. Længden af slangen påvirker også temperaturerne, da der er køling i rørene. Længden af slangen i vores opsætning er 1,5 m.
   3. For at forhindre agarose i at løbe ud af pladen, wrap kanterne af aluminium plade med mærkning tape til at danne en 10 mm høj væg(Figur 1B).
   4. Ved hjælp af high-power indstilling, mikrobølgeovn 200 mL på 1% agarose i en 500 mL rund bred mund flaske og hæld 120 mL på en analyse plade.
   5. Efter agarose har størknet (~ 30 min), forsigtigt gnide hver agarose overflade med en standard køkken svamp eller en melamin svamp til at gøre agarose overfladen lidt grov, således at når sprøjtning vand på agarose gel, en glat tynd vand membran er skabt, og ingen vanddråber form.
   6. analysepladerne helt ned i en beholder med destilleret vand, indtil analysen er klar til at blive udført for at forhindre dem i at tørre ud.
3. Konfigurere enkeltretningsforløb
   1. Forbered reagenser og genstande på en bænk ved siden af gradientanalyseapparatet (se materialeoversigten).
   2. For at fremme en effektiv temperaturoverførsel skal du udfylde eventuelle huller mellem aluminiumsblokkene og analysepladerne ved at sprøjte vand ved grænsefladen mellem blokkene og pladen.
   3. Fjern analysepladerne fra vandbeholderen ved hjælp af handsker. Hvis vand invaderer mellem agarose gel og pladen og forårsager bump til at danne på overfladen, fjerne vandet med en P1000 micropipette.
   4. Placer assaypladerne på aluminiumsblokkene, så de afgrænsninger, der er 2 cm fra begge kanter, nøjagtigt matcher kanterne af aluminiumsblokkene(Figur 1A, C).
   5. Sprøjt vand på overfladen af pladen (en tynd vandmembran, der dækker agaroseoverfladen, er tilstrækkelig) til at forhindre agarosegelen i at tørre ud. Sørg for, at vandmembranen er kontinuerlig og fri for vanddråber, da larver kan blive fanget i vanddråber.
   6. Dæk gradientsystemet med en papkasse for at reducere vandfordampning og hjælpe med at stabilisere temperaturen på geloverfladen. Vent i 5-10 minutter for at lade temperaturen ekvilibrere.
   7. Overfladetemperaturen kontrolleres ved 12 punkter på pladen (Figur 1C). Tag to målinger inden for hver zone for at fastslå, om der er variabilitet inden for en zone. Sørg for, at temperaturen på begge steder ligger inden for ± 0,2 °C af den ønskede temperatur.
      BEMÆRK: Variabilitet inden for en zone opstår normalt, fordi de nøjagtige afstande af de to pletter til kanten af aluminiumsblokkene ikke er identiske. Juster pladens position på aluminiumsblokkene for at sikre, at de afgrænsninger, der er 2 cm fra begge kanter, nøjagtigt svarer til aluminiumsblokkenes kanter.
   8. Hvis den målte temperaturgradient afviger fra den ønskede hældning, skal vandbadets temperaturindstilling(er) øges eller formindskes, og overfladetemperaturen kontrolleres igen, efter at temperaturen i vandbadet eller vandbadet(-badene) stabiliserer sig.«.
   9. Dæk gradientsystemet med en papkasse, indtil analysen startes.
4. Oprette tovejsforløb (valgfrit)
   1. Forbered reagenser og genstande på en bænk ved siden af gradientanalyseapparatet (se materialeoversigten).
   2. Spray vand på overfladerne af de tre aluminium blokke for at fremme en effektiv temperaturoverførsel fra aluminium blokke til analysen plader ved at udfylde eventuelle huller mellem overfladerne.
   3. Fjern analysepladerne forsigtigt fra vandbeholderen og læg dem på aluminiumsblokkene. Hvis vandet invaderer mellem agarose gel og pladen, som kan forårsage bump til at danne på overfladen, fjerne vandet med en P1000 mikropipette.
   4. Placer analysepladen på aluminiumsblokkene, så midterlinerne i den første og sidste zone fra begge kanter nøjagtigt matcher kanterne af de to side aluminiumsblokke(Figur 1B, D).
   5. Sprøjt vand på overfladen af pladen (en tynd vandmembran, der dækker agaroseoverfladen, er tilstrækkelig) til at forhindre agarosegelen i at tørre ud. Sørg for, at vandmembranen er kontinuerlig og fri for vanddråber, da larver kan blive fanget i vanddråber.
   6. Dæk gradientsystemet med en papkasse for at reducere vandfordampning og hjælpe med at stabilisere temperaturen på geloverfladen. Vent 5-10 minutter for at lade temperaturen ekvilibrere.
   7. Overfladetemperaturen kontrolleres to punkter langs midterlinjen i hver af de 10 zoner (figur 1D). Tag to målinger inden for hver zone for at fastslå, om der er variabilitet inden for en zone. Sørg for, at temperaturen på begge steder ligger inden for ± 0,2 °C af den ønskede temperatur.
      BEMÆRK: Variabilitet inden for en zone opstår normalt, fordi de nøjagtige afstande af de to pletter til kanten af aluminiumsblokkene ikke er identiske. Juster placeringen af pladen på aluminium blokke for at sikre, at midterlinjen i den første og sidste zoner nærmest hver kant nøjagtigt svarer til kanterne af de to side aluminium blokke.
   8. Hvis den målte temperaturgradient afviger fra den ønskede hældning, skal du justere vandbadets temperaturindstilling(er) og kontrollere overfladetemperaturen igen, når temperaturen i vandbadet eller vandbadene stabiliseres.«.
   9. Dæk blokkene med en papkasse indtil starten af analysen.

2. Analyse og beregning

1. Fjern papkassen og kontroller geloverfladetemperaturen umiddelbart før larverne overføres til pladen. Minimer den tid, papkassen er åben, for at forhindre, at temperaturekvilibreringen forstyrres. Hvis overfladen er tør, sprøjtes en lille mængde vand på overfladen.
2. Fordel 150 ± 50 larver nær midten af hver plade (mellem zone 3 og 4 ud af de 6 zoner) for enkeltretningsgradienten (frigivelseszone; Figur 1C).
   BEMÆRK: For den tovejsgradient fordeles 200-400 larver langs den midterste zone i hver halvdel (Figur 1D).
3. Placer et mikropladelåg over hver analyseplade for at forhindre larverne i at kravle ud. Dæk opsætningen med en papkasse for at forhindre lyseksponering, hvilket kan påvirke larvevalget på agarosegelen.
   BEMÆRK: For den tovejsgradient bør det ikke være nødvendigt at dække pladen med et låg, fordi pladen er større, og larvernes foretrukne temperatur er i den midterste zone. Derfor akkumuleres få larver i kanterne og har mulighed for at krybe ud.
4. Lad analysen fortsætte i 10-30 minutter for enkeltretningsgradienten og i 15-35 minutter for den tovejsgradient, afhængigt af larvernes alder (tabel 3).
5. Tag papkassen og mikropladelåget af. Fotografere pladerne ovenfra ved hjælp af et digitalt kamera. Tag to fotografier af hver analyseplade, så efterforskeren kan vælge den med bedre kontrast og lysstyrke til analyse.
6. Fjern alle larverne fra analysepladerne og hvor som helst uden for pladerne ved aspiration.
7. Rengør analysepladerne, rørene og cellesien grundigt med destilleret vand. Genbrug de analyseplader, der er forberedt den dag, medmindre agaroseoverfladen er beskadiget.
8. Beregn den procentvise fordeling af larver i hver zone.
   1. Åbn det fotografiske billede af analysen resultater ved hjælp af software, der gør det muligt at tilføje markeringer til billedet. For at angive analysezonerne skal du tegne lodrette linjer hver 2 cm baseret på afgrænsningerne på analysepladen.
   2. Tæl antallet af larver i hver zone og registrer tallene. Tæl ikke larver i regioner 0,5 cm fra nogen af væggene. Gelen er tykkere nær væggene, og overfladetemperaturerne er ikke lineære i disse regioner.
   3. For den enkelte retningsgradient skal du beregne procentfordelingen i hver zone på følgende måde:
      (antal larver i en given zone på 2 cm)/ (samlet antal larver i 6 zoner) x 100.
   4. For den tovejsforløb skal du beregne procentfordelingen i hver zone på følgende måde:
      (antal larver i en given zone på 2 cm)/ (samlet antal larver i 5 zoner på hver side af gradienten) x 100.

Representative Results

Figur 1: Enkelt- og tovejsgradientanalyseopsætninger. (A) Enkelt-retningsbestemt gradient setup med to aluminium assay plader på to aluminium blokke. Temperaturerne i aluminiumsblokkene styres af cirkulerende vand fra to vandbade. (B) Arrangementet af de tre aluminiumsblokke, vandbade og en aluminiumsplade (250 x 220 mm) til en tovejsgradient. Venstre og højre blok er forbundet til det samme vandbad, og den midterste blok er forbundet med det andet vandbad. Aluminiumsanalysepladen er pakket med tape for at danne en 10 mm væg til at indeholde 1% agarose. (C) Positioner til at kontrollere temperaturer (angivet med prikker) og til at frigive larver på pladen. Før du påbegynder et forsøg, skal du kontrollere temperaturen på to punkter i hver zone for at bekræfte, at den ønskede lineære temperaturgradient er etableret. Larver frigives inden for det angivne område nær midterlinjen. Larverne tælles inden for hver af de 2 cm zoner. (D) Positioner til kontrol af temperaturer (angivet med prikker) og udløsningszonerne for larverne på en tovejsgradient. Et lige antal larver frigives langs midterlinjen af hver halvdel af den tovejsgradient. Antallet af larver tælles i hver af de 10 (2 cm) zoner. Et typisk sæt temperaturer (18 °C-26 °C) på agaroseoverfladen er angivet. (E) Temperaturer målt langs kantlinjerne og midterlinjerne i hver zone i en enkeltretningsgradient. Data repræsenterer gennemsnitstemperaturer ± SD. n = 8 assays (150 ± 50 larver/assay). Dele af denne figur er gengivet fra Sokabe et al. med små ændringer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Temperaturgradient på agaroseplade (hældning)	Temperaturer af vandbade	Temperaturer af aluminium blokke
10,0-25,0 °C	~6,5-7°C/~28,5°C	~8,5°C
18,0-28,0 °C	~16,8°C	~17,8°C
14,0-34,0 °C	~10,0°C	~11,8°C
12,5-42,0 °C	~7,0°C	~9,4°C

Tabel 1: Typiske temperaturgradienter og de tilsvarende temperaturer i vandbad og aluminiumsblokke til enkelte retningsbestemte stigninger.

Temperaturgradient på agaroseplade	Temperaturer af vandbade	Temperaturer af aluminium blokke
22-10-22°C	~5,0°C /~25,0°C	~7,5°C
26-18-26°C	~15,8°C	~16,9°C
30-14-30°C	~8,5°C	~10,9°C
36-12,5-36°C	~5,0°C /~47,2°C	~7,9°C

Tabel 2: Typiske temperaturgradienter og de tilsvarende temperaturer i vandbad og aluminiumsblokke til tovejsgradienter.

Larvealderen (AEL)	Analysetid (enkelt retningsbestemt)	Analysetid (tovejs)
24 timer	30 min.	35 min.
48 timer	22 min.	27 min.
72 timer	16 min.	21 min.
96 timer	13 min.	18 min.
120 timer	10 min.	15 min.

Tabel 3: Forskellige larvealderr (AEL) og de tilsvarende analysetider.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124