温度勾配アッセイ:ショ ウジョウバエ 幼虫の温度設定を試験する方法

Overview

ショウジョウバエ は温度の小さな変化を区別することができ、したがって良好な熱条件を有する環境を選択することができる。このビデオでは、ショ ウジョウバエ 幼虫の温度嗜好を線形熱勾配で検定する行動アッセイについて説明します。

Protocol

このプロトコルは、劉氏らからの抜粋である。 ショ ウジョウバエ 幼虫、J.Vis.Exp. の熱嗜好を決定するための温度勾配アッセイ(2018)。

1. 温度勾配設定

1. 単方向グラデーションの準備
   1. アッセイ中に湿度の高い環境を作り出すために、2つの水浴に接続された2つのアルミニウムブロックを10cmで区切った濡れたペーパータオルの上に置きます(図1A)。
   2. アッセイを始める前に2つの水浴を約2時間オンにして、アルミニウムブロックの温度が平衡化するのに十分な時間を与えます。
      注: 模擬実験を行い、所望の線形温度勾配を達成するために必要な各水浴の温度を決定することをお勧めします。水浴を設定するための一般的な温度ペアは、 表1にリストされています。ただし、表面温度は周囲温度の影響を受けます。チューブの長さは、チューブ内の冷却が発生する温度にも影響します。セットアップのチューブの長さは1.5 mです。
   3. マイクロ波100mLの1%アガロースは、500mLの丸い広口ボトルの高出力設定で、レベルのベンチトップに25mL/アッセイプレートを注ぎます。アルミニウムブロックに同時に配置できる2枚のアッセイプレートを準備する(図1A)。
   4. アガロースが固まった後(10〜20分)、アガロース表面を少し粗くするために標準的なキッチンスポンジまたはメラミンスポンジで各アガロース表面を軽くこすり、アガロースゲルに水を噴霧すると滑らかな薄い水膜が作られ、水滴が形成されません。
   5. プレートが乾燥するのを防ぐためにアッセイが行われるまで、蒸留水でプレートを容器に完全に沈めます。
2. 双方向グラデーションの準備 (オプション)
   1. アッセイ中に湿気の多い環境を作り出すために、濡れたペーパータオルの上に8cm離れたところに3つのアルミニウムブロック(図1B)を置きます。
   2. アッセイを始める前に2つの水浴を約2時間オンにして、アルミニウムブロックの温度が平衡化するのに十分な時間を与えます。
      注: 双方向勾配の各水浴の温度を決定する模擬実験を行うことをお勧めします。水浴を設定するための一般的な温度ペアの一部を 表2に示します。ただし、表面温度は周囲温度の影響を受けます。チューブの長さは、チューブ内の冷却が発生する温度にも影響します。セットアップのチューブの長さは1.5 mです。
   3. アガロースがプレートからこぼれ落ちないようにするには、アルミニウム板の端をラベリングテープで包み、高さ10mmの壁を形成します(図1B)。
   4. 高出力設定を用いて、マイクロ波200mLの1%アガロースを500mLの丸い広口瓶に入れ、アッセイプレートに120mLを注ぎます。
   5. アガロースが固まった後(〜30分)、アガロース表面を少し粗くするために、標準的なキッチンスポンジまたはメラミンスポンジで各アガロース表面を軽くこすり、アガロースゲルに水を噴霧すると滑らかな薄い水膜が作られ、水滴が形成されないようにします。
   6. アッセイが完了するまで蒸留水で容器にアッセイプレートを完全に沈め、乾燥を防ぎます。
3. 単方向グラデーションの設定
   1. 勾配アッセイ装置の横にあるベンチで試薬やアイテムを準備します( 材料表を参照)。
   2. 効率的な温度移動を促進するために、ブロックとプレートの間の界面に水を噴霧して、アルミニウムブロックとアッセイプレートの間の隙間を埋めます。
   3. 手袋を使用して、水容器からアッセイプレートを取り出します。水がアガロースゲルとプレートの間に侵入し、表面に隆起を引き起こす場合は、P1000マイクロピペットで水を取り除きます。
   4. どちらのエッジから 2 cm の境界がアルミニウム ブロックのエッジと正確に一致するように、アッセイ プレートをアルミニウム ブロックの上に置きます (図 1A,C)。
   5. プレートの表面に水を噴霧(アガロース表面を覆う薄い水膜で十分)、アガロースゲルが乾燥するのを防ぎます。幼虫が水滴に閉じ込められる可能性があるため、水膜は連続的で水滴が含まれないようにしてください。
   6. 勾配システムを段ボール箱で覆い、水の蒸発を減らし、ゲル表面の温度を安定させます。温度が平衡化されるように5〜10分待ちます。
   7. プレートの表面温度を12ポイントで確認します(図1C)。各ゾーン内で 2 つの測定値を使用して、ゾーン内に変動があるかどうかを確認します。両方のスポットの温度が所望の温度の±0.2 °C以内であることを確認してください。
      注: 通常、ゾーン内の変動は、2 つのスポットからアルミニウム ブロックの端までの正確な距離が同一でないために発生します。アルミニウムブロックのプレートの位置を調整して、どちらかのエッジから 2 cm の境界がアルミニウム ブロックのエッジと正確に一致するようにします。
   8. 測定した温度勾配が目的の勾配から逸脱している場合は、水浴温度設定を増減し、水浴の温度が安定した後に表面温度を再確認します。
   9. アッセイを開始するまで、段ボール箱で勾配システムを覆います。
4. 双方向グラデーションの設定 (オプション)
   1. 勾配アッセイ装置の横にあるベンチで試薬やアイテムを準備します( 材料表を参照)。
   2. 3つのアルミニウムブロックの表面に水を噴霧して、表面間の隙間を埋めることによって、アルミニウムブロックからアッセイプレートへの効率的な温度移動を促進します。
   3. 水容器から慎重にアッセイプレートを取り出し、アルミニウムブロックの上に置きます。アガロースゲルとプレートの間に水が侵入し、表面に隆起が生じる場合は、P1000マイクロピペットで水を取り除きます。
   4. どちらかの端からの最初と最後のゾーンの中間線が2つの側のアルミニウムブロックの端と正確に一致するように、アッセイプレートをアルミニウムブロックに置きます(図1B,D)。
   5. プレートの表面に水を噴霧(アガロース表面を覆う薄い水膜で十分)、アガロースゲルが乾燥するのを防ぎます。幼虫は水滴に閉じ込められる可能性があるため、水膜は連続的で水滴が含まれないようにしてください。
   6. 勾配システムを段ボール箱で覆い、水の蒸発を減らし、ゲル表面の温度を安定させます。温度が平衡化されるように5〜10分待ちます。
   7. 10ゾーンの各中線に沿って2点の表面温度を確認します(図1D)。各ゾーン内で 2 つの測定値を使用して、ゾーン内に変動があるかどうかを確認します。両方のスポットの温度が所望の温度の±0.2 °C以内であることを確認してください。
      注: 通常、ゾーン内の変動は、2 つのスポットからアルミニウム ブロックの端までの正確な距離が同一でないために発生します。アルミニウムブロックのプレートの位置を調整して、各エッジに最も近い最初と最後のゾーンの中間線が、2 つの側のアルミニウム ブロックのエッジと正確に一致するようにします。
   8. 測定した温度勾配が目的の勾配から逸脱している場合は、水浴温度設定を調整し、水浴の温度が安定した後に表面温度を再確認します。
   9. アッセイが始まるまで、ブロックを段ボール箱で覆います。

2. アッセイと計算

1. 段ボール箱を取り外し、幼虫をプレートに移す直前にゲル表面温度を確認します。段ボール箱が開いている時間を最小限にして、温度の平衡を乱さないようにします。表面が乾燥している場合は、表面に少量の水を噴霧します。
2. 単方向勾配(リリースゾーン)の各プレートの中心付近(6ゾーンのうちゾーン3と4の間)に150±50の幼虫を配る。図1C)。
   注:双方向勾配の場合、各半分の中央ゾーンに沿って200〜400の幼虫を分布させます(図1D)。
3. 各アッセイプレートの上にマイクロプレートの蓋を置き、幼虫が這い出るのを防ぎます。セットアップを段ボール箱で覆い、アガロースゲルの幼虫の選択に影響を与える可能性のある光の露出を防ぎます。
   注: 双方向勾配の場合、プレートが大きく、幼虫の好ましい温度が中間域にあるため、蓋でプレートを覆う必要はありません。その結果、幼虫はほとんど縁に蓄積し、這い出す機会を持っていません。
4. 単方向勾配の場合は10〜30分間、幼虫の年齢に応じて双方向勾配で15〜35分間進行するようにアッセイを許可する(表3)。
5. 段ボール箱とマイクロプレートの蓋を取り外します。デジタルカメラを使用して上からプレートを撮影します。各アッセイプレートの写真を2枚撮り、分析のためにより良いコントラストと明るさを持つものを選択できるようにします。
6. 吸引によって、アッセイプレートから、そしてプレートの外の任意の場所から幼虫のすべてを取り除きます。
7. 蒸留水でアッセイプレート、チューブ、セルストレーナーを十分に洗浄します。アガロースの表面が損傷しない限り、その日に調製したアッセイプレートを再利用します。
8. 各ゾーンでの幼虫の割合分布を計算します。
   1. 画像にマーキングを追加できるソフトウェアを使用して、アッセイ結果の写真画像を開きます。アッセイゾーンを示すには、アッセイプレート上の境界に基づいて2cmごとに垂直線を引きます。
   2. 各ゾーンの幼虫の数を数え、その数を記録します。壁から0.5cmの領域で幼虫を数えないでください。ゲルは壁の近くで厚く、表面温度はこれらの領域で線形ではありません。
   3. 単方向グラデーションの場合、各ゾーンのパーセンテージ分布を次のように計算します。
      (与えられた2cmゾーンの幼虫の数)/(6ゾーン内の幼虫の総数)x 100。
   4. 双方向グラデーションの場合、各ゾーンのパーセンテージ分布を次のように計算します。
      (所定の2cmゾーンにおける幼虫の数)/(勾配の両側の5つのゾーンにおける幼虫の総数)x 100。

Representative Results

図1:単一および双方向の勾配アッセイの設定(A) 2つのアルミニウムブロック上に2つのアルミニウムアッセイプレートを用いた単一方向の勾配設定。アルミニウムブロックの温度は、2つの水浴から水を循環させることによって制御される。(B)3つのアルミニウムブロック、水浴およびアルミニウム板(250 x 220 mm)の配置は、双方向勾配のため。左右のブロックは同じ水浴に接続され、中央のブロックは他の水浴に接続されています。アルミニウムアッセイプレートは、テープで包まれ、1%アガロースを含む10mmの壁を形成する。(C)温度を確認する位置(ドットで示される)とプレート上の幼虫を解放する。実験を開始する前に、各ゾーン内の2点の温度を確認して、目的の線形温度勾配が確立されていることを確認します。幼虫は、正中線の近くの指示された領域内で解放されます。幼虫は2cmゾーンのそれぞれ内で数えられる。(D)二方向勾配上の幼虫の温度(ドットで示される)および放出ゾーンを確認する位置。同じ数の幼虫が、双方向勾配の各半分の正中線に沿って放出される。幼虫の数は、10(2cm)のゾーンのそれぞれでカウントされます。アガロース表面上の一般的な温度(18°C-26°C)のセットが示されています。(E)各ゾーンの境界線と中間線に沿って測定された温度を、サンプルの単方向グラデーションで表します。データはSD± ±平均温度を表します。このフィギュアの一部は、わずかな変更でSokabeらから再現されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

アガロースプレートの温度勾配(傾斜角)	水浴の温度	アルミニウムブロックの温度
10.0-25.0°C(1.5°C/cm)	~6.5~7°C/~28.5°C	~8.5°C/〜26.8°C
18.0-28.0°C(1°C/cm)	~16.8°C/~31.0°C	~17.8°C/〜29.7°C
14.0~34.0°C(2°C/cm)	~10.0°C/〜40.0°C	~11.8°C/~36.8°C
12.5-42.0°C(2.95°C/cm)	~7.0°C/〜55.0°C	~9.4°C/〜49.4°C

表1:一般的な温度勾配と、単一方向勾配の水浴とアルミニウムブロックの対応する温度。

アガロースプレートの温度勾配	水浴の温度	アルミニウムブロックの温度
22-10-22°C(1.5°C/cm)	~5.0°C/~25.0°C	~7.5°C/〜24.0°C
26-18-26°C(1°C/cm)	~15.8°C/~30.6°C	~16.9°C/~28.4°C
30-14-30°C(2°C/cm)	~8.5°C/~36.4°C	~10.9°C/~32.8°C
36-12.5-36°C(2.95°C/cm)	~5.0°C /~47.2°C	~7.9°C/~40.9°C

表2:一般的な温度勾配と、双方向勾配の水浴とアルミニウムブロックの対応する温度。

ラーバル年齢(AEL)	アッセイ時間(単一方向)	アッセイ時間(双方向)
24時間	30分	35分
48時間	22分	27分
72時間	16分	21分
96時間	13分	18分
120時間	10分	15分

表3:異なる幼虫年齢(AEL)および対応するアッセイ時間。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124