Temperaturgradientanalys: En metod för att testa temperaturpreferenser i Drosophila Larver

Overview

Drosophila fruktflugor kan skilja små temperaturförändringar och därför välja miljöer med gynnsamma termiska förhållanden. Denna video beskriver en beteendemässig analys som testar temperaturpreferensen hos Drosophila larver på en linjär termisk gradient.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Liu et al. En temperaturgradientanalys för att bestämma termiska preferenser hos Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2018).

1. Inställningar för temperaturgradient

1. Förbereda enriktad övertoning
   1. För att skapa en fuktig omgivning under analyserna, placera de två aluminiumblocken anslutna till två vattenbad på våta pappershanddukar, separerade med 10 cm (Figur 1A).
   2. Slå på de två vattenbaden ~2 h innan du påbörjar analysen för att ge tillräckligt med tid för aluminiumblockens temperatur att balansera.
      OBS: Det rekommenderas att utföra ett hånfullt experiment för att bestämma temperaturen på varje vattenbad som behövs för att uppnå önskad linjär temperaturgradient. Några typiska temperaturpar för att ställa in vattenbaden listas i tabell 1. Observera dock att yttemperaturerna påverkas av omgivningstemperaturen. Slangens längd påverkar också temperaturerna eftersom det finns kylning i rören. Längden på slangen i vår installation är 1,5 m.
   3. Mikrovågsugn 100 ml 1% agarose vid högeffektinställningen i en 500 ml rund bred munflaska och häll 25 ml/analysplatta på en jämn bänkskiva. Förbered två analysplattor, som kan placeras på aluminiumblocken samtidigt ( figur1A).
   4. Efter att agarosen har stelnat (10-20 min), gnugga försiktigt varje agarose yta med en vanlig kökssvamp eller en melaminsvamp för att göra agaroseytan något grov, så att vid sprutning av vatten på agarosgelen kommer ett jämnt tunt vattenmembran att skapas och inga vattendroppar kommer att bildas.
   5. Sänk ner plattorna helt i en behållare med destillerat vatten tills analysen är klar att utföras för att förhindra att plattorna blir uttorkade.
2. Förbereda en dubbelriktad övertoning (valfritt)
   1. För att skapa en fuktig omgivning under analyserna, placera tre aluminiumblock 8 cm från varandra (Figur 1B) på våta pappershanddukar.
   2. Slå på de två vattenbaden ~2 h innan du påbörjar analysen för att ge tillräckligt med tid för aluminiumblockens temperatur att balansera.
      OBS: Det rekommenderas att utföra ett utkastexperiment för att bestämma temperaturen på varje vattenbad för den dubbelriktade lutningen. Några typiska temperaturpar för att ställa in vattenbaden listas i tabell 2. Observera dock att yttemperaturerna påverkas av omgivningstemperaturen. Slangens längd påverkar också temperaturerna eftersom det finns kylning i rören. Längden på slangen i vår installation är 1,5 m.
   3. För att förhindra att agarosen rinner ut ur plattan, linda in aluminiumplattans kanter med märkningstejp för att bilda en 10 mm hög vägg (Figur 1B).
   4. Med högeffektsinställningen, mikrovågsugn 200 ml 1% agarose i en 500 mL rund bred munflaska och häll 120 ml på en analysplatta.
   5. När agarosen har stelnat (~ 30 min), gnugga försiktigt varje agarosayta med en vanlig kökssvamp eller en melaminsvamp för att göra agarosaytan något grov, så att vid sprutning av vatten på agarosgelen skapas ett smidigt tunt vattenmembran och inga vattendroppar bildas.
   6. Sänk ner analysplattorna helt i en behållare med destillerat vatten tills analysen är klar att utföras för att förhindra att de torkar ut.
3. Ställ in enriktad övertoning
   1. Förbered reagenser och föremål på en bänk bredvid gradientanalysapparaturen (se materialförteckningen).
   2. För att främja effektiv temperaturöverföring, fyll eventuella luckor mellan aluminiumblocken och analysplattorna genom att spruta vatten vid gränssnittet mellan blocken och plattan.
   3. Ta bort analysplattorna från vattenbehållaren med hjälp av handskar. Om vatten invaderar mellan agarosgelen och plattan och orsakar stötar att bildas på ytan, ta bort vattnet med en P1000 mikropipett.
   4. Placera analysplattorna på aluminiumblocken så att avgränsningar som är 2 cm från vardera kanten exakt matchar aluminiumblockens kanter(figur 1A,C).
   5. Spruta vatten på plattans yta (ett tunt vattenmembran som täcker agarosaytan är tillräckligt) för att förhindra att agarosgelen torkar ut. Se till att vattenmembranet är kontinuerligt och fritt från vattendroppar eftersom larver kan fastna i vattendroppar.
   6. Täck lutningssystemet med en kartong för att minska vattenavdunstning och stabilisera temperaturen på gelytan. Vänta i 5-10 min för att låta temperaturen balansera.
   7. Kontrollera yttemperaturen vid 12 punkter på plattan (figur 1C). Gör två mätningar inom varje zon för att fastställa om det finns variationer inom en zon eller inte. Se till att temperaturen på båda ställena ligger inom ± 0,2 °C av önskad temperatur.
      OBS: Variabilitet inom en zon uppstår vanligtvis eftersom de exakta avstånden för de två fläckarna till kanten av aluminiumblocken inte är identiska. Justera plattans position på aluminiumblocken för att se till att avgränsningar som är 2 cm från vardera kanten exakt matchar aluminiumblockens kanter.
   8. Om den uppmätta temperaturgradienten avviker från önskad lutning, öka eller minska vattenbadets temperaturinställning och kontrollera yttemperaturen igen efter att temperaturen på vattenbadet/vattenbaden stabiliserats.
   9. Täck lutningssystemet med en kartong tills analysen påbörjas.
4. Ställ in dubbelriktad övertoning (valfritt)
   1. Förbered reagenser och föremål på en bänk bredvid gradientanalysapparaturen (se materialförteckningen).
   2. Spruta vatten på ytorna på de tre aluminiumblocken för att främja effektiv temperaturöverföring från aluminiumblocken till analysplattorna genom att fylla eventuella luckor mellan ytorna.
   3. Ta försiktigt bort analysplattorna från vattenbehållaren och placera på aluminiumblocken. Om vatten invaderar mellan agarosgelen och plattan, vilket kan orsaka stötar att bildas på ytan, ta bort vattnet med en P1000-mikropipett.
   4. Placera analysplattan på aluminiumblocken så att mittlinjerna i den första och sista zonerna från båda kanterna exakt matchar kanterna på de två sido aluminiumblocken(figur 1B,D).
   5. Spruta vatten på plattans yta (ett tunt vattenmembran som täcker agarosaytan är tillräckligt) för att förhindra att agarosgelen torkar ut. Se till att vattenmembranet är kontinuerligt och fritt från vattendroppar, eftersom larver kan fastna i vattendroppar.
   6. Täck lutningssystemet med en kartong för att minska vattenavdunstning och stabilisera temperaturen på gelytan. Vänta 5-10 min för att låta temperaturen balansera.
   7. Kontrollera yttemperaturen vid två punkter längs mittlinjen i var och en av de 10 zonerna (figur 1D). Gör två mätningar inom varje zon för att fastställa om det finns variationer inom en zon eller inte. Se till att temperaturen på båda ställena ligger inom ± 0,2 °C av önskad temperatur.
      OBS: Variabilitet inom en zon uppstår vanligtvis eftersom de exakta avstånden för de två fläckarna till kanten av aluminiumblocken inte är identiska. Justera plattans position på aluminiumblocken för att se till att mittlinjerna i den första och sista zonerna närmast varje kant exakt matchar kanterna på de två sido aluminiumblocken.
   8. Om den uppmätta temperaturgradienten avviker från önskad gradient, justera vattenbadets temperaturinställning och kontrollera yttemperaturen igen efter temperaturen på vattenbadet/vattenbadens stabilisera.
   9. Täck blocken med en kartong tills analysen börjar.

2. Analys och beräkning

1. Ta bort kartongen och kontrollera gelytans temperatur omedelbart innan larverna överförs till plattan. Minimera den tid som kartongen är öppen för att förhindra att temperaturjämvikten störs. Om ytan är torr, spraya en liten mängd vatten på ytan.
2. Fördela 150 ± 50 larver nära mitten av varje platta (mellan zonerna 3 och 4 av de 6 zonerna) för enkelriktad lutning (frisättningszon; Figur 1C).
   OBS: För den dubbelriktade lutningen, fördela 200-400 larver längs mittenzonen i varje halvlek (Figur 1D).
3. Placera ett mikroplåtslock över varje analysplatta för att förhindra att larverna kryper ut. Täck installationen med en kartong för att förhindra ljusexponering, vilket kan påverka larvvalet på agarosgelen.
   OBS: För den dubbelriktade lutningen bör det inte vara nödvändigt att täcka plattan med lock, eftersom plattan är större och larvernas föredragna temperatur ligger i mittzonen. Följaktligen ackumuleras få larver vid kanterna och har möjlighet att krypa ut.
4. Låt analysen fortsätta i 10-30 minuter för enkelriktad lutning och i 15-35 min för den dubbelriktade lutningen, beroende på larvernas ålder (tabell 3).
5. Ta bort kartongen och mikroplåtslocket. Fotografera plattorna ovanifrån med en digitalkamera. Ta två fotografier av varje analysplatta så att prövaren kan välja den med bättre kontrast och ljusstyrka för analys.
6. Ta bort alla larver från analysplattorna och var som helst utanför plattorna genom aspiration.
7. Rengör analysplattorna, rören och cellsilen noggrant med destillerat vatten. Återanvänd de analysplattor som bereds den dagen om inte agarosens yta skadas.
8. Beräkna den procentuella fördelningen av larver i varje zon.
   1. Öppna den fotografiska bilden av analysresultaten med hjälp av programvara som gör det möjligt att lägga till markeringar i bilden. För att ange analyszonerna, rita vertikala linjer var 2 cm baserat på avgränsningar på analysplattan.
   2. Räkna antalet larver i varje zon och registrera siffrorna. Räkna inte larver i regioner 0,5 cm från någon av väggarna. Gelén är tjockare nära väggarna, och yttemperaturerna är inte linjära i dessa regioner.
   3. För enriktad övertoning beräknar du procentuell fördelningen i varje zon enligt följande:
      (antal larver i en given 2-cm zon)/ (totalt antal larver i 6 zoner) x 100.
   4. För den dubbelriktade övertoningen beräknar du procentuell fördelningen i varje zon enligt följande:
      (antal larver i en given 2-cm zon)/ (totalt antal larver i 5 zoner på varje sida av lutningen) x 100.

Representative Results

Figur 1: Inställningar för enkel och dubbelriktad gradientanalys. (A) Enkelriktad lutning med två aluminiumanalysplattor på två aluminiumblock. Temperaturen på aluminiumblocken styrs av cirkulerande vatten från två vattenbad. B) Arrangemang av de tre aluminiumblocken, vattenbaden och en aluminiumplatta (250 x 220 mm) för en dubbelriktad lutning. De vänstra och högra blocken är anslutna till samma vattenbad och mittblocket är anslutet till det andra vattenbadet. Aluminiumanalysplattan är inslagen med tejp för att bilda en 10 mm vägg för att innehålla 1% agarose. c) Lägen för att kontrollera temperaturer (indikeras av punkter) och för att frigöra larver på plattan. Innan du påbörjar ett experiment, kontrollera temperaturen vid två punkter inom varje zon för att bekräfta att önskad linjär temperaturgradient har fastställts. Larver frigörs inom det angivna området nära mittlinjen. Larverna räknas inom var och en av de 2 cm zonerna. D) Lägen för att kontrollera temperaturer (anges med prickar) och frisättningszonerna för larverna på en dubbelriktad lutning. Ett lika stort antal larver frigörs längs mitten av varje halva av den dubbelriktade lutningen. Antalet larver räknas i var och en av de 10 (2 cm) zonerna. En typisk uppsättning temperaturer (18 °C-26 °C) på agarosaytan anges. e) Temperaturer uppmätta längs gränslinjerna och mittlinjerna i varje zon i en provgradient med enkelriktad lutning. Data representerar genomsnittliga temperaturer ± SD. n = 8 analyser (150 ± 50 larver/analyser). Delar av denna siffra återges från Sokabe et al. med smärre modifieringar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Temperaturgradient på agarosaplatta (lutning)	Temperaturer på vattenbad	Temperaturer på aluminiumblock
10,0-25,0 °C (1,5 °C/cm)	~6.5-7°C/~28.5°C	~8.5°C/~26.8°C
18.0-28.0°C (1°C/cm)	~16.8°C/~31.0°C	~17.8°C/~29.7°C
14.0-34.0°C (2°C/cm)	~10.0°C/~40.0°C	~11.8°C/~36.8°C
12,5-42,0°C (2,95°C/cm)	~7.0°C/~55.0°C	~9.4°C/~49.4°C

Tabell 1: Typiska temperaturgradienter och motsvarande temperaturer i vattenbad och aluminiumblock för enkelriktade lutningar.

Temperaturgradient på agarosaplatta	Temperaturer på vattenbad	Temperaturer på aluminiumblock
22-10-22°C (1.5°C/cm)	~5.0°C /~25.0°C	~7.5°C/~24.0°C
26-18-26°C (1°C/cm)	~15.8°C	~16.9°C/~28.4°C
30-14-30°C (2°C/cm)	~8.5°C /~36.4°C	~10.9°C/~32.8°C
36-12,5-36°C (2,95°C/cm)	~5.0°C	~7.9°C/~40.9°C

Tabell 2: Typiska temperaturgradienter och motsvarande temperaturer i vattenbad och aluminiumblock för dubbelriktade lutningar.

Larvålder (AEL)	Analystid (enkelriktad)	Analystid (dubbelriktad)
24 timmar	30 min	35 min
48 timmar	22 min	27 min
72 h	16 min	21 min
96 timmar	13 min	18 min
120 h	10 min	15 min

Tabell 3: Olika larvålder (AEL) och motsvarande analystider.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124