温度梯度测定：在 德罗索菲拉拉 瓦测试温度偏好的方法

Overview

果 蝇可以区分温度的微小变化，因此选择具有良好热条件的环境。此视频描述了一种行为分析，该检测测试了线性热梯度上果 蝇 幼虫的温度偏好。

Protocol

此协议是刘等人的摘录。 温度梯度测定以确定 德罗索菲拉· 拉瓦的热偏好，J.Vis. Exp.（2018年）。

1. 温度梯度设置

1. 准备单向梯度
   1. 为了在检测过程中营造潮湿的环境，将连接两个水浴池的两块铝块放在湿纸巾上，隔开10厘米（图1A）。
   2. 在启动检测之前，打开两个水浴池~2小时，以便有足够的时间使铝块的温度平衡。
      注： 建议进行模拟实验，以确定实现所需线性温度梯度所需的每个水浴的温度。一些典型的温度对设置水浴列在 表1。但是，请注意，表面温度受环境温度的影响。管子的长度也会影响温度，因为管子有冷却。我们设置的管子长度为 1.5 米。
   3. 微波 100 mL 的 1% agarose 在 500 mL 圆形宽口瓶的高功率设置下产生，并将 25 mL/检测板倒在水平台面上。准备两个检测板，可以同时放置在铝块上（图1A）。
   4. agarose 凝固后（10-20 分钟），用标准厨房海绵或三聚氰胺海绵轻轻擦擦每个蔗糖表面，使 agarose 表面稍微粗一些，这样在喷水时，将产生光滑的薄水膜，不会形成水滴。
   5. 用蒸馏水将盘子完全浸入容器中，直到准备进行检测以防止板体干燥。
2. 准备双向梯度（可选）
   1. 为了在检测过程中营造一个潮湿的环境，在湿纸巾上放置三块相距8厘米的铝块（图1B）。
   2. 在启动检测之前，打开两个水浴池~2小时，以便有足够的时间使铝块的温度平衡。
      注： 建议进行模拟实验，以确定每个水浴的双向梯度温度。一些典型的温度对设置水浴列在 表2。但是，请注意，表面温度受环境温度的影响。管子的长度也会影响温度，因为管子有冷却。我们设置的管子长度为 1.5 米。
   3. 为了防止糖从盘子里溢出，用标签胶带包裹铝板的边缘，形成一个10毫米高的墙（图1B）。
   4. 使用大功率设置，微波 200 mL 的 1% agarose 在 500 mL 圆形宽口瓶中产生，并将 120 mL 倒在检测板上。
   5. agarose 凝固后（+30 分钟），用标准厨房海绵或三聚氰胺海绵轻轻擦擦每个糖体表面，使 agarose 表面稍微粗一些，以便在 agarose 凝胶上喷水时，形成光滑的薄水膜，不会形成水滴。
   6. 用蒸馏水将检测板完全浸入容器中，直到准备进行检测以防止它们干涸。
3. 设置单向梯度
   1. 在梯度检测仪器旁边的长凳上准备试剂和物品（参见 材料表）。
   2. 为了促进有效的温度转移，通过在块和板之间的界面喷水来填补铝块和检测板之间的任何缝隙。
   3. 使用手套，从水容器中取出检测板。如果水侵入糖凝胶和板之间，并导致表面出现凸起，则用 P1000 微皮带取出水。
   4. 将检测板放在铝块上，使距离任一边缘 2 厘米的标界与铝块的边缘完全匹配（图 1A，C）。
   5. 将水喷洒到板的表面（覆盖在糖表面的薄水膜就足够了），以防止糖凝胶干燥。确保水膜是连续的，没有水滴，因为幼虫可能被困在水滴中。
   6. 用纸板箱覆盖梯度系统，以减少水蒸发，并有助于稳定凝胶表面的温度。等待5-10分钟，让温度平衡。
   7. 在板上的 12 点检查表面温度 （图 1C）。在每个区域内进行两次测量，以确定区域内是否有变异性。确保两个点的温度均在所需温度的± 0.2 °C 以内。
      注： 区域内的变异通常发生，因为两个点与铝块边缘的确切距离不完全相同。调整铝块上的板的位置，以确保从两个边缘 2 厘米的标界与铝块的边缘完全匹配。
   8. 如果测量的温度梯度偏离所需梯度，则增加或减少水浴温度设置，并在水浴温度稳定后重新检查表面温度。
   9. 用纸板箱覆盖梯度系统，直到开始检测。
4. 设置双向梯度（可选）
   1. 在梯度检测仪器旁边的长凳上准备试剂和物品（参见 材料表）。
   2. 在三个铝块的表面喷水，通过填补表面之间的任何缝隙，促进从铝块到检测板的有效温度转移。
   3. 小心地从水容器中取出检测板，放在铝块上。如果水侵入阿加罗斯凝胶和板之间，这可能会导致表面出现凸起，则用 P1000 微皮带取出水。
   4. 将检测板放在铝块上，使两边第一个和最后一个区域的中线与两侧铝块的边缘（图 1B，D）完全匹配。
   5. 将水喷洒到板的表面（覆盖在糖表面的薄水膜就足够了），以防止糖凝胶干燥。确保水膜是连续的，没有水滴，因为幼虫可能被困在水滴中。
   6. 用纸板箱覆盖梯度系统，以减少水蒸发，并有助于稳定凝胶表面的温度。等待5-10分钟，让温度平衡。
   7. 检查10个区域中线两个点的地表温度（图1D）。在每个区域内进行两次测量，以确定区域内是否有变异性。确保两个点的温度均在所需温度的± 0.2 °C 以内。
      注： 区域内的变异通常发生，因为两个点与铝块边缘的确切距离不完全相同。调整板在铝块上的位置，以确保离每个边缘最近的第一个和最后一个区域的中线与两侧铝块的边缘完全匹配。
   8. 如果测量的温度梯度偏离所需梯度，调整水浴温度设置，并在水浴温度稳定后重新检查表面温度。
   9. 用纸板箱盖住方块，直到检测开始。

2. 分析和计算

1. 取出纸板箱，并立即检查凝胶表面温度，然后再将幼虫转移到板中。尽量减少纸板箱打开的时间，以防止破坏温度均衡。如果表面干燥，在表面喷洒少量水。
2. 在每个板块中心附近（6个区域中的3至4个区）附近分布150个±50个幼虫，用于单向梯度（释放区： 图 1C）。
   注：对于双向梯度，沿每半部分的中间区域分布200-400幼虫（图1D）。
3. 在每个检测板上放置一个微板盖，以防止幼虫爬出来。用纸板箱盖住设置，以防止光线照射，这可能会影响蔗糖凝胶上的幼虫选择。
   注： 对于双向梯度，不应使用盖子盖住板，因为板较大，幼虫的首选温度位于中间区域。因此，很少有幼虫在边缘积累，并有机会爬出来。
4. 允许检测进行10-30分钟的单向梯度，和15-35分钟的双向梯度，这取决于幼虫的年龄（表3）。
5. 取下纸板箱和微板盖。使用数码相机从上面拍摄板。拍摄两张每个检测板的照片，以便调查人员可以选择对比度和亮度更好的照片进行分析。
6. 通过吸气从检测板和板外的任何地方取出所有幼虫。
7. 用蒸馏水彻底清洁检测板、管子和细胞过滤器。重复使用当天准备的检测板，除非阿加罗斯的表面损坏。
8. 计算幼虫在每个区域的百分比分布。
   1. 使用允许在图像中添加标记的任何软件打开检测结果的图片。要指示检测区域，请根据测定板上的分界线每 2 厘米绘制一条垂直线。
   2. 计算每个区域的幼虫数量并记录数字。不要在距离任何墙壁0.5厘米的区域计算幼虫。凝胶在墙壁附近较厚，这些区域的表面温度不线性。
   3. 对于单向梯度，计算每个区域的百分比分布如下：
      （给定2厘米区域内的幼虫数量）/（6个区域的幼虫总数）x 100。
   4. 对于双向梯度，计算每个区域的百分比分布如下：
      （给定2厘米区域内的幼虫数量）/（梯度两侧5个区域的幼虫总数）x 100。

Representative Results

图1：单向和双向梯度测定设置。（A）单向梯度设置，两个铝块上有两个铝检测板。铝块的温度由两个水浴池的循环水控制。（B）双向梯度安排三个铝块、水浴和铝板（250 x 220 mm）。左右方块连接到同一个水浴池，中间块连接到其他水浴。铝检测板用胶带包裹，形成一个10毫米的墙，以包含1%的蔗糖。（C）位置以检查温度（以点表示）并释放板上的幼虫。在开始实验之前，检查每个区域内两个点的温度，以确认所需的线性温度梯度是否成立。幼虫在中线附近的指示区域内释放。幼虫在每个2厘米区域内计数。（D）在双向梯度上检查温度（以点表示）和幼虫释放区的位置。沿着双向梯度的每一半中线释放同样数量的幼虫。幼虫的数量在10个（2厘米）区域中计算。指示在 agarose 表面显示一组典型的温度（18 °C-26 °C）。（E）在样本单向梯度中沿每个区域的边界线和中线测量的温度。数据表示平均温度± SD. n = 8 检测（150 ± 50 幼虫/检测）。这个数字的一部分是从索卡贝等人身上复制的，稍作修改。请单击此处查看此图的更大版本。

糖板温度梯度（斜坡）	水浴温度	铝块温度
10.0-25.0°C （1.5°C/厘米）	+6.5-7°C/~28.5°C	+8.5°C/~26.8°C
18.0-28.0°C （1°C/厘米）	±16.8°C/+31.0°C	±17.8°C/~29.7°C
14.0-34.0°C （2°C/厘米）	±10.0°C/~40.0°C	±11.8°C/+36.8°C
12.5-42.0°C （2.95°C/厘米）	+7.0°C/~55.0°C	~9.4°C/~49.4°C

表1：单向梯度的典型温度梯度和水浴和铝块的相应温度。

糖板的温度梯度	水浴温度	铝块温度
22-10-22°C （1.5°C/厘米）	±5.0°C /+25.0°C	~7.5°C/~24.0°C
26-18-26°C （1°C/厘米）	±15.8°C /+30.6°C	±16.9°C/~28.4°C
30-14-30°C （2°C/厘米）	~8.5°C /~36.4°C	±10.9°C/~32.8°C
36-12.5-36°C （2.95°C/厘米）	±5.0°C /+47.2°C	+7.9°C/~40.9°C

表2：典型的温度梯度和水浴和铝块的相应温度为双向梯度。

拉瓦尔年龄 （AEL）	测定时间（单向）	分析时间（双向）
24 h	30 分钟	35 分钟
48 h	22 分钟	27分钟
72 h	16 分钟	21 分钟
96 h	13 分钟	18 分钟
120 h	10 分钟	15 分钟

表3：不同的幼虫年龄（AEL）和相应的检测时间。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124