Protocol
1. إعداد الأجنة
- إذا لم تفعل بشكل روتيني كجزء من ثقافة الجنين، دي هلام الأجنة باستخدام 2.5٪ السيستين، ودرجة الحموضة 8.0 قبل تثبيت 8. على الرغم من أنه ليس من الضروري على الاطلاق، فمن المفيد أن ثم يدويا إزالة المغلف الإخصاب قبل تثبيت باستخدام ملقط غرامة.
- استخدام الماصات الزجاج باستور لنقل الأجنة. ماصة ليست واسعة بما فيه الكفاية لنقل الأجنة وذلك باستخدام قلم الماس لقطع ماصة الزجاج في نقطة واسعة بما يكفي لالتقاط الجنين. القضاء على حواف حادة من الماصات بعد قطع كتبها بسرعة تمرير قطع غيض من خلال شعلة الموقد بنسن لإذابة حواف حادة.
ملاحظة: العناية يجب أن تؤخذ، والزجاج يمكن أن يكون تزال ساخنة بما يكفي ليسبب حروقا على الرغم من أنه يبدو أن تبرد عن طريق التفتيش البصري.
- استخدام الماصات الزجاج باستور لنقل الأجنة. ماصة ليست واسعة بما فيه الكفاية لنقل الأجنة وذلك باستخدام قلم الماس لقطع ماصة الزجاج في نقطة واسعة بما يكفي لالتقاط الجنين. القضاء على حواف حادة من الماصات بعد قطع كتبها بسرعة تمرير قطع غيض من خلال شعلة الموقد بنسن لإذابة حواف حادة.
- إجراء تثبيت الجنين في مراحل. أولا، إعداد قارورة زجاج للاستخدام في جنين التثبيت. استخدام هذه قارورة لجميع الخطوات بما في ذلك المباراة النهائيةالتخزين. استخدام قارورة التي هي واضحة مع ختم تفلون جيد في الغطاء، مما يسمح لرصد الأجنة خلال جميع مراحل هذه العملية. تسمية قارورة مع المعلومات التجريبية المناسبة باستخدام علامة دائمة ومن ثم تغطية التسمية مع شريط واضح، كما سيتم فقدان حتى علامة دائمة على مدار الإجراء بسبب استخدام الكحول وغيرها من المذيبات.
- استخدام Mempfa لإصلاح الأجنة. جعل مخزون من 8٪ امتصاص العرق في دفعات من 50-100 مل في كل مرة. استخدام ما يقرب من 75٪ من H 2 O المطلوبة والحرارة إلى 50-60 درجة مئوية، والذي هو ضروري للحصول على امتصاص العرق إلى حل.
ملاحظة: هذا الحل هو مختلف قليلا من Memfa المستخدمة في الإصدارات القديمة بروتوكول المنشورة في أنه يستخدم بارافورمالدهيد بدلا من الفورمالديهايد. - إضافة 2-3 قطرات من 10N هيدروكسيد الصوديوم أو حتى درجة الحموضة ما يقرب من 7.5 (استخدام ورقة الرقم الهيدروجيني للتأكد من درجة الحموضة). بارافورمالدهيد هي سامة جدا، وبالتالي توليد الحل الأسهم في غطاء الدخان. وبمجرد أن الفقرةالفورمالديهايد هو في حل، تصفية حل من خلال ورقة هتما في وعاء الطازجة وإضافة H 2 O إلى الحجم النهائي. إذا لزم الأمر، وتخزين حل بارافورمالدهيد عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.
- تجميع المكونات المتبقية من الحل تثبيت Mempfa (الجدول 1). تأكد من أن تركيز العمل النهائية من بارافورمالدهيد 4٪. تخزين جميع مكونات الحل تثبيت في 4 درجات مئوية كما أسهم.
- باستخدام قطع الزجاج ماصة، وتحديد الأجنة عن طريق إضافة الأجنة إلى قارورة من الزجاج وصفت التي تم شغلها مع ما يقرب من 3-4 مل من Mempfa حل (الجدول 1). تجنب تحديد أكثر من 20-30 الأجنة في قارورة. إضافة الأجنة مع حد أدنى من نقل السائل من الجنين المتوسطة. إصلاح الأجنة في حل Mempfa لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- لهياكل الأديم الباطن أواخر أداء في بتوضع على معزولة يدويا القناة الهضمية والأديم الباطن المشتقات 9،10، والذي يسمح لاختراق جيد لجنة التحقيق، وكذلك يتجنب تجويف تلطيخ.
- تخزين محلول الميثانول بنسبة 100٪ في -20 ° C. بعد تثبيت بارافورمالدهيد، يستعاض عن حل Mempfa مع ما يقرب من 4 مل من -20 ° C، و 100٪ الميثانول لتخزين الأجنة.
- دوامة قارورة بعد إضافة الميثانول لمنع الأجنة من الالتصاق على الزجاج أو الأجنة الأخرى. أيضا، تأكد من أن يتم ختم القنينات بإحكام لأن الميثانول يمكن أن تتبخر في الثلاجة مع مرور الوقت إذا فضفاضة.
ملاحظة: الأجنة يمكن تخزينها لمدة سنة على الأقل، وعلى الأرجح لفترة أطول، في الميثانول قبل تلطيخ مع عدم فقدان جودة في الموقع التهجين.
- استخدام Mempfa لإصلاح الأجنة. جعل مخزون من 8٪ امتصاص العرق في دفعات من 50-100 مل في كل مرة. استخدام ما يقرب من 75٪ من H 2 O المطلوبة والحرارة إلى 50-60 درجة مئوية، والذي هو ضروري للحصول على امتصاص العرق إلى حل.
2. التحقيق التحضير
- استخدام 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي القالب لجعل تحقيقات المسمى digoxigenin. قطع البلازميد التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي المناسب في نهاية 5 'من الجينات في المصالح مع تقييد انزيم مناسب للثار ناقلات لتوليد تحقيقات العقاقير.
ملاحظة: يجب أن يكون البلازميد موقع ملزم بوليميريز RNA المناسب (على سبيل المثال T7، T3، أو SP6). - السماح للDNA، والمياه، NTP خلط وعازلة البلمرة لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة قبل تجميع رد فعل التوليف التحقيق. إضافة مكونات رد فعل التوليف RNA إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل بالترتيب كما هو موضح في الجدول رقم 2. ضبط حجم الماء المضاف لجلب إجمالي حجم رد الفعل التوليف التحقيق إلى 20 ميكرولتر. تجميع رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمكونات المخزن المؤقت البلمرة يمكن أن يعجل قالب DNA عندما تكون في تركيزات عالية والبرد.
- احتضان رد فعل النسخ لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
ملاحظة: حضانات لأطول قليلا من ساعتين يؤدي إلى أي آثار سلبية، ولكن أيضا تظهر زادت قليلا الغلة. إذا المحتضنة لمدة ساعة واحدة، سيتم تخفيض العائد ولكن لا يزال كافيا لجعل التحقيق جيد.- في انتظار رد فعل النسخ إلى النهاية، وجعل جل الاغاروز التي سيتم استخدامها لاختبار نوعية التحقيق. تذوب 1 ميكروغرام من الاغاروز في 100 مل من العازلة 1X TAE (انظر الجدول 1) عن طريق تسخين المحلول إلى نقطة الغليان. إزالة حل من الحرارة عندما مسحوق الاغاروز قد حلت تماما.
- إضافة 2 ميكرولتر إيثيديوم بروميد الأسهم الحل (10 ملغ / مل) إلى حوالي 100 مل من agarose هلام عندما يبرد الاغاروز إلى حوالي 60 درجة مئوية للسماح التصور من الحمض النووي الريبي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) النور.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ هذا الحل agarose هلام في 60 درجة مئوية الحاضنة بحيث يمكن سكب المواد الهلامية في المستقبل دون ذوبان المتكررة. العناية في التعامل مع بروميد إيثيديوم بسبب السمية المحتملة.
- إضافة 1 ميكرولتر DNAseI (ريبونوكلياز الصف مجانا) إلى رد فعل النسخ بعد حضانة 2 ساعة واحتضان لمدة 10 دقيقة أخرى في 37 ° C للقضاء على الحمض النووي القالب.
- إزالة 1 ميكرولتر من مزيج رد فعل لاطمئنان على 1٪ الاغاروز-تاي جل وإلى بقية (20 ميكرولتر) إضافة 80 ميكرولتر من 1٪ SDS في TE العازلة (10 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA)، و 10 ميكرولتر من 5M NH 4 خلات، و 220 ميكرولتر الإيثانول من البرد. دوامة المزيج بقوة ويوضع جانبا على الجليد حتى يتم معرفة نتائج فحص الجودة RNA.
- تشغيل ميكرولتر 1 من RNA إزالتها قبل هطول الأمطار على 1٪ الاغاروز-تاي هلام. لتخفيف التحميل على هلام، إضافة 4-5 ميكرولتر من الماء و 1 ميكرولتر من معيار صبغ تحميل لRNA. عرض RNA على هلام باستخدام نقل transilluminator ضوء الأشعة فوق البنفسجية من أجل التحقق من جودة التحقيق (انظر المناقشة).
- ترسيب RNA المتبقية التي تم تعيينها جانبا على الجليد في الخطوة 2.5 عن طريق الدوران في microcentrifuge بأقصى سرعة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. رسم قبالة طاف مع تعادل خارج ماصة الزجاج والسماح ليجف لفترة وجيزة.
- Resuspend والتحقيق مع 1 مل من العازلة RNA التهجين (الجدول 1) في أنبوب إيبندورف. دوامة ورiefly تسخين أنبوب إلى 37 درجة مئوية والدوامة مرة أخرى. نقل الحل التحقيق إلى 15 مل المسمار غطاء أنبوب البوليسترين وملء الى 7-10 مل مع العازلة RNA التهجين. ملاحظة: لجنة التحقيق يمكن أن تضعف مزيد (مزيد من التخفيف 10 أضعاف ما زالت قادرة على العمل) مما أدى في كثير من الأحيان في خلفية منخفضة إلا أن ردود الفعل تلطيخ أيضا يستغرق وقتا أطول.
3. تهجين موضعي
- خذ الأجنة التي تم تخزينها في -20 درجة مئوية الميثانول والسماح لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة. تنفيذ الإجراء بأكمله في قوارير زجاجية. إذا أجنة مختلفة من مجموعة واحدة تسير ينبغي أن ينظر إليه من قبل تحقيقات مختلفة، والاحتفاظ بها في قارورة واحدة حتى قبل تضاف تحقيقات للحد من التقلبات والعمل في اليوم الأول.
- ترطيب الأجنة من خلال سلسلة الميثانول على النحو المبين في الجدول 3 (انظر الجدول رقم 1 عن وصفات غسل) تمهيدا لإضافة التحقيق. دوامة بلطف امبرينظام التشغيل بعد كل تغيير للتأكد من أنها لا إصرارها على الجانبين أو بعضها البعض، ويهز الأجنة عن طريق تركيب قارورة على nutator. عند نقل السوائل، والتحقق من الداخل من القبعات لضمان أن الأجنة لم محاصرين هناك.
- مرة واحدة في حل التحقيق، هجن الأجنة بين عشية وضحاها كما هو موضح في الجدول رقم 3.
- إزالة الحل التحقيق. حفظ التحقيق المستخدمة من قبل تخزينها في 15 مل المسمار غطاء أنبوب البوليسترين، مع وضع علامة التاريخ وعدد المرات التي استخدمت في التحقيق، في -20 ° C.
ملاحظة: نفس التحقيق يمكن إعادة استخدامها عدة مرات لاحقة في التهجين الموقع حتى تبدأ التفاعلات اللونية لأخذ وقت طويل بشكل غير طبيعي لتصل إلى كثافة المطلوب.- وبمجرد أن التحقيق هو إزالتها، وإعداد الأجنة لتلوين الأجسام المضادة ضد التحقيق من خلال سلسلة من يغسل المبينة في الجدول رقم 4. تغيير درجة الحرارة كما هو مطلوب (الجدول 4) عن طريق تحريك رانه nutator، مع قارورة من الأجنة المرفقة، مباشرة في أفران التهجين التي تم تعيينها إلى درجة حرارة مناسبة.
- تشكل حجم مناسب من MAB + HTSS + BR + المضادة للحفر الأضداد (الجدول 4) في الوقت الذي الأجنة يجري المحتضنة في MAB + HTSS + BR عرقلة الحل بحيث يتم حظر الأجسام المضادة قبل إضافة إلى الأجنة. جعل الحلول عرقلة جديدة في اليوم من الاستخدام.
- إزالة حل الأجسام المضادة والبدء يغسل كما هو مبين في الجدول رقم 5 بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة. أداء اثني عشر على الأقل 30 دقيقة يغسل من أجل الاستعداد لتلطيخ مع الفوسفاتيز القلوية الركيزة وتقليل الخلفية قدر الإمكان. استخدام إما MAB عازلة أو TBT حل (الجدول 1) للخطوات الغسيل.
/ وأضاف مل من BSA حل TBT هو TTW يحتوي على 2 ملغ: ملاحظة.- استبدال حل غسل الماضي مع BM الأرجواني الفوسفاتيز القلوية الركيزة. أداء REAC تلطيخنشوئها في أي درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تلطيخ أكثر سرعة عند 37 درجة مئوية ولكن إذا ترك بين عشية وضحاها، ويمكن تلوين الخلفية غير مقبول في كثير من الأحيان يكون نتيجة لذلك. فإن ردود الفعل تلطيخ وغالبا ما تتطلب تلطيخ بين عشية وضحاها ودرجة حرارة الغرفة هو الأكثر أمانا لذلك. - إذا كنت بحاجة مزيد من تلطيخ وتتخذ الحل الأرجواني BM على اللون الأزرق، واستبدال الحل تلطيخ مع الطازجة BM الأرجواني ووضع أنابيب إلى 37 درجة مئوية. إذا كان مرنا الهدف وفيرة جدا، ووضع الأجنة في حل تلطيخ في 4 درجات مئوية خلال الليل ثم نقل الأجنة إلى درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية للسماح بمراقبة أفضل من رد فعل تلطيخ.
- مراقبة ردود الفعل جديدة بعناية، حيث أن الوقت لنتيجة النهائية اختلافا كبيرا بين الرنا المستهدفة المختلفة. من أجل التناسق، والتوقف عن رد فعل تلطيخ (انظر 3.4) عندما لا يكون هناك مواقع جديدة للتعبير الناشئة مع أطول الحضانة. الأهم من ذلك، إذا التهجين في الموقع ويجري استخدامها بوصفها الفحصللتجارب تبحث في مجموعات العلاج المختلفة، واستخدام نفس الوقت لردود الفعل اللون بين العلاج والسيطرة الأجنة.
- استبدال حل غسل الماضي مع BM الأرجواني الفوسفاتيز القلوية الركيزة. أداء REAC تلطيخنشوئها في أي درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية.
- وقف رد فعل تلطيخ وإعداد الأجنة لتخزين وتسجيل صورة عن طريق تغيير السوائل على النحو المبين في الجدول 6. لا تهز الأجنة في هذه المرحلة لأن إزالة وصمة عار يمكن تصور مثل التلوين الأرجواني من الميثانول حول الأجنة.
ملاحظة: في كثير من الأحيان الأجنة لديها تلطيخ الأزرق الفاتح من الحل تلطيخ والميثانول البارد يمكن إزالة جزئيا على الأقل أنه على الرغم من هذا لا يكفي لإزالة الخلفية الثقيلة أو تجويف تلطيخ. يشير الميثانول البارد لالميثانول التي يتم الاحتفاظ في الثلاجة -20 درجة مئوية.- ترطيب الأجنة وإصلاح وصمة عار مع Mempfa (الجدول 6). مرة واحدة ثابتة، وإزالة Mempfa وغسل الأجنة مع 25٪ الميثانول.
- إزالة الميثانول بنسبة 25٪ وإضافة محلول التبييض إذا إزالة الصبغة الذاتيةمطلوب. العناية في التعامل مع حل التبييض لأنها يمكن أن تسبب الحروق. مراقبة تبيض عن كثب كما يحدث بسرعة نسبيا ودرجة التبييض يمكن أن تختلف عن تأثيرات مختلفة (الشكل 2).
- يذوى الأجنة من خلال سلسلة الميثانول إلى 100٪ الميثانول للتخزين على المدى الطويل بعد التبييض، أو نقلها إلى برنامج تلفزيوني لمدة التخزين على المدى القصير والتصوير لاحقا (انظر الجدول 6).
4. التصوير الأجنة
- مرة واحدة اكتمال الجنين عملية تلطيخ، صورة الجنين بحيث يتم التقاط معلومات عن مكان يتم التعبير عن هذا الجين من الفائدة لجمهور أوسع. استخدام 1٪ الاغاروز كخلفية لعرض الأجنة المزالة.
ملاحظة: الاغاروز يعطي الزرقاء / الخلفية الرمادية التي يتناقض بشكل جيد مع الجنين واللون الأزرق للتفاعل تلطيخ. كما أنه يساعد على نزع فتيل الظلال والانعكاسات تشتيت أن تحويل الانتباه عن الجنين.- إضافة الاغاروز في الماء ومن ثم تقديمهم ليغلي حتى الاغاروز هو في حل وثم السماح لتبرد إلى 50 قبل صب في طبق بتري. كما هو الحال مع الحل هلام TAE، وتخزين الحل الاغاروز في 55 ° C حاضنة لاستخدامات متعددة. صب الاغاروز إلى عمق حوالي 2 مم في طبق بتري. إذا لزم الأمر، وضبط عمق الاغاروز أن تسفر عن الظل بشكل مختلف قليلا من الخلفية.
- وبعد الإماهة من التخزين في الميثانول إلى محلول مائي (PBS أو TTW)، وذلك باستخدام سلسلة الميثانول، ووضع الأجنة في طبق بتري مع قاعدة الاغاروز (انظر الجدول 6). حافظ على حل نظيفة وإذا لزم الأمر، استخدم تصفية بسيطة للقضاء على الجسيمات الصغيرة التي يمكن أن تعطل الخلفية نظيفة من صور جيدة.
- لصورة الأجنة من وجهات نظر بديلة، مثل من الجانب البطني، وقطع قنوات رقيقة في الاغاروز لتناسب الجنين باستخدام ملقط غرامة ووضع الأجنة في تلك القنوات لتوجيه (الشكل 3 ملاحظة: معظم مراحل لديهما موقف مميزة أنهم نفترض عند وضعها في محلول. على سبيل المثال، الأجنة مرحلة الأريمة تميل إلى الجلوس الحيوان حتى الجانب. مرة واحدة تبدأ الأجنة إلى استطال، فإنها تقع على جانبهم.
- استخدام مصدر ضوء الألياف البصرية لإلقاء الضوء على الجنين من زاوية الضحلة، وخلق الظلال على الجنين التي توفر عمقا في الصورة ومساعدة تمييز هياكل السطح. لأن التبييض يمكن القضاء الصباغ الذي يوفر المعالم مفيدة، استخدم التظليل للأجنة ابيض بقوة.
- مسح الأجنة لتلطيخ الصورة التي هو في أعماق الجنين، كما هو الحال في الحبل الظهري، الرئة، أو مناطق من الدماغ، (الشكل 4). ولتحقيق ذلك، وضع الأجنة من خلال سلسلة الميثانول حتى في الميثانول بنسبة 100٪.
- بعد الغمر الكامل في الميثانول، ونقل الأجنة في حل جزء واحد البنزيل الكحول وقسمين البنزيل يكونnzoate (BABB). سوف الأجنة تطفو على السطح في البداية ولكن كما الميثانول ستختلط مع BABB، وسوف تغرق في BABB. أداء كل خطوة التعامل مع BABB في قوارير الزجاج أو أطباق. سوف BABB تذوب أي البلاستيك أو الطلاء.
- مرة واحدة تطهيرها، عرض الأجنة مع الضوء المرسل القادمة من تحت الجنين. ضبط شدة الضوء وكذلك زاوية من الأسفل لتحسين التباين وتوفير أفضل لون.
- عندما تثير عرض الأجنة مسح طبق بتري الزجاج الخروج من القاعدة. القيام بذلك ببساطة عن طريق استخدام الآخران الأغطية طبق بتري لرفعه بحيث يتم رفع منطقة الطبق مع الأجنة.
ملاحظة: هذا له ميزة أخذ قاعدة من التركيز والقضاء على آثار تشتيت من عيوب أو بقع على قاعدة المجهر التي يمكن أن تتداخل مع الصورة.
5. مزدوجة في الموقع التهجين
- من أجل عرض في وقت واحد نمط التعبير عن TWس جينات مختلفة في جنين واحد، تجميع تحقيقين، واحد لكل من الجينات المختلفة. توليف التحقيق واحد باستخدام DIG-11-UTP كتسمية كما هو موضح أعلاه. تمييع نتاج رد فعل النسخ في المخزن RNA التهجين لانتاج 3X التحقيق أكثر تركيزا مما كانت لاحد في التهجين الموقع.
- توليف التحقيق الأخرى ذات الاهتمام باستخدام نفس البروتوكول بالنسبة للDIG المسمى بحثها إلا أن فلوريسئين-12-UTP يجب أن تكون بديلا عن DIG-11-UTP. تمييع نتاج رد فعل النسخ في المخزن RNA التهجين لانتاج 3X التحقيق أكثر تركيزا مما كانت لاحد في التهجين الموقع.
- مزج درجتين تحقيقات مركزة في نسبة 1: 1. للحصول على أفضل النتائج، استخدم المسبار المسمى فلوريسئين عن الجينات التي تظهر أقوى تعبير في واحدة البروتوكول الموقع التهجين.
- استخدام نفس البروتوكول الموقع التهجين في وصفها لاحد في الموقع </ م> التهجين، باستثناء استخدام مسبار مزدوجة (التحقيق الذي يحتوي على خليط 1.5X تتركز تحقيقات digoxigenin المسمى والمسمى فلوريسئين) في نهاية اليوم الأول في مكان واحد الموقع التهجين التحقيق في.
- متابعة بروتوكول التهجين واحد في اليوم الثاني من ضعف البروتوكول الموقع التهجين، إلا شظايا استخدام المضادة للفلوريسئين-AP فاب في 1: التخفيف 4،000 بدلا من شظايا مكافحة DIG-AP فاب. تغسل الجسم المضاد الزائد من الأجنة كما هو الحال في واحدة البروتوكول الموقع في وتنفيذ رد فعل اللون الأول باستخدام الركيزة BM-AP الأرجواني.
- وبعد رد فعل اللون الأول، تعطيل الأجسام المضادة flourescein في 0.1 M جليكاين درجة الحموضة 2.0 لمدة 40 دقيقة تليها خمس عشرة دقيقة يغسل في MAB. منع الأجنة في MAB + HTSS + BR لمدة 90 دقيقة. إضافة الأجسام المضادة لمكافحة DIG في 1: التخفيف 2،000 في MAB + HTSS + BR واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- في اليوم التالي، وغسل الأجنة عشرoroughly في MAB (12 يغسل من 30 دقيقة) لإزالة الأجسام المضادة الزائد.
- غسل الأجنة لمدة 10 دقيقة في AP العازلة (الجدول 1) وبعد ذلك وصمة عار مع BCIP (0.5mg / مل في AP العازلة).
ملاحظة: إن الجمع في الموقع يجب أن تعطي وصمة عار الأزرق الأرجواني الداكن لأول رد فعل اللون وخفيفة رد فعل اللون الأزرق للمرة الثانية (الشكل 5). - وقف رد فعل اللون النهائي عن طريق إزالة عازلة AP وشطف ثلاث مرات مع MAB. إصلاح الأجنة مع Mempfa لمدة 10 دقيقة. غسل الأجنة مع 5 يغسل سريعة في MAB أو TBT.
- مع هذا الجمع اللون، واستخدام الميثانول في العلاجات آخر تلطيخ لم يعد ممكنا، كما أنه سيتم القضاء على BCIP وحده اللون. تخزين الأجنة بعد تلطيخ والتثبيت في برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ أزيد الصوديوم. يمكن تلطيخ كثافة تكون ضعيفة مع ضعف في موقع المال. إذا كانت هذه هي مشكلة، والحد من يغسل إلى أربعة، كل من 2 مدة ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام تحقيقات محددة الأنسجة يمكن أن توفر معلومات العالقة في ما يخص حالة التنمية لأجهزة محددة. في الأمثلة التالية، ويستند مرحلة الجنين على الطاولة انطلاق Nieuwkoop وفابر 11. إذا كان أحد يستخدم الجينات شكل تحقيقات وأعرب بعد التمايز، تروبونين القلب أنا في مرحلة 28-30، على سبيل المثال (الشكل 1C)، وجود أو حجم الجهاز متباينة يمكن تقييمها في أي تمايز آخر مرحلة. قبل سنوات، كانت الأجنة قادرة على القيام مثل هذا التحليل المبني على المعرفة رائعة من الأنسجة من الجنين في وقت مبكر 12،13 ولكن تم فقدان تلك الخبرة إلى حد كبير إلى الجيل الحالي من الأجنة. وعلى الرغم من فقدان هذه الخبرة يمكن اعتبار المؤسف، والموثوقية وسهولة الاستخدام من تقنيات في الموقع التهجين يجعل تحديد أنسجة معينة متاحة لأي باحث. الأنسجة التي هي غير واضحة نسبيا، رانه الفقس غدة في المرحلة الجنينية 25 على سبيل المثال (الشكل 1A)، يمكن أن تكون علامة بشكل واضح استخدام في موقع المال دون الحاجة لأجسام مضادة محددة أو التقنيات النسيجية (الشكل 1C). أيضا، واستخدام جبل بأكمله في بتوضع يسمح احد لعرض الجهاز بأكمله في سياق الجنين كله بدلا من الاعتماد على الاستدلال من أقسام النسيجية (الشكل 2). حتى الأنسجة التي هي عميقة داخل الجنين بما في ذلك السويقة البصرية (الشكل 4) ويمكن الاطلاع بسهولة واستخدام المقاصة الجنين يمكن أن توفر ترسيم حاد من حدود الجهاز.
تبييض الأجنة لإزالة الصبغة الذاتية باستخدام محلول بيروكسيد والقضاء إلى حد كبير متطلبات لاستخدام الأجنة البيضاء التي تفتقر الصباغ. يمكن أن تبيض في أوقات مختلفة من المفيد. على سبيل المثال، إذا كان وصمة عار قوية، وتبيض أخف التي تسمح لبعض تصبغ أن ينظر إليها يمكن أن تكون مفيدة لأنها فقطالدودة الحلزونية لأفضل تنظيم والتوجه للجنين (الشكل 2A). ومع ذلك، إذا وصمة عار هي المنطقة التي توجد فيها مستويات عالية من تصبغ، مثل الكلى (الشكل 2B)، بالقرب من القضاء التام على الصبغة التي كتبها أطول الحضانة في حل تبيض يعطي نتيجة أفضل.
الأجنة تميل لتولي مناصب معينة عندما تكون في الحل. بعد تكون العصيبة، فإنها تميل إلى وضع مسطح على الجانبين. هذا على ما يرام للصور من الجهة (الشكل 2B) ولكن يمكن أن يكون مشكلة مع المناطق الأخرى. استخدام قاعدة الاغاروز يسمح احد لقطع قنوات في الاغاروز التي يمكن استخدامها لتوجيه الأجنة. على سبيل المثال، يتم ترجمة السلائف الدم إلى الجانب البطني للجنين (الشكل 2A) والمدى الكامل للتلطيخ من الصعب مراقبة. وضعية الجنين في قناة مع الجانب بطني حتى، ثم يسمح للعرض الكامل لهذا النمط التعبير الجيني (الشكل 3A). استخدام مزدوج في الموقع التهجين يمكن أن تظهر العلاقة بين اثنين من أنماط التعبير الجيني داخل كائن واحد (الشكل 5) القضاء على ضرورة مقارنة بين الأجنة المختلفة التي قد يكون الفروق الصغيرة في التشكل. ولعل الأهم من ذلك، فإن استخدام الموقع التهجين يعطي واحد القدرة على تمييز واضح خلايا السابقة لمسح التمايز النسيجي على أساس التعبير عن الجينات التي يتم التعبير عنها في الأسلاف الأولى من النسب، مثل pax2 التي يعبر عنها في العديد من الأنسجة في الجنين في وقت مبكر، قبل التمايز (الشكل 4A). القدرة على تحديد الأسلاف والأنسجة التي لم تكن واضحة متميزة تقوم على الأنسجة، مثل السلائف خلية الدم النخاعي (الشكل 1B)، وقد سمح للباحثين لطرح الأسئلة أكثر من ذلك بكثير مفصلة عن حالة التنمية جهازا، وكذلك لتقييم نتائج تجريبية مanipulation مصممة لإحداث تمايز خارج الرحم من الأنسجة.
الشكل 1: أمثلة على جبل كامل الموقع التهجين على الأجنة القيطم في لتلطيخ الأزرق من تجربة التهجين في الموقع يمكن أن تحدد بوضوح تطوير الهياكل من أوائل القيطم الجنين (A) وجهة نظر الأمامي من مرحلة الجنين 26 تسليط الضوء على الغدة الفقس. كما رسمتها التعبير عن uvs.2 14 (B) وجهة نظر البطني للأجنة التي تبين مواقع من خلايا الدم النخاعي في وقت مبكر في مرحلة 20 باستخدام تعبير عن الميلوبيروكسيداز 15 كعلامة (C) والقلب في وقت مبكر في مرحلة 28. - 30 هو تصور عن طريق التعبير عن التروبونين القلبي I 16. وهناك ميزة واضحة لاستخدام هذا الأسلوب هو أن كل منوتصور هذه الأنماط التعبير الجيني باستخدام مجسات مختلفة ولكن البروتوكول المستخدم مطابق في جميع الحالات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مستويات مختلفة من التبييض يمكن استخدامها لتصور تلطيخ في الجنين (A) وهذا تلطيخ الأزرق على طول الجزء السفلي من هذا الجنين يظهر التعبير عن الهيموغلوبين في الدم الجزر البطنية عند حوالي مرحلة 36. هذا هو منطقة. الجنين الذي مصطبغة قليلا فقط، وبالتالي لم يكن تبييض الجنين لفترة طويلة كما يمكن أن يرى من قبل الصباغ الملون تان في العين وعلى طول الجهة الجنين. أن تكون قادرة على رؤية تصبغ يسمح لتصور أفضل للمرحلة الجنين. إذا كان تلطيخ هو في منطقة مع زيادة التصبغ الطبيعي، مثل الجهاز العصبي والجهة الجنين، وأكبر تبيض تساعد عرض في الموقع كما رأينا في B. (B) هنا التعبير عن pax8 17 في الكلى تشكيل ، هو أفضل تصور قناة سليفة الكلوة والدماغ المؤخر بعد إزالة تبيض تقريبا جميع الصباغ الذاتية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التلاعب في قاعدة الاغاروز يمكن أن يساعد مع التوجه للأجنة مناطق التصوير محددة للجنين يمكن أن يكون صعبا لأنها تميل إلى تولي مناصب معينة في طبق (A) في الشرغوف مراحل الجنين سوف تقع على جانبها. . مشاركات cutتينغ قناة غرامة في الاغاروز (الأسهم السوداء) الجنين يمكن أن ينظر إليها من الجانب البطني، والتي تبين هنا الهيموجلوبين التعبير في المرحلة 36، مع استقرار يكفي لالتقاط صورة جيدة. (B) هذا الرأي البطني للتعبير hand1 في مرحلة 20 الخطوط العريضة لوحة الجانبي الأديم المتوسط 6. يتم وضع الجنين في حفرة صغيرة أن رسخ مكانته مع الجانب بطني حتى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: الأعضاء الداخلية يمكن أن ينظر في كل مبهمة والأجنة المزالة وتطهيرها في جنين المزالة الملون لpax2 في المرحلة 34 (A)، وساق البصري (السهم الأصفر) يمكن تصور بسهولة نسبياكما يمكن تلطيخ أسفل الأنبوب العصبي. ومع ذلك، تفاصيل ليست حادة. عن طريق مسح الجنين (B) حدود المواقع التعبير، بما في ذلك ساق البصري (السهم الأصفر) هي أكثر وضوحا. ويظهر مدى المقاصة عن طريق القدرة على رؤية كلتا العينين في هذا الجنين مسح. نلاحظ أيضا أن بعض تلطيخ التي تراكمت لديها في تجاويف داخلية (السهم الأرجواني)، وهي مشكلة شائعة عند عرض الأجنة مسح.
الشكل 5: مزدوج تمثيلي في الموقع التهجين على الجنين القيطم التعبير من لوحة علامة الجانبية، hand1، هو تصور من قبل تلطيخ الأزرق الفاتح في مرحلة هو تصور 26. التعبير عن etv2 داخل الأوعية الدموية النامية عن طريق المظلمة وصمة عار الأرجواني الأزرق. التعبير عن hand1 عادة ما يكون شديد جدا، وبالتالي تم استغلاله لرانه أضعف التحقيق المسمى فلوريسئين والجمع بين BCIP. ويستخدم المسبار المسمى digoxigenin والجمع بين BM-الأرجواني لضعف التعبير etv2.
| اسم | تركيز النهائي | مبلغ / 100 مل |
| Mempfa | 1 ملي MgSO 4 | 100 ميكرولتر من 1 M MgSO 4 |
| (مخزن في 4 درجات مئوية) | 2 مم EGTA، ودرجة الحموضة 8.0 | 10 مل من 20 ملي EGTA، ودرجة الحموضة 8.0 |
| 0.1 M اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.5 | 10 مل من 1 M اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.5 | |
| 4٪ لامتصاص العرق، ودرجة الحموضة 7.5 | 50 مل من 8٪ امتصاص العرق، ودرجة الحموضة 7.5 | |
| TTW | 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4 | 5 مل من 1 M تريس، ودرجة الحموضة 7.4 |
| 200 مم كلوريد الصوديوم | 4 مل من 5 M كلوريد الصوديوم | |
| 0.1٪ توين 20 | 100 ميكرولتر من توين 20 | |
| الحل 100X دينهارت ل | 2٪ BSA | 2 ز BSA |
| (تصفية من خلال 0.2 ميكرون فلتر، | 2٪ PVP-40 | 2 غرام PVP-40 |
| تخزينها في -20 ° C) | 2٪ Ficoll 400 | 2 غرام Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M كلوريد الصوديوم | 17.5 غرام كلوريد الصوديوم |
| 300 ملي سترات الصوديوم | 8.8 ز سترات الصوديوم | |
| RNA التهجين العازلة | 50٪ الفورماميد | 50 مل من 100٪ الفورماميد |
| (مخزن في 4 درجات مئوية) | 5X SSC | 25 مل من 20X SSC |
| 1 ملغ / مل الخميرة RNA | 4 مل من 1mg / مل الخميرة RNA المذاب في 50٪ الفورماميد | |
| الحل 1X دينهارت ل | 1 مل من 100X الحل دينهارت ل | |
| 0.1٪ توين 20 | 100 ميكرولتر من توين 20 | |
| 5 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0 | 1 مل من 0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة 8.0 | |
| MAB | 100 ملي حمض المالئيك | 1.16 غرام من حمض المالئيك |
| (الرقم الهيدروجيني 7.5، تخزينها في 4 درجة مئوية) | 150 مم كلوريد الصوديوم | 0.88 غرام من كلوريد الصوديوم |
| MAB + HTSS + BR | 100 ملي حمض المالئيك | 96 مل من MAB |
| 4٪ المعالجة حراريا الأغنام سيروم | 4 مل من المعالجة حراريا الأغنام المصل (المعالجة حراريا عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وaliquoted) | |
| 2٪ حجب الكاشف | 2 غرام من روش حجب الكاشف | |
| MAB + HTSS + BR + المضادة للحفر الأجسام المضادة | 100 ملي حمض المالئيك | 96 مل من MAB |
| 4٪ الحرارة آرعتيد مصل الأغنام | 4 مل من المعالجة حراريا الأغنام سيروم | |
| 2٪ حجب الكاشف | 2 غرام من روش حجب الكاشف | |
| 1: 10،000 مكافحة حفر-AP، فاب شظايا الأجسام المضادة | 1.5 ميكرولتر من مكافحة Digoxygenin-AP، فاب شظايا الأجسام المضادة | |
| الفوسفاتيز القلوية (AP) العازلة | 100 ملي تريس، ودرجة الحموضة 9.5 | 10 مل من 1 M تريس، ودرجة الحموضة 9.5 |
| 50 ملي MgCl 2 | 5 مل من 1 M MgCl 2 | |
| 100 مم كلوريد الصوديوم | 2.5 مل من 4 M كلوريد الصوديوم | |
| 0.1٪ توين 20 | 100 ميكرولتر من توين 20 | |
| تبيض الحل | 0.3٪ H 2 O 2 | 3.34 مل من 30٪ H 2 O 2 |
| 5٪ الفورماميد | 5 مل من 100٪ الفورماميد | |
| 0.5٪ SSC | 2.5 مل من 20X SSC | |
| المقاصة الحل | 1/3 البنزيل الكحول | 33 مل |
| 2/3 البنزيل بنزوات | 67 مل |
الجدول 1: وصفات الحل
| اسم | كمية |
| حفر-NTP ميكس | 5 ميكرولتر من 20 ملي CTP |
| (40 ميكرولتر رد فعل) | 5 ميكرولتر من 20 ملي GTP |
| 5 ميكرولتر من 20 ملي ATP | |
| 3.25 ميكرولتر من 20MM UTP | |
| 3.5 ميكرولتر من 10MM حفر-11-UTP | |
| 18.25 ميكرولتر المقطر والماء تعقيمها | |
| التحقيق التجميعي | س ميكرولتر من الحمض النووي القالب(هذا يعتمد على تركيز) |
| (20 ميكرولتر رد فعل) | س ميكرولتر من المقطر والماء تعقيمها |
| 4 ميكرولتر من حفر-NTP مزيج | |
| 0.5 ميكرولتر من ريبونوكلياز المانع | |
| 2 ميكرولتر من 10X RNA العازلة البلمرة | |
| 2 ميكرولتر من RNA البلمرة |
الجدول 2: دقق وصفات التجميعي
| اسم كاشف | حجم تقريبي | مدة | درجة الحرارة |
| 100٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 75٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 50٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 25٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| TTW | 2 مل | 10 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| TTW | 2 مل | 10 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| TTW | 2 مل | 10 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| قبل دافئة RNA التهجين العازلة والتحقيق إلى 65 درجة مئوية | |||
| TTW | 4 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| TTW | 4 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| RNA التهجين العازلة | 2 مل | 10 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفةالبريد |
| قبل تحسنت-RNA التهجين العازلة | 2 مل | 1 ساعة، هزاز | 65 ° C |
| التحقيق الحل | 1 مل | بين عشية وضحاها، هزاز | 65 ° C |
الجدول 3: خطوات لليوم الأول لفي الموقع بروتوكول التهجين (مجموعه حوالي 3 ساعة)
| اسم كاشف | حجم تقريبي | مدة | درجة الحرارة | ||||
| قبل دافئ RNA التهجين العازلة و02.x SSC إلى 65 درجة مئوية و2X SSC إلى 37 درجة مئوية | |||||||
| العودة الحل التحقيق لأنبوب لتكرار الاستخدام | |||||||
| RNA التهجين العازلة | 2 مل | 10 دقيقة، هزاز | 65 ° C | 2X SSC | 2 مل | 20 دقيقة، هزاز | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 مل | 20 دقيقة، هزاز | 37 ° C | ||||
| 0.2x SSC | 4 مل | 1 ساعة، هزاز | 65 ° C | ||||
| 0.2x SSC | 4 مل | 1 ساعة، هزاز | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1.5 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة | ||||
| MAB + HTSS + BR + مكافحة DIG الأضداد | 1.5 مل | بين عشية وضحاها، هزاز | 4 ° C |
الجدول 4: خطوات لليوم الثاني للبروتوكول في الموقع التهجين (مجموعه حوالي 4 ساعة)
| اسم كاشف | حجم تقريبي | مدة | درجة الحرارة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| MAB | 4 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| BM الأرجواني AP الركيزة | 500-750 ميكرولتر | بين عشية وضحاها، هزاز (انظر النص) | درجة حرارة الغرفة / 37 ° C (انظر النص) |
الجدول 5: خطوات لليوم الثالث للبروتوكول في الموقع التهجين (حوالي 7 ساعة)
| اسم كاشف | حجم تقريبي | مدة | درجة الحرارة |
| 25٪ الميثانول | 2 مل 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة | |
| 50٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 75٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 100٪ الميثانول (الباردة) | 2 مل | 20 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 100٪ الميثانول (الباردة) | 2 مل | يختلف، لا هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 75٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 50٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 25٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| Mempfa | 2 مل | 30 دقيقة، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 25٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 25٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 25٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| تبيض الحل | 4 مل | 40 دقيقة، 3 ساعة، هزاز | درجة حرارة الغرفة / 37 ° C (انظر النص) |
| تخزين الأجنة | |||
| 25٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 50٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 75٪ الميثانول | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| 100٪ الميثانول | 4 مل | تخزينها في -20 ° C | |
| برنامج تلفزيوني 1X | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| برنامج تلفزيوني 1X | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
| برنامج تلفزيوني 1X | 2 مل | 5 دقائق، هزاز | درجة حرارة الغرفة |
الجدول 6: خطوات لوقف في الموقع التهجين، تبييض وتخزين الأجنة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القدرة على استخدام الموقع التهجين لتصور نمط التعبير عن جينات معينة لا تزال الطريقة الأكثر شيوعا لتحديد أجهزة معينة أو أنواع الخلايا في الجنين القيطم. وذلك لأن العديد من المزايا التي توفرها هذه التقنية. التعبير عن الجينات يمكن تحديد هياكل محددة جيدا قبل أي علامة النسيجي للتمايز مثل قضية للتعبير nkx2.5 في الأسلاف القلب قبل أي تمييز واضح تلك الخلايا 18. مرة واحدة كل من الكواشف هي في متناول اليد، بل هو أيضا تكلفة فعالة جدا. جيل من العديد من التحقيقات الفردية، التي يمكن إعادة استخدامها على نحو فعال، من الممكن مع قليل من الوقت الاضافي والاستثمار تكلفة بخلاف الحصول على البلازميدات التي تكود الجينات في المصالح. في تجربتنا، تحقيقات يمكن إعادة استخدامها لسنوات مع خسائر كبيرة في النشاط على الرغم من التخفيفات صغيرة الحتمية التي تأتي مع كل استخدام. وأخيرا، هناك القليل الأمثل REQUIأحمر عند استخدام تحقيقات مختلفة.
جودة التوليف التحقيق هي عامل رئيسي في نجاح البروتوكول. هناك العديد من الطرق للتأكد من جودة لجنة التحقيق RNA ولكن ببساطة تشغيل التحقيق RNA على هلام تاي هو طريقة سريعة وسهلة التي يمكن الاعتماد عليها تماما. نحن عادة استخدام بروميد إيثيديوم وصمة عار على RNA والتي تتطلب معالجة خاصة والتخلص من المواد الهلامية من قبل معظم المؤسسات. هي بدائل غير سامة المتاحة تجاريا على الرغم من أننا لم خصيصا مقارنة تلك لتحقيقات تصور. يجب تشغيل التحقيق بمثابة فرقة واحدة على الرغم من أنها سوف تظهر غامض إلى حد ما بالمقارنة مع DNA على هلام TAE. تقديرا لكمية RNA يمكن الحصول عليها: سوف تفاعل الجيد يجب أن يكون حوالي 1 ميكروغرام / ميكرولتر من الحمض النووي الريبي. سوف فرقة تصور بسهولة تمثل لا يقل عن 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي وسوف الفرقة مشرق تمثل أكثر من 1 ميكروغرام. على الرغم من الواضح يست دقيقة تماما وتتطلب بعض الخبرة، الكمي على أساس هلام هو الرابمعرف ومتانة الإجراء في الموقع يسمح لها أن تعمل بشكل جيد. إذا كان هناك قلق حول التكرار، يمكن للمرء بسهولة استخدام الامتصاصية للأشعة فوق البنفسجية لتحديد كمية صغيرة من رد الفعل النسخ، على الرغم من أننا لم نجد هذا وجود قلق كبير. وأخيرا، فإن جل يسمح احد لمعرفة ما إذا تم القضاء على الحمض النووي القالب. اذا الجل يشير إلى أن هناك أي RNA، والمرجحة تفسيران هي قالب DNA سيئة أو أن المخزن المؤقت النسخ لا يعمل بشكل جيد. يمكن تسخين المخزن المؤقت النسخ إلى 37 درجة مئوية، وخلط دقيق قبل الاستخدام، أو إضافة 1 ميكرولتر من الطازجة 100 ملي DTT إلى رد فعل النسخ يساعد أحيانا مع هذا الأخير. عنصرا هاما في المخزن المؤقت رد فعل النسخ هو إنتاج الأسبرميدين ويمكن أن يعجل قالب DNA في درجات حرارة منخفضة مما يجعل ارتفاع درجة حرارة المخزن المؤقت مهم. DTT في المخزن المؤقت يمكن أيضا أن يعجل بشكل كبير تثبيط رد الفعل. إذا وينظر راسب في المخزن المؤقت، دافئة الحل ودوامة بقوة. ليست هناك حاجة لاتخاذ أي احتياطات غير عادية، مثل معالجة المياه مع DEPC أو التعقيم نصائح والأنابيب، لمنع النشاط ريبونوكلياز. وجود ريبونوكلياز المانع التجاري يوفر حماية كبيرة ضد RNAses من البيئة. لاحظ أن تسميات UTP أخرى يمكن استخدامها، مثل فلوريسئين، على الرغم من تجربتنا، وUTP المسمى digoxigenin ومكافحة digoxigenin مزيج الأجسام المضادة يوفر نتائج أكثر اتساقا.
وتشير بروتوكولات الأولى لتوليد التحقيق أن التحلل القلوية للتحقيقات توليفها وينبغي أن يتم 4 من أجل السماح لأكبر اختراق التحقيق. لا يظهر التحلل من التحقيق للمساعدة في عملية التهجين في الموقع. تحقيقات RNA أكبر من 500 شركة بريتيش بتروليوم عادة ما تعطي إشارة ممتازة وتحقيقات التي تكون أطول من 2 كيلو بايت في طول أيضا تعمل بشكل جيد. يمكن تحقيقات أقصر تعمل إذا كان الهدف RNA وفيرة ولكن سوف أطول تحقيقات تعطي بتلطيخ إيتر. هناك لا يبدو أن هناك أي ميزة واضحة في استخدام الهضم القلوية لتفريق أطول تحقيقات.
الرعاية في التعامل الأولي للأجنة مهم جدا. إزالة المغلف الإخصاب هي مفيدة بشكل خاص للأجنة بعد إغلاق العصبي أضعاف، وقبل الفقس الطبيعي للخروج من الظرف الإخصاب. خلال استطالة الجنين داخل المغلف الإخصاب، يصبح الجنين كرة لولبية، وإذا الثابتة في هذا الموقف، والأجنة هم من الصعب الصورة بعد التهجين في الموقع. ومع ذلك، إذا يتم إزالة الأجنة من المغلف الإخصاب قبل التثبيت، وأنها تصويب بسرعة للخروج. إذا معطوبة الأجنة أثناء إزالة الغشاء، والسماح لهم للشفاء الجرح قبل التثبيت لأن الأنسجة التالفة يمكن أن يؤدي إلى كاذبة الموقع إشارة التهجين في في موقع الجرح. لو كان صغيرا، والتئام الجروح بسرعة جدا، وغالبا في غضون دقائق 19. خطوات لاحقة يمكن أن تلحق الضرر أيضا الأجنة دوهناك حاجة إلى نقل وهكذا حلقة سائل الحيطة والحذر عند تغيير الحلول. الضرر في الخطوات الأولى عادة ما يعني أن الجنين سوف تتضرر بشدة من نهاية الإجراء وسوف المناطق المتضررة يسبب كاذبة إشارات في الموقع على مرأى من الضرر. وعلاوة على ذلك، تصل إلى 30 الأجنة يمكن سبر في قارورة واحدة لكن مع مزيد من الأجنة هناك فرص أكبر للخلفية عالية النامية خلال رد فعل اللونية، ولكن زيادة يغسل في اليوم 3 أو غسل بين عشية وضحاها يمكن أن تعوض عن ذلك.
في هذا البروتوكول، تم تخفيض عدد الخطوات وتم القضاء على استخدام عدة الكواشف المستخدمة بشكل شائع. لاحظ أن هذا البروتوكول يلغي العديد من الخطوات التي تستخدم في العديد من البروتوكولات الأخرى بما في ذلك بروتين K الهضم واستخدام أنهيدريد الخل لمنع الجماعات موجبة الشحنة. قد تكون تلك الخطوات لا تزال مفيدة عند النظر في أجنة الثدييات والطيور ولكن في استخدام القيطم، والقضاء على تلك الخطوات لديها تأثير يذكر سن النتائج النهائية للفي الموقع التهجين. لم تحدد مختبرنا ما إذا كانت هذه التبسيطات نفسها يمكن تطبيقها على البروتوكولات في الموقع التهجين لأنواع أخرى. بروتين K الهضم بشكل خاص قد لا تزال هناك حاجة في الأجنة الأخرى مثل فرخ أو الماوس حيث قد يكون الاختراق التحقيق قيود أكبر.
استخدام BM الركيزة الأرجواني مريحة وموثوق بها. ومع ذلك، هناك عدد من الخيارات الأخرى المتاحة للعجل، ركائز اللون قلوية المطلوبة لتوطين RNA الهدف في الجنين. على وجه الخصوص، يتم استخدام مزيج من NBT / BCIP عادة 4 ويعمل بشكل جيد. بعض الكواشف اللون قابلة للذوبان في الميثانول، وفي هذه الحالة، فإن استخدام الميثانول بعد تلطيخ القضاء على وصمة عار ويجب تجنبها. تركيبات الألوان الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا عند تنفيذ ضعف في موقع المال. وقد تبين أيضا استخدام مزيج مماثل (NBT / BCIP بدلا من BM الأرجواني)أن تكون قوية جدا عند استخدام أجنة الفئران 20. اللون الأزرق من تلطيخ والصباغ الذاتية للجنين في كثير من الأحيان من الصعب التمييز بشكل واضح في الصور. واستخدام الأجنة البيضاء أيضا القضاء الصباغ ولكن الحل تبيض يكاد يكون فعالا كما هو وأكثر ملاءمة لأنها لا تتطلب صيانة البالغين البيضاء للتكاثر. إذا كان تلطيخ ضعيف نسبيا، يمكن أن تبيض قوي يؤكد أن تلطيخ. إذا كان تلطيخ قوي، وترك بعض الصباغ ضوء يمكن أن يكون النقيض فعال ويساعد أيضا مع توجيه وتنظيم الجنين.
بعد التهجين بين عشية وضحاها في RNA التحقيق، يمكن للبروتوكول تختلف من بروتوكول اليدوي بدقة المذكورة هنا إلى استخدام وسيلة الموقع التهجين الروبوت في. استخدام الموقع التهجين الروبوت في ينقذ ما يقرب من يوم كامل باعتباره اليوم الثاني واليوم الثالث من البروتوكول اليدوي يمكن خفضها الى يوم واحد حيث يعمل الروبوت خلال الليل لد يمكن أن تجعل كل من التغيرات في درجات الحرارة المناسبة. الروبوت هو أيضا متسقة للغاية في نتائجه ويسمح لبحث وقت واحد من العديد من العينات بكفاءة. ويبقى من المفيد أن تفعل في اليوم الأول من جهة، كما يسمح لإعادة استخدامها من تحقيقات واستخدام كميات صغيرة من كاشف. والعيب الوحيد المهم من استخدام الروبوت هو التكلفة الأولية للأداة.
هذا البروتوكول يناقش بعض الطرق بشكل فعال الصورة على الموقع التهجين. من المهم أن تفعل ذلك في الكثير من المعلومات يمكن أن تضيع إذا كانت الصورة سيئة. في كثير من الحالات، والتصوير للفي الموقع نتائج تجربة يتطلب نفس الوقت التجربة الأولية. بعض العناصر من المتغيرات إجراء مثل درجة تبيض وعنصرا من عناصر تفضيل شخصي. ويمكن تحقيق آثار التصوير الأخرى عن طريق وضع طبق على قاعدة الملونة. غالبا ما يكون الظل الأزرق طفيف على أجار يمكن التأكيد على تلطيخ الأزرق العميق من الاعتصامش التهجين. ببساطة وضع طبق بتري تحتوي آغار على ورقة من البلاستيك الأزرق للحصول على التأثير المطلوب.
ومع ذلك، فإن الأساليب المذكورة هنا توفر أساسا مع لاستكشاف إمكانيات التصوير. الأجنة يمكن أن ينظر إليها إما تطهيرها (جعل شفافة للهياكل الداخلية رؤية أفضل) أو لم تتم إزالتها (مشاهدة كما تظهر في ظل ظروف الإضاءة العادية). بعض القرارات في ما يخص كيفية صورة الجنين يعتمد على الموقع التعبير. إذا كان التعبير هو في أو بالقرب من سطح الجنين، فمن الأفضل لصورة الجنين بدون شفاء. وهناك العديد من المزايا لاستخدام الأجنة المزالة. تتطلب عملية تطهير الأجنة العديد من الخطوات والمواد الكيميائية المستخدمة لمسح الأجنة يصعب التعامل معها. أيضا، عدة تجاويف في الجنين تسمح هطول الأمطار من ركائز الفوسفات القلوية التي يمكن أن تؤدي في كاذبة تجويف تلطيخ. على وجه الخصوص، blastocoel الأجنة المبكرة وpharynتجويف GEAL غالبا ما تظهر تلطيخ (الشكل 4). هذا تلطيخ كاذبة غير مرئي في الأجنة التي لم يتم تطهيرها. بالنسبة للجزء الأكبر، حتى باعتدال التعبير العميق يمكن تصور في الأجنة المزالة، بما في ذلك الأنسجة أرومية متوسطة مثل القلب والكلى، وsomites، والأديم الباطن وتراجع مثل الغدة الدرقية والكبد. نقل الأجنة من خلال سلسلة الميثانول إما هيدرات في برنامج تلفزيوني للعرض أو وضعت في الميثانول بنسبة 100٪ لتخزين يسمح لجولات متعددة من التخزين والتصوير. يسمح للتخزين الميثانول واحد في محاولة تعديلات مختلفة على التصوير على مدى فترة طويلة.
هناك بعض العيوب لاستخدام تقنية التهجين في الموقع للنظر في التعبير الجيني. مستويات التعبير ليست قابلة للقياس بدقة على الرغم من أن المقارنة داخل الجنين والتغيرات الجسيمة في التعبير والتغيرات في التعبير حجم نطاق وعادة ما تكون واضحة. كما هو الحال مع تقنيات القائم على RNA أخرى، فإنه لا توفر أية معلومات رس البروتينات المشفرة بواسطة الجينات في المصالح، والتي يمكن أن تحد من تفسير النتائج. وأخيرا، غالبا ما يكون من الصعب تحديد ما قد يكون تلوين الخلفية بالمقارنة مع المجال التعبير الحقيقي. هذا في حد ذاته مشكلة مع الجينات مع نمط التعبير المجهول الذي يمكن أن يكون على نطاق واسع. في كثير من الأحيان، يتم استخدام مسبار المتولدة من حبلا الشعور نفس الجين كعنصر تحكم لتلطيخ غير محددة. استخدام عنصر تحكم حبلا المعنى يمكن أن توفر بعض المعلومات بشأن مشكلة مع الكواشف لكنه لا يقدم أدلة قاطعة على أن تلطيخ بناء على التحقيق العقاقير غير دقيقة تماما. النتائج من في الموقع وعادة ما تكون بشكل ملحوظ متناسقة عبر الأجنة عند استخدام أجنة متعددة، وهذا يمكن أن تستخدم كمقياس للثقة في نمط تلطيخ. أيضا، تحقيقات العقاقير المختلفة، ولدت من أجزاء مختلفة من هذا الجين، وخاصة المناطق غير مترجمة، يمكن أن تستخدم لمعرفة ما إذا كان إعطاء نمط تلطيخ نفسه. إذا فعلوا ذلك،كما يوفر الثقة في نمط تلطيخ لاحظ إذا كان متطابقة. ويمكن أيضا تحقيقات المخفف استخدامها مع التعرض لفترات طويلة في حل تلطيخ لمعرفة ما إذا كان نمط تلطيخ نفسه يظهر. أحد العوامل التي تلهم الثقة عادة في نمط تلطيخ هو ما إذا كان هذا النمط يتوافق مع بنية الجنينية محدد. بما فيه الكفاية في موقع المال وقد تم الآن القيام به مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الجينات التي من المرجح أن الأحداث النادرة نسبيا أنماط التعبير الجديدة. وقد أنشئت قواعد بيانات كبيرة من الصور في الموقع الطبيعي للكائنات الحية المختلفة التي يمكن استخدامها لمقارنة النتائج الصورة. لأجنة القيطم، Xenbase (www.xenbase.org) هو مثال ممتاز على الموارد التي يمكن استخدامها لفهم أنماط التعبير. يكون نموذج الكائنات الأخرى أيضا، وقواعد البيانات مماثلة واسعة من الصور.
على الرغم من هذه المحاذير المحتملة، في الموقع التهجين يبقى أداة قوية وموثوق بها يمكن أن يكون مفيدا للغاية لدراسة توالد. ومن المرجح أن يبقى الأسلوب المفضل لتحديد أنواع الخلايا ودراسة التغير في مجالات التعبير الجيني في المستقبل المنظور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
