Protocol
1. Embriyo Hazırlık
- Embriyo kültürü, pH 8.0 öncesinde tespit 8% 2.5 sistein kullanarak de-jöle embriyoların bir parçası olarak rutin yapılmadıysa. Kesinlikle gerekli olmasa da daha sonra elle ince forseps kullanarak önce tespite döllenme zarfı çıkarmak için, yararlıdır.
- Embriyo transferi için cam Pasteur pipetler kullanın. pipet embriyolar yani bir embriyo almak için yeterince geniş bir noktada cam pipet kesmek için bir elmas kalem kullanın aktarmak için yeterince geniş değil. Hızlı keskin kenarları eritmek için bir Bunsen beki alevi ile kesme ucu geçirerek kestikten sonra pipetler keskin kenarları ortadan kaldırmak.
NOT: Bakım görsel muayene ile soğutulan görünüyor olsa cam hala yanıklara neden olabilecek kadar sıcak olabilir gibi, alınması gerekiyor.
- Embriyo transferi için cam Pasteur pipetler kullanın. pipet embriyolar yani bir embriyo almak için yeterince geniş bir noktada cam pipet kesmek için bir elmas kalem kullanın aktarmak için yeterince geniş değil. Hızlı keskin kenarları eritmek için bir Bunsen beki alevi ile kesme ucu geçirerek kestikten sonra pipetler keskin kenarları ortadan kaldırmak.
- Aşamalarında embriyo tespiti gerçekleştirin. İlk olarak, embriyo tespit kullanılmak üzere cam gibi tüp hazırlanır. Finalde dahil olmak üzere tüm adımlar için bu şişeleri kullanınDepolama. Sürecin her aşamasında embriyoların izlenmesi için izin kapaklı iyi bir teflon conta ile açık şişeleri kullanın. Kalıcı bir kalem kullanarak uygun deneysel bilgilerle şişeleri Etiket ve hatta kalıcı işaretleyici nedeniyle alkol ve diğer çözücülerin kullanımı prosedürü boyunca kaybolur gibi, sonra şeffaf bir bantla etiketi kapsar.
- Embriyoların düzeltmek için Mempfa kullanın. Bir seferde 50-100 ml gruplar halinde% 8 paraformaldehit bir stok yapın. Çözelti içine paraformaldehid elde etmek için gerekli olan, 50-60 ° C, gerekli H2O ve ısı yaklaşık 75% kullanın.
Not: Bu çözüm formaldehit yerine paraformaldehid kullanır ki Memfa eski yayınlanmış protokol sürümlerinde kullanılan biraz daha farklıdır. - 10N NaOH 2-3 damla ekleyin veya pH kadar 7.5 (pH kontrol etmek kullanım pH kağıdı) yaklaşık. Paraformaldehyde çok zehirli, bu nedenle bir davlumbaz stok çözüm üretmek. Para kezformaldehid çözeltisi içinde yeni bir kap içine Whatman kağıt içinden çözelti filtre edilir ve nihai hacme O H2 eklenir. Gerekirse, 1-2 hafta boyunca 4 ° C 'de paraformaldehit çözeltisi saklayın.
- Mempfa sabitleme çözeltisi (Tablo 1) geri kalan bileşenlerin monte edin. Paraformaldehid nihai çalışma konsantrasyonu% 4 olduğundan emin olun. Stoklar olarak 4 ° C 'de sabitleme çözeltisi tüm bileşenleri saklayın.
- Bir kesim cam pipet kullanarak, Mempfa solüsyonu (Tablo 1) yaklaşık 3-4 ml ile dolu olan etiketli cam şişelere embriyolar ekleyerek embriyolar düzeltmek. Vialde fazla 20-30 embriyo tespit kaçının. Embriyo ortamından sıvı transferi minimum embriyolar ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat ya da gece boyunca 4 ° C'de Mempfa çözeltisi embriyolar düzeltildi.
- Geç endoderm yapılar için elle izole bağırsak ve endoderm türevleri 9,10 üzerinde situs gerçekleştirmekProbun iyi nüfuz etmesi için izin verir ve aynı zamanda kavite boyama kaçınan.
- -20 ° C'de% 100 metanol ihtiva eden bir çözelti saklayın. Paraformaldehit tespit edildikten sonra, yaklaşık 4 ml -20 ° C, embriyo depolanması için% 100 metanol ile Mempfa çözeltisi değiştirin.
- Cam veya diğer embriyolar yapışmasını embriyolar önlemek için metanol ilave edildikten sonra şişeleri çalkalanır. Ayrıca, gevşek ise metanol zamanla dondurucuda buharlaşması nedeniyle flakon sıkıca kapatılmış olduğundan emin olun.
Not: Embriyolar in situ hibridizasyon kalite kaybı ile boyanmadan önce metanol içinde, muhtemelen daha az bir yıl için depolanmıştır ve üzerinde olabilir.
- Embriyoların düzeltmek için Mempfa kullanın. Bir seferde 50-100 ml gruplar halinde% 8 paraformaldehit bir stok yapın. Çözelti içine paraformaldehid elde etmek için gerekli olan, 50-60 ° C, gerekli H2O ve ısı yaklaşık 75% kullanın.
2. Probe Hazırlık
- Digoksigenin-işaretli problar için şablon DNA 1-2 ug kullanın. Bir sınırlama ile, ilgi konusu genin 5 'ucunda uygun bir DNA dizisini ihtiva eden kesik plazmid tha için uygun enzimT vektörü antisens sondaları oluşturulur.
Not: Plazmid uygun bir RNA polimeraz bağlama bölgesi (örneğin, T7, T3, veya SP6) olması gerekir. - DNA, su, NTP prob sentez reaksiyonu monte edilmeden önce oda sıcaklığına kadar ısınmaya karıştırmak ve polimeraz tamponu izin verir. Tablo 2'de listelenen sırada, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü RNA sentezi, reaksiyon bileşenlerini ekleyin. Su seviyesini ayarlama 20 ul prob sentez reaksiyonunun toplam hacmi getirmek ekledi. Polimeraz tampona bileşenleri yüksek konsantrasyonlarda ve soğuk hedef DNA zaman uyarabileceği reaksiyon oda sıcaklığında bir araya getirin.
- 37 ° C'de 2 saat boyunca transkripsiyon reaksiyonu inkübe edin.
NOT: biraz daha uzun iki saatten İnkübasyonlar hiçbir yan etkilere yol açar, ama aynı zamanda çok az verim artışı göstermektedir. Bir saat süre ile kuluçkalanmıştır ise, verim yine de iyi bir prob için yeterli indirgenmiş fakat edilecektir.- Bitirmek için transkripsiyon reaksiyonu için beklerken, prob kalitesini test etmek için kullanılacak bir agaroz jeli tercih. 1x TAE tamponda 100 ml agaroz 1 ug Erime kaynama noktası, çözeltinin ısıtılması (Tablo 1 e bakınız). Agaroz toz tamamen çözülene zaman ısı çözüm çıkarın.
- Agaroz ultraviyole (UV) ışık altında RNA görüntülenmesine olanak vermek üzere yaklaşık 60 ° C'ye soğuduğunda agaroz jeli, yaklaşık 100 ml 2 ul etidyum bromür stok solüsyonu (10 mg / ml) ilave et.
Not: gelecek jeller tekrar eritmeden dökülebilir, böylece bu agaroz jel çözeltisi, 60 ° C'lik bir kuluçka makinesi içinde tutulabilir. Nedeniyle potansiyel toksisite etidyum bromür ele dikkatli olun.
- Şablon DNA ortadan kaldırmak için 37 ° C'de bir 10 dakika daha 2 saat inkübasyondan sonra, transkripsiyon reaksiyonu 1 ul DNaseI (RNAse serbest derece) ilave edilir ve inkübe edilir.
- Reaksiyon karışımı 1 ul çıkarınTE tamponu (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA), 5M NH4 Asetat 10 ul ve 220 ul% 1 SDS ve 80 ul% 1 agaroz-TAE jel üzerinde ve geri kalan (20 ul), kontrol soğuk etanol. Vortex karışımı şiddetle ve RNA kalite kontrol sonuçları bilinmektedir kadar buz üzerinde bir kenara.
- % 1 agaroz-TAE jel üzerinde çökeltme işleminden önce çıkarılması RNA'nın 1 ul çalıştırın. Jel üzerinde yüklenmesini kolaylaştırmak için su, 4-5 | il ve RNA standart yükleme boyası 1 ul ekle. (Tartışma) prob kalitesini kontrol etmek için bir UV ışık transilluminator'de kullanılarak jel üzerinde RNA görüntüleyin.
- 10-15 dakika süre ile tam hızda bir mikrosantrfuj eğirme adım 2.5 buz üzerinde bir kenara geri kalan RNA çökeltilmesi. Bir çizilmiş cam pipet ile süpernatant kapalı çizin ve kısaca kurumasını bekleyin.
- Eppendorf tüpü içinde RNA melezleme, 1 ml tampon (Tablo 1) ile prob yeniden süspanse edin. Girdap ve briefly tekrar 37 ° C ve girdaba boruyu ısı. 15 ml kap polistiren tüp vida bir prob çözüm aktarın ve RNA hibridizasyon tamponu ile 7-10 ml doldurun. Not: Prob (10 kat daha fazla seyreltme hala iş görebilir) genellikle düşük bir arka plana neden ancak boyama reaksiyonlar da daha uzun sürer daha seyreltilebilir.
In situ Hibridizasyon 3.
- -20 ° C'de metanol içinde depolanmıştır embriyolar alın ve oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verildi. Cam şişeler içinde tüm prosedürü uygulayın. Bir grup farklı embriyolar farklı prob tarafından baktı olacak olursa, sondalar ilk gününde değişkenliği ve emek azaltmak için eklenir hemen önce kadar bir tek şişede saklayın.
- Prob ilave hazırlık Tablo 3 (yıkama tarifleri için bakınız Tablo 1) de tarif edilen bir metanol dizi embriyolar rehidrate. Yavaşça Embry girdapHer değişiklikten sonra os onlar tarafta veya birbirlerine yapışmasını değil emin, ve bir nutator şişeleri montaj embriyolar rock. Sıvıları aktarırken, embriyolar orada sıkışıp değil emin olmak için kapaklar içini kontrol edin.
- Tablo 3'te tarif edildiği gibi prob çözeltisi içinde bir kez, bir gece boyunca embriyolar hibridize olur.
- Prob çözüm çıkarın. 15 ml saklayarak kullanılan prob kaydet -20 ° C'de tarih ve prob kullanılmıştır kaç kez ile işaretlenmiş kap polistiren tüp, vida.
NOT: kolorimetrik reaksiyonlar istenilen yoğunluğu ulaşmak için anormal uzun zaman almaya başlayana kadar aynı prob yerinde döllemeler sonraki birçok kez tekrar edilebilir.- Prob çıkarıldıktan sonra, Tablo 4'te açıklanan yıkama dizi prob karşı antikor lekelemesi için embriyolar hazırlayın. Sıcaklık değiştirme t hareket ettirerek (Tablo 4) gerektiğindedoğrudan uygun sıcaklığa ayarlanır melezleme fırınlarına bağlı embriyoların şişeleri ile o nutator.
- MAB uygun hacimde Makyaj + HTSS + br + embriyolar antikor ilave edilmeden önce bloke olmasına neden olur + HTSS + br bloke etme çözeltisi MAB inkübe edilmektedir, o zaman, anti-Dig antikoru (Tablo 4) embriyolar. Kullanım gününde engelleme çözümleri taze olun.
- Antikor çözeltisini çıkarın ve antikor ile gece boyu inkübasyondan aşağıdaki Tablo 5'te belirtildiği gibi yıkama başlar. Alkalin fosfataz alt-tabaka ile boyama için hazırlama ve mümkün olduğu kadar arka planı azaltmak için en az on iki 30 dakika yıkama yapın. Yıkama adımları için, MAB tampon veya TBT çözeltisi (Tablo 1) kullanın.
NOT: TBT çözümü 2 mg olan TTW olduğunu / BSA ml.- BM Mor alkalen fosfataz substrat ile son yıkama solüsyonu değiştirin. Boyama REAC gerçekleştirinOda sıcaklığında veya 37 ° C ya da manda.
Not: Boyama 37 ° C'de daha hızlıdır, ancak, gece boyunca bırakılırsa, kabul edilemez arka plan renklenmesi genellikle bir sonucu olabilir. boyama reaksiyonları genellikle gecede boyama gerektirir ve oda sıcaklığı bunun için güvenli olduğunu. - Daha fazla boyama gereklidir ve BM mor çözüm mavi renk alıyorsa, taze BM Purple ile boyama çözüm yerine ve 37 ° C içine tüpleri koymak. Hedef mRNA'nın çok bol ise, bir gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta boyama çözeltisi embriyolar koymak ve daha sonra oda sıcaklığına embriyolar hareket ya da 37 ° C boyama reaksiyonu daha iyi kontrol edilmesi izin verir.
- Nihai sonuç için zaman farklı hedef RNA'lar arasında önemli farklılıklar gibi, dikkatle yeni reaksiyonları izleyin. Tutarlılık için, daha uzun inkübasyon ile ortaya çıkan ifade yeni siteler varken (3.4 bakınız) boyama reaksiyonu durdurmak. Önemli bir şekilde, in situ hibridizasyon, eğer bir test olarak kullanılmaktadırFarklı tedavi grupları şu an deneyleri için, deney ve kontrol embriyoları arasındaki renk reaksiyonları için aynı zamanda kullanılır.
- BM Mor alkalen fosfataz substrat ile son yıkama solüsyonu değiştirin. Boyama REAC gerçekleştirinOda sıcaklığında veya 37 ° C ya da manda.
- Boyama reaksiyonu durdurun ve Tablo 6'da belirtildiği gibi sıvıları değiştirerek depolama ve görüntü kaydı için embriyolar hazırlayın. Leke çıkarma embriyoların yaklaşık metanol mor renk olarak görünür, çünkü bu aşamada embriyolar kaya vermeyin.
Not: Bu, ağır arka plan veya oyuk lekeleme çıkarmak için yeterli değildir, ancak sık sık embriyolar, boyama çözeltisi ve en azından kısmen bu kaldırmak soğuk metanolden açık mavi lekelenme mevcuttur. Soğuk metanol ile -20 ° C dondurucu içinde muhafaza edilir, metanol anlamına gelir.- Embriyoların rehydrate ve Mempfa (Tablo 6) ile lekeyi düzeltmek. Sabit bir kez, Mempfa kaldırmak ve% 25 metanol ile embriyolar yıkayın.
- % 25 metanol çıkartın ve ağartma çözeltisi ilave endojen pigment gidermegereklidir. Yanıklara neden olabilir ağartma çözümü ele dikkatli olun. Nispeten hızlı olur ve beyazlatma derecesi farklı etkileri (Şekil 2) için değiştirilebilir yakından beyazlatma gözlemleyin.
- Ağartma sonrası uzun süreli depolama için% 100 metanol ile bir metanol dizi embriyolar kurutmak, ya da kısa süreli depolama ve daha sonra görüntüleme için PBS'ye transferi (bakınız Tablo 6).
4. Görüntüleme Embriyolar
- Bir embriyo boyama işlemi tamamlandıktan sonra, görüntü embriyo ilgi gen ifade nerede bilgi daha geniş bir kitleye yakalanan böylece. Temizlenmemiş embriyolar görüntülemek için bir arka plan olarak agaroz% 1 kullanın.
NOT: Agaroz embriyo ve boyama reaksiyonu mavi renk ile de tezat bir mavi / gri arka plan verir. Aynı zamanda rahatsız edici gölgeler ve embriyo dikkatini başka yöne yansımaları yaygın yardımcı olur.- Suya agaroz ekleyin ve agaroz çözeltisi içinde kalıncaya kadar kaynatın ve sonra petri içine dökülmeden önce 50 soğumaya bırakın. TAE jeli çözeltisi gibi, birden fazla kullanım için 55 ° C inkübatör agaroz çözeltisi saklayın. Petri kabına yaklaşık 2 mm'lik bir derinliğe kadar agaroz dökün. Gerekirse, arka plan biraz farklı gölge elde etmek agaroz derinliğini ayarlayın.
- Sulu bir çözeltisi (PBS veya ttw) metanol içinde depolama rehidrasyon sonra, bir metanol dizi kullanılarak, (bakınız Tablo 6) agaroz baz ile bir petri tabağına embriyolar yerleştirin. Temiz bir çözüm tutun ve gerekirse, iyi görüntülerin temiz arka plan bozabilir küçük partiküler madde ortadan kaldırmak için basit filtreleme kullanın.
- Görüntü gibi ventral taraftan gibi alternatif görünümler, gelen embriyolar, Şekil 3 ince forseps kullanarak embriyo sığacak ve (yönlendirme için bu kanallarda embriyolar yerleştirmek için agaroz ince kanallar kesmek NOT: Çoğu aşamaları çözeltide yerleştirilen zaman varsayalım karakteristik bir konuma sahip. Örneğin, blastula aşamalı embriyolar hayvan yan yukarı oturup eğilimindedir. Embriyolar uzatmak için başladığınızda, onların yan yattı.
- Görüntüye derinlik sağlayan embriyo üzerinde gölgeler oluşturarak, sığ bir açıdan embriyo aydınlatmak ve yüzey yapılarını ayırt yardımcı olmak için fiber optik ışık kaynağı kullanın. Ağartma yararlı yerlerinden sağlayan pigment, ortadan Çünkü güçlü ağartılmış embriyolar için gölgeleme kullanın.
- Böyle beynin, (Şekil 4) Notokordun, akciğer, veya bölgelerde olduğu gibi, derin embriyonun içinde görüntü boyama embriyolar temizleyin. Bunu gerçekleştirmek için,% 100 metanol kadar metanol dizi embriyolar koydu.
- Metanol içinde tam daldırma sonra, çözelti, bir kısım benzil alkol embriyo transferi ve iki bölüm benzil olamaznzoate (BABB). embriyolar başlangıçta yüzeyde yüzer ancak metanol Babb ile karışır gibi, onlar Babb içine batar. Cam şişeler veya yemekler Babb ile ilgili her adımı gerçekleştirin; BABB herhangi bir plastik veya boya eriyecek.
- Bir kez, temizlenmiş embriyodan altına gelen iletilen ışık embriyolar görüntüleyin. Kontrastı artırmak ve en iyi renk sağlamak için aşağıdaki ışık yoğunluğunu yanı sıra açısını ayarlayın.
- Görüntüleme temizlenir embriyolar baz kapalı cam petri yükseltmek zaman. Sadece embriyolar ile çanak bölgesi yükselir, böylece onu yükseltmek için diğer iki petri kapakları kullanarak yapın.
NOT: Bu odak dışında tabanını alarak ve görüntü ile müdahale edebilir mikroskop baz kusurlar veya lekeleri rahatsız edici etkilerinin ortadan kaldırılması avantajına sahiptir.
5. Çift İn situ Hibridizasyon
- Aynı anda tw ifade desenini görüntülemek içinTek bir embriyo farklı genler o iki prob farklı genlerin her biri için bir sentez. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir etiket olarak DIG-11-UTP ile bir prob sentez. Situ hibridizasyonlar için tek olarak kullanılan çok 3 kat daha fazla konsantre edilmiş sonda elde etmek için RNA, hibridizasyon tamponu içinde transkripsiyon reaksiyonu ürünü seyreltin.
- DIG DIG 11-UTP ile ikame edilmesi gerektiğini floresein-12-UTP dışında problanmış etiketli için izlenen aynı protokol ile ilgili diğer prob sentez. Situ hibridizasyonlar için tek olarak kullanılan çok 3 kat daha fazla konsantre edilmiş sonda elde etmek için RNA, hibridizasyon tamponu içinde transkripsiyon reaksiyonu ürünü seyreltin.
- 1: 1 oranında iki konsantre probları karıştırın. En iyi sonuçları elde etmek için in situ hibridizasyon protokol tek güçlü ifadesini gösterir geni için, floresein-işaretli prob kullanılır.
- In situ hibridizasyon protokolü aynı için <yerinde tek için tarif edilen/ Em> hibridizasyonları, çift prob kullanımı dışında in situ hibridizasyon probu tek yerine ilk günün sonunda (etiketli-digoxigenin ve floresan işaretli prob 1.5x konsantre karışımı içeren prob).
- Anti-DIP-AP Fab fragmanları yerine 4,000 seyreltme ile 1: Anti-florosin AP Fab fragmanları hariç, in situ hibridizasyon protokolü çift ikinci gününde tek melezleştirme protokolü takip edin. Yerinde protokolünde single olarak embriyo aşırı antikor yıkayın ve BM-Mor AP substratı kullanılarak ilk renkli reaksiyonu yürütmek.
- İlk renk reaksiyonundan sonra, 0.1 M glisin pH MAB beş ila on dakika yıkama yapılmıştır 2.0 40 dk için floresein antikor etkisiz hale getirirler. 90 dakika için MAB + HTSS + BR embriyolar engelleyin. 1 anti-DIG antikoru ekleyin: MAB + HTSS + br 2000 seyreltme ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, inci embriyolar yıkayınoroughly MAB (30 dakika 12 yıkama) aşırı antikorları ayıklamak için.
- AP Tamponu içinde 10 dakika (tablo 1) için embriyolar yıkayın ve BCIP (AP tamponu içinde 0.5 mg / ml) ile boyanır.
NOT: Yerinde birlikte ilk renkli reaksiyon ve ikinci (Şekil 5) için bir açık mavi renk reaksiyonu için bir koyu mavi-mor leke vermelidir. - AP tampon kaldırarak nihai renk reaksiyonu durdurmak ve MAB ile üç kez yıkayın. 10 dakika boyunca Mempfa ile embriyolar Fix. MAB veya TBT 5 hızlı yıkama ile embriyolar yıkayın.
- O BCIP yalnız renk ortadan kaldıracak gibi bu renk kombinasyonu ile, sonrası boyama işlemlerinde metanol kullanımı, artık mümkün. % 0.02 sodyum azid ile PBS içinde boyama ve tespit sonrası embriyolar saklayın. Boyama yoğunluğu situs çift zayıf olabilir. Bu bir sorun ise, dört 2 saat süre her yıkar azaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doku spesifik probların kullanımı belirli organların gelişim durumuna ilişkin olağanüstü bilgi verebilir. Aşağıdaki örneklerde, embriyonun sahne Nieuwkoop ve Faber evreleme masaya 11 dayanmaktadır. Bir sondalar formu farklılaşma sonra genlerin, evre 28-30 ben kalp troponin, örneğin, (Şekil 1C), farklılaşmış bir organın varlığını veya boyutunu kullanıyorsa herhangi bir aşama sonrası farklılaşma de değerlendirilebilir. Yıllar önce, embriyolog, erken embriyo 12,13 histoloji olağanüstü bilgiye dayalı böyle bir analiz yapmak mümkün ama bu uzmanlık büyük ölçüde embriyolog şimdiki nesil için kesildi. Her ne kadar, bu uzmanlık kaybı herhangi bir araştırmacı için mevcut belirli dokular belirlenmesini sağlar in situ melezleme tekniklerinde de güvenilirlik ve kullanım kolaylığı, üzüntü verici olarak değerlendirilebilir. Nispeten göze çarpmayan olan Dokular, tEmbriyonik aşamada 25 (örneğin, Şekil 1A) bezi kuluçka o canlı özgü antikorlar ya da histolojik teknikler (Şekil 1C) gerek kalmadan ışıkla olarak kullanılarak işaretlenebilir. Ayrıca, situs bütün montaj kullanımı biri oldukça histolojik kesitler (Şekil 2) çıkarım güvenmek yerine, tüm embriyo bağlamında tüm organı görüntülemenizi sağlar. Optik sap (Şekil 4) dahil olmak üzere, embriyonun içinde derin bile dokular kolaylıkla görülebilir ve embriyo temizleme kullanımı organı sınırları keskin sınırlandırılmasını sağlayabilir.
Embriyoların Beyazlatma ölçüde pigment eksikliği albino embriyolarını kullanarak ihtiyacını ortadan kaldırdı peroksit çözümlerini kullanarak endojen pigment kaldırmak için. Farkı sürelerde, beyazlatma yararlı olabilir. Leke kuvvetli ise görülen bir pigmentasyon yararlı olabilir için, örneğin, hafif bir ağartma sağlayan hepsi içinDaha iyi evreleme ve embriyo (Şekil 2A) oryantasyonu için akımlarının. Leke ağartıcı çözelti içinde daha uzun süre inkübasyonu ile pigment tamamen ortadan kaldırılması yakınına böbrek (Şekil 2B) gibi pigmentasyon yüksek düzeyde, orada bir alan ise, ancak, daha iyi bir sonuç verir.
Embriyolar ne zaman çözeltide belirli pozisyon almak eğilimindedir. Nörülasyon sonra, onların yüzüne düz koymak eğilimindedir. Bu kanadını (Şekil 2B) görüntüler için iyi ama diğer alanları ile ilgili bir sorun olabilir. Bir agaroz baz kullanımı bir embriyo yönlendirmek için kullanabilirsiniz olabilir agaroz içine kanalları kesmek için izin verir. Örneğin, kan öncüler embriyo (Şekil 2A) ve boyama tam ölçüde ventral tarafına gözlemlemek zor olduğunu lokalize. Ventral yüzü yukarı olan bir kanalda embriyonun Konumlandırma, o gen ifade deseninin (Şekil 3A) tam görüntüleme için izin verir. in situ hibridizasyon çift kullanımı morfolojisi küçük farklılıklar olabilir, farklı embriyoların arasında karşılaştırma gerekliliğini ortadan kaldırarak tek bir organizma (Şekil 5) içinde iki gen ekspresyonu arasındaki ilişkiyi gösterebilir. Belki de en önemlisi, in situ melezleme kullanımı, bir açık, bir çok dokuda ifade edilir gibi pax2 bir soy erken progenitörlerin olarak ifade edilen genlerin sentezlenmesi göre histolojik farklılaşma önce hücreleri işaretlemek için verir erken embriyo, önceki farklılaşmasına (Şekil 4A). Böyle miyeloid hücre öncülerinin (Şekil 1B) açıkça histoloji dayalı ayırt edilmez atalarıdır ve dokuları, tespit yeteneği, bir organın gelişme durumu hakkında çok daha detaylı sorular sormak için araştırmacılar izin verdi ve ayrıca deneysel sonuçlarını değerlendirmek için manipulation bir dokunun dış farklılaşmaya neden olmak üzere tasarlanmıştır.
Şekil 1:. Xenopus embriyolar üzerinde in situ hibridizasyon bütün montaj örnekleri in situ hibridizasyon deneyinde bir mavi boyama açıkça erken Xenopus embriyo yapıların geliştirilmesi tasvir (A) bir sahne 26 embriyo bir ön görünümünü kuluçka bezi vurgulayarak. uvs.2 14 ifadesi ile ayrılır (B) aşamasında 28 bir işaretleyici olarak (C), erken kalp miyeloperoksidaz 15 ekspresyonunu kullanarak aşamasında 20 erken miyeloid hücrelerinin konumunu gösteren bir embriyo ventral görünüş.. - 30 kardiyak troponin I 16 ifadesi ile görüntülenmiştir. Bu yöntem kullanılarak açık bir avantajı, her olmasıdırBu gen ifadesi desenleri farklı problar kullanılarak görüntülendi ancak kullanılan protokol her durumda aynıdır edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: ağartma Farklı düzeylerde embriyo boyama görselleştirmek için kullanılabilir (A), bu embriyonun alt kısmındaki bu mavi boyama Bu bir bölgedir aşamada 36 hakkında en ventral kan adaları hemoglobin ifadesini gösterir. sadece hafifçe pigment ve böylece embriyo göz kahve renkli bir pigment ve embriyo yan tarafı boyunca görülebileceği gibi uzun bir süre boyunca ağartıldı değildi embriyosu. Pigmentasyonu görmek için güçlü olmak embriyonun aşamasında daha iyi görselleştirme sağlar. Boyama gibi sinir sistemi ve embriyo yan olarak daha büyük doğal bir pigmentasyon, bir bölgede ise, daha büyük bir ağartma B (B) 'de görüldüğü gibi, oluşturma böbrekte Burada yerinde PAX8 17 ifadesini görmek yardımcı olacaktır , Pronephric kanal ve Beyin en iyi beyazlatma hemen hemen tüm endojen pigment kaldırıldı sonra görüntülenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Agaroz baz Manipülasyon embriyoların yönlendirme ile yardımcı olabilir onlar çanak belirli pozisyon almak eğilimindedir çünkü embriyonun Görüntüleme belirli bölgeleri zor olabilir (A) tadpole anda yan yalan embriyoyu aşamaları.. . Kesim tarafındanting agaroz ince bir kanal (siyah oklar) embriyo iyi bir görüntü yakalamak için yeterli kararlılık ile, burada aşamada 36 hemoglobin ifadesini gösteren, ventral tarafta görülebilir. (B) aşamasında hand1 ifade Bu ventral görünüm 20 yanal plaka mezoderm 6 özetliyor. Embriyo ventral yüzü yukarı konumunu stabilize küçük bir delik yerleştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. İç organlar opak, temizlenmemiş ve temizlenmiş embriyolar hem görülebilir pax2 için lekeli bir temizlenmemiş embriyo aşamasında 34 (A), optik sap (sarı ok) nispeten kolay bir görsel olabilirnöral tüp aşağı boyama yapabilirsiniz. Ancak, detaylar keskin değildir. Optik sap (sarı ok) dahil embriyo (B) ifade siteleri sınırlarını, temizleyerek keskin. temizleme ölçüde bu temizlenmiş embriyo hem de gözleri görmek için yeteneği ile gösterilir. Ayrıca bazı boyama iç boşluklara (mor ok), temizlenmiş embriyolar görüntüleme ortak bir sorun birikmiş olduğunu unutmayın.
Şekil 5: a. Xenopus embriyo üzerinde in situ hibridizasyon bir temsilci çift yanal plaka marker ifadesi, hand1, gelişmekte olan damar içindeki etv2 26. İfade koyu mavi, mor leke tarafından görüntülenmiştir aşamada açık mavi boyama ile görüntülenmiştir. Hand1 sentezlenmesi genellikle çok yoğun olduğu ve bu nedenle t kullanılmıştırfloresan işaretli prob ve BCIP kombinasyonu o zayıf. zayıf etv2 ifade digoksigenin-etiketli prob ve BM-mor kombinasyonu kullanılmıştır.
| Isim | Nihai Konsantrasyon | Miktar / 100 mi |
| Mempfa | 1 mM MgSO 4 | 1 M MgSO 4 100 ul |
| (4 ° C'de mağaza) | 2 mM EGTA, pH 8.0 | 20 mM EGTA, pH 8.0 10 mi |
| 0.1 M MOPS, pH 7.5 | 1 M MOPS, pH 7.5, 10 mi | |
| % 4 paraformaldehit, pH 7.5 | % 8 Paraformaldehit, pH 7.5, 50 mi | |
| TTW | 50 mM Tris, pH 7.4 | 1 M Tris, pH 7.4 5 mi |
| 200 mM NaCI | 5 M NaCl 4 mi | |
| % 0.1 Tween 20 | Tween 20, 100 ul | |
| 100X Denhardt Çözümü | % 2 BSA | 2 g BSA |
| (0.2 um'lik bir filtreden filtre | % 2 PVP-40 | 2 gr PVP-40 |
| -20 ° C'de mağaza) | 2% Ficoll 400 | 2 g Fıcoll 400 |
| 20X SSC | 3 M NaCI | 17.5 gr NaCl |
| 300 mM trisodyum sitrat | 8.8 g trisodyum sitrat | |
| RNA hibridizasyon tampon | % 50 formamid | % 100 formamid 50 mi |
| (4 ° C'de mağaza) | 5x SSC | 20x SSC 25 ml |
| 1 mg / ml maya RNA, | % 50 formamid içinde çözülmüş 1 mg / ml maya RNA 4 mi | |
| 1X Denhardt Çözümü | 100x Denhardt Çözüm 1 ml | |
| % 0.1 Tween 20 | Tween 20, 100 ul | |
| 5 mM EDTA, pH 8.0 | 0.5 M EDTA, pH 8.0, 1 ml | |
| MAB | 100 mM Maleik asit | Maleik asit 1.16 g |
| (4 ° C'de pH 7.5, mağaza) | 150 mM NaCI | NaCI 0.88 g |
| MAB + HTSS + BR | 100 mM Maleik asit | MAB 96 mi |
| % 4 Isıl İşlem Görmüş Koyun Serum | Isıl İşlem koyun serumunda 4 ml (ısı 30 dakika boyunca 55 ° C'de işlemden geçirildi ve parçalara ayrılır) | |
| % 2 Engelleme Reaktif | Roche bloke edici tepkin madde, 2 g | |
| MAB + HTSS + BR + Anti-Kazı antikoru | 100 mM Maleik asit | MAB 96 mi |
| % 4 Isı TrEated koyun serumunda | Isıl İşlem koyun serumunda 4 mi | |
| % 2 Engelleme Reaktif | Roche bloke edici tepkin madde, 2 g | |
| 1: 10,000 anti-DIP-AP, Fab fragmanları Antikor | Anti-dioksijenin-AP, Fab fragmanları, antikor 1.5 ul | |
| Alkalin Fosfataz (AP) Tampon | 100 mM Tris, pH 9.5 | 1 M Tris, pH 9.5, 10 mi |
| 50 mM MgCl2 | 1 M MgCl2, 5 ml | |
| 100 mM NaCI | 4 M NaCl 2.5 mi | |
| % 0.1 Tween 20 | Tween 20, 100 ul | |
| Ağartma Çözelti | % 0.3 H2O 2 | 30% H, 3.34 ml H2O 2 |
| % 5 formamid | % 100 Formamid 5 mi | |
| % 0.5 SSC | 20x SSC 2.5 ml | |
| Takas Çözüm | 1/3 Benzil Alkol | 33 mi |
| 03/02 benzil benzoat | 67 mi |
Tablo 1: Çözüm Tarifler
| Isim | Miktar |
| Kazı-NTP Mix | 20 mM CTP 5 ul |
| (40 ul reaksiyon) | 20 mM GTP, 5 ul |
| 20 mM ATP, 5 ul | |
| 20 mM UTP 3.25 ul | |
| 10mM Dig-11-UTP 3.5 ul | |
| 18.25 ul damıtılmış, otoklava su | |
| Probe Sentezi | şablon DNA x ul(Konsantrasyonuna bağlıdır) |
| (20 ul reaksiyon) | damıtılmış, otoklavlanmış su x ul |
| Kazı-NTP karışımı 4 ul | |
| RNaz inhibitör 0.5 ul | |
| 10X RNA polimeraz tamponu 2 ul | |
| RNA polimeraz 2 ul |
Tablo 2: Probe Sentez Tarifler
| Reaktif Adı | Yaklaşık Hacim | Süre | Sıcaklık |
| % 100 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 75 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 50 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 25 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| TTW | 2 mi | 10 dk sallanan | Oda Sıcaklığı |
| TTW | 2 mi | 10 dk sallanan | Oda Sıcaklığı |
| TTW | 2 mi | 10 dk sallanan | Oda Sıcaklığı |
| RNA Hibridizasyon Tamponu ve Yoklama Öncesi sıcak 65 ° C | |||
| TTW | 4 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| TTW | 4 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| RNA hibridizasyon tampon | 2 mi | 10 dk sallanan | Oda Sıcaklıke |
| RNA hibridizasyon tampon önceden ısıtılmış | 2 mi | 1 saat, sallanan | 65 ° C |
| Probe Çözüm | 1 mi | Gecede, sallanan | 65 ° C |
Tablo 3: İlk Günü Situ Hibridizasyon Protokolü (yaklaşık 3 saat toplam) için Adımlar
| Reaktif Adı | Yaklaşık Hacim | Süre | Sıcaklık | ||||
| Ön sıcak RNA melezleme tamponu ve 37 ° ila 65 ° C ve 2 x SSC 02.x SSC Cı | |||||||
| Tekrar kullanım için tüp prob çözümü dön | |||||||
| RNA hibridizasyon tampon | 2 mi | 10 dk sallanan | 65 ° C | 2X SSC | 2 mi | 20 dk, sallanan | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 mi | 20 dk, sallanan | 37 ° C | ||||
| 0.2x SSC | 4 mi | 1 saat, sallanan | 65 ° C | ||||
| 0.2x SSC | 4 mi | 1 saat, sallanan | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1.5 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı | ||||
| MAB + HTSS + br + anti-DIG antikoru | 1.5 mi | Gecede, sallanan | 4 ° C |
Tablo 4: İkinci Günü Situ Hibridizasyon Protokolü (yaklaşık 4 saat toplam) için Adımlar
| Reaktif Adı | Yaklaşık Hacim | Süre | Sıcaklık |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| MAB | 4 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| BM Mor AP Yüzey | 500-750 ul | Gecede, sallanan (metne bakınız) | Oda sıcaklığı / 37 ° C (metin bakınız) |
Tablo 5: Üçüncü Günü Situ Hibridizasyon Protokolü (yaklaşık 7 saat) için Adımlar
| Reaktif Adı | Yaklaşık Hacim | Süre | Sıcaklık |
| % 25 metanol | 2 mi 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı | |
| % 50 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 75 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 100 metanol (soğuk) | 2 mi | 20 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 100 metanol (soğuk) | 2 mi | Değişir, hiçbir sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 75 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 50 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 25 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| Mempfa | 2 mi | 30 dakika, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 25 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 25 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 25 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| Ağartma Çözelti | 4 mi | 40 dk-3 saat, sallanan | Oda sıcaklığı / 37 ° C (metin bakınız) |
| Embriyolar saklanması | |||
| % 25 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 50 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 75 metanol | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| % 100 metanol | 4 mi | -20 ° C'de bir | |
| 1x PBS | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| 1x PBS | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
| 1x PBS | 2 mi | 5 dk, sallanan | Oda Sıcaklığı |
Tablo 6: Embriyolar Yerinde Hibridizasyon, Bleaching ve Depoda durdurma için Adımlar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belirli genlerin ifade desen görselleştirmek için in situ hibridizasyon kullanma yeteneği Xenopus embriyo belirli organları veya hücre tiplerini belirlemek için en sık kullanılan yöntem olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni, bu teknik ile sunulan çeşitli avantajlar taşımaktadır. Bir genin ekspresyonu, bu hücrelere 18 arasında açık bir sınır önce kalp atalarda Nkx2.5 ekspresyonu için halinde de farklılaşma herhangi bir histolojik işareti önce belirli yapıları belirleyebilir. Reaktiflerin her el kez, o da çok maliyetli olduğunu. Etkili bir şekilde yeniden bir çok ayrı ayrı prob, üretilmesi fazladan zaman ve ilgi genleri kodlayan plazmidler elde başka maliyet yatırım ile mümkündür. Bizim tecrübelerimize göre, sondalar her kullanımdan ile gelen kaçınılmaz küçük seyreltilerde rağmen aktivite çok az kayıpla yıl için yeniden olabilir. Son olarak, çok az optimizasyon requi oradaKırmızı farklı problar kullanarak zaman.
prob sentezi kalitesi protokolünün başarısında önemli bir faktördür. Orada RNA prob kalitesini kontrol etmek için birçok yolu vardır, ancak sadece bir TAE jeli üzerinde RNA probu çalışan oldukça güvenilir hızlı ve kolay bir yöntemdir. Biz rutin RNA leke etidyum bromür kullanımı ve çoğu kurumlar tarafından özel işlem ve jellerin bertaraf gerektirir. Biz özellikle görselleştirme problar karşılaştırdık değil, ancak toksik olmayan alternatif ticari olarak temin edilebilmektedir. Bir TAE jel üzerinde DNA ile karşılaştırıldığında biraz bulanık görünmesine karşın prob bir tek bant olarak çalıştırmanız gerekir. RNA miktarı hakkında bir tahmini elde edilebilir: iyi bir reaksiyon RNA'nın yaklaşık 1 ug / ul olacak. Kolayca görüntülenmiştir bant RNA en az 0.5 ug temsil edecek ve parlak bant 1 mikrogram üzerinde temsil edecek. Açıkça tamamen doğru ve biraz tecrübe gerektiren rağmen jel rap üzerine, miktar bazlıid ve yerinde prosedüründe sağlamlığı iyi çalışmasını sağlar. Tekrarlanabilirlik hakkında endişe varsa, kolayca bulduğumuz değil, ancak bu önemli bir sorun olmaya, transkripsiyon reaksiyonu küçük bir miktarını ölçmek için UV absorbansı kullanabilirsiniz. Son olarak, jel şablon DNA ortadan kalkmıştır olmadığını bir görmenizi sağlar. Jel hiçbir RNA olduğunu gösteriyorsa, iki en muhtemel açıklamalar kötü bir DNA şablonu veya transkripsiyon tampon iyi çalışmadığını. Transkripsiyon 37 ° C'ye kadar tampon ve bir karışım kullanımdan önce ya da transkripsiyon reaksiyonu için taze 100 mM DTT ve 1 ul ilave ısıtılması arada ikinci yardımcı olabilir. Transkripsiyon reaksiyon tamponu önemli bir bileşeni spermidin ve önemli tampon ısınma yapma, düşük sıcaklıklarda DNA şablonu hızlandırabilir. Tampon çözeltisi içindeki DTT, aynı zamanda reaksiyonun engellenmesi önemli ölçüde hızlandırabilir. Bir çökelti tamponu içinde görüldüğü takdirde bir çözüm ısınmaya bırakılmış vegirdap şiddetle. Böyle RNAz aktiviteyi engellemek için, DEFPC veya otoklav ipuçları ve tüpler su ile muamele gibi herhangi bir olağandışı önlemler alarak gerek yoktur. Ticari ribonükleaz inhibitörünün varlığı ortamından RNaz'larına karşı önemli bir koruma sağlar. Diğer UTP etiketler, deneyim, ancak, fluoresein gibi kullanılabilir unutmayın, digoksijenin ile etiketlenmiş UTP ve anti-digoksigenin antikor kombinasyonu, en tutarlı sonuçlar verir.
Prob üretimi için erken protokoller sentezlenmiş prob alkalin hidrolizi daha sondajı için izin vermek için 4 yapılması gerektiğini göstermektedir. Prob hidrolizi, in situ hibridizasyon işleminde yardımcı olmak için görünmez; Daha büyük, 500 bp RNA probları genellikle mükemmel bir sinyal ve uzunluğu en fazla 2 kb'lik de iyi iş olan problar sağlar. Hedef RNA bol ise, kısa sondalar çalışabilir, ancak daha uzun problar, b verecekyere tarafından lekelenmesi. Uzun problar kırmak için alkalin sindirim kullanarak herhangi net bir avantaj olmalı görünmüyor.
Embriyoların ilk işlemede Bakım çok önemli. Döllenme zarfın çıkarılması nöral kat kapatılması ve önceki gübreleme zarfın dışına doğal kuluçka sonrası embriyolar için özellikle yararlıdır. Döllenme zarfın içindeki embriyonun uzama sırasında, embriyo kıvrılmış olur ve bu pozisyonda sabit olursa, embriyolar in situ hibridizasyon sonra görüntüye zordur. Embriyolar tespitten önce gübreleme zarf kaldırılır Ancak, hızla düzeltmek. Embriyolar membran çıkarılması sırasında zarar görmüşse, zarar görmüş doku yara yerinde in situ hibridizasyon sinyali bir yanlış neden olabilir, çünkü onları tespitten önce yara iyileşmesi için izin verir. Küçük olursa, yaralar genellikle dakika 19 içinde, çok hızlı iyileşir. Ayrıca embriyolar du zarar verebilir sonra adımlarçözüm değiştirirken halka sıvı transferi ve böylece bakım gereklidir. Erken adımda Hasar genellikle embriyo kötü prosedürün sonunda zarar görür ve hasarlı bölgeler hasar görünce yerinde sinyalleri yanlış yol anlamına gelir. Bundan başka, 30 embriyo, ancak bu telafi edilebilir gece boyunca günde 3 ya da çamaşır deterjanı yıkama artan kolorimetrik reaksiyon esnasında gelişen yüksek bir arka plan ve yüksek şansı vardır tek bir küçük şişe içinde, ancak daha fazla embriyolar ile problanabilir.
Bu protokolde, adım sayısı azaltılmış ve birkaç sık kullanılan reaktiflerin kullanımı ortadan kalkmıştır. Bu protokol, proteinaz K sindirimi ve pozitif yüklü grupları bloke etmek üzere, asetik anhidrid kullanılması da dahil olmak üzere pek çok başka protokoller kullanılır kaç aşamayı ortadan kaldırır unutmayın. Memeli ve kuş embriyolar ama Xenopus kullanarak ararken bu adımlar yine bu adımları ortadan kaldırarak o küçük bir etkisi vardır, yararlı olabilirn in situ hibridizasyon nihai sonuçları. Bu aynı basitleştirmeler diğer türler için in situ hibridizasyon protokolleri de uygulanabilir olup olmadığını Bizim laboratuvar belirlememiştir. Özellikle proteinaz K sindirimi hala bu tür prob girmesinin büyük sınırlamalar olabilir civciv veya fare gibi diğer embriyolar gerekebilir.
BM mor alt tabakanın kullanımı kolay ve güvenilir. Ancak, embriyo hedef RNA'yı lokalize için gerekli olan çökeltme, renk alkali yüzeyler için kullanılabilen diğer seçenekler vardır. Özellikle, NBT / BCIP bir kombinasyonu yaygın kullanılan 4 ve iyi çalışır. Bazı renk reaktifleri, bu durumda, boyama sonrası metanol kullanımı leke ortadan kaldırır ve kaçınılması gereken, metanol içinde çözünmektedir. Situs yılında double yaparken diğer renk kombinasyonları da kullanılabilir. benzer bir kombinasyon (yerine BM mor daha NBT / BCIP) kullanımı da gösterilmiştirFare embriyoları 20 kullanırken çok sağlam olması. boyama mavi renk ve embriyo endojen pigment açıkça resimlerde ayırt etmek genellikle zordur. Albino embriyoların kullanımı da pigment ortadan kaldıracaktır ama beyazlatma solüsyonu neredeyse etkilidir ve üreme için albino yetişkin bakım gerektirmez olarak çok daha uygundur. Boyama nispeten zayıf ise, güçlü ağartma o boyama vurgulayabilirsiniz. Boyama güçlü ise, bazı hafif pigment bırakarak etkili bir kontrast olması ve ayrıca yönlendirme ve embriyo evreleme ile yardımcı olabilir.
RNA prob gecede melezleme sonra, protokol in situ hibridizasyon robot bir kullanımına burada özetlenen kesinlikle manuel protokol sapmak yapabilirsiniz. Robot gece boyunca çalışır gibi in situ hibridizasyon robot kullanımı bir gün azaltılabilir Gün İki ve manuel protokol Günü Üç neredeyse bir tam gün kaydeder bird Uygun sıcaklık değişiklikleri tüm yapabilirsiniz. Robot aynı zamanda sonuçları çok tutarlı ve eş zamanlı verimli birçok örneklerin tarama sağlar. Bu problar yeniden kullanımı ve reaktif küçük hacimlerde kullanımına izin verir gibi elle ilk gün yapmak için avantajlı kalır. Bir robot kullanarak tek önemli dezavantajı aracın ilk maliyetidir.
Bu protokol in situ hibridizasyon yolları etkin görüntü bir bazı anlatılır. Bu görüntü zayıf ise bilgi öylesine kadar kaybolmuş olabilir yapmak önemlidir. Bir çok durumda, bir deney yerinde sonuçlarının görüntüleme İlk deneyde, aynı zaman gerektirir. Bu tür beyazlatma derecesi olarak işlem değişkenleri bazı unsurları kişisel bir tercih unsuru var. Diğer görüntüleme etkileri renkli bir taban çanak yerleştirerek elde edilebilir. Genellikle agar hafif mavi bir gölge oturup içinde derin mavi boyama vurgulayabilirsinizu melezleme. Basitçe istenen etkiyi elde etmek için mavi plastik bir levha üzerinde agar içeren petri koydu.
Ancak, burada özetlenen yöntemler görüntüleme olanaklarını keşfetmek için bir temel sağlar. (Normal aydınlatma koşulları altında göründükleri gibi inceledi) Embriyolar inceledi ya silinebilir ya da temizlenmemiş (daha iyi görünüm iç yapıları şeffaf yapılan). Görüntü embriyo ifade sitesinde bağlıdır nasıl açısından kararın bazı. Ifadesi ya da embriyo yüzeyine yakın ise, bu takas olmadan embriyo görüntüye en iyisidir. Temizlenmemiş embriyolarını kullanarak çeşitli avantajları vardır. Embriyoların temizleme süreci birçok adımlar ve embriyoların temizlemek için kullanılan kimyasallar ele zordur gerektirir. Ayrıca, embriyo birkaç boşluklar yanlış kavite boyama neden olabilir alkalin fosfat yüzeylerde yağış izin verir. Erken embriyolar ve pharyn özel olarak, blastocoelgeal boşluğu genellikle boyama (Şekil 4) gösterilmektedir. Bu sahte boyama temizlenmez embriyolar görünmez. Çoğunlukla, hatta orta derin ifadesi gibi kalp, böbrek, ve Somitlerin gibi mezodermal dokular ve tiroid ve karaciğer gibi Endodermal yapılarınının dahil, temizlenmemiş embriyolarda görülebilir. Görüntüleme için PBS hidrat veya depolama için 100% koymak metanol ya bir metanol dizi embriyolar hareketli depolama ve görüntüleme birden tur için izin verir. metanol depolama biri uzun süre boyunca görüntüleme farklı değişiklikler denemek için izin verir.
Gen ifadesi bakmak için in situ hibridizasyon tekniği kullanarak bazı dezavantajları vardır. Bir embriyo ifade ve anlatım etki boyutunda değişiklikler brüt değişiklikler içinde karşılaştırma genellikle açık olmasına rağmen ifade Düzeyleri kesinlikle ölçülebilir değildir. Diğer RNA bazlı teknikler ile olduğu gibi, t herhangi bir bilgi sağlamazSonuçların yorumlanması zaman, ilgilenilen gen tarafından kodlanan proteinlere o. Son olarak, gerçek ifade etki karşılaştırıldığında arka plan boyama ne olabileceğini belirlemek oldukça zordur. Bu, özellikle yaygın olabilir bilinmeyen bir ifade deseni ile genler ile bir sorundur. Çoğu zaman, aynı genin sens şeridi oluşturulan bir prob, spesifik olmayan boyama için kontrol olarak kullanılır. Bir anlamda iplik kontrol kullanımı reaktifleriyle bir sorun ile ilgili bazı bilgiler sağlayabilir ancak antisens probu dayalı boyanarak tamamen doğru olduğunu kesin kanıt sağlamaz. Birden çok embriyolar kullanıldığında in situ elde edilen sonuçlar, önemli ölçüde, genellikle embriyolar tutarlı olan ve bu boyanması güven bir ölçüsü olarak kullanılabilir. Ayrıca, bir genin farklı bölgelerinde, özellikle ötelenmemiş bölgeleri, elde edilen farklı antisens sondaları, aynı boyama tarzı veren olmadığını görmek için kullanılabilir. Onlar çok yaparsanız,özdeş olup olmadığını, aynı zamanda, gözlenen lekelenmenin desen güven sağlar. Seyreltilmiş probları, aynı zamanda, aynı boyama modeli ortaya olup olmadığını görmek için boyama çözeltisine uzun süreli maruz kalma ile birlikte kullanılabilir. Genellikle boyama desen güven ilham bir faktör olduğunu desen belirli bir embriyonik yapıya karşılık olup olmadığı. Situs yeterli şimdi yeni anlatım kalıpları nispeten nadir olaylar muhtemel genlerin büyük bir çeşitlilik ile yapılmıştır. In situ görüntülerde büyük veritabanları görüntü sonuçları karşılaştırmak için kullanılabilecek farklı organizmalar için kurulmuştur. Xenopus embriyolar için, Xenbase (www.xenbase.org) ifade kalıplarını anlamak için kullanılabilecek bir kaynak mükemmel bir örnektir. Diğer model organizmalar da görüntülerin benzer, geniş veritabanları var.
Bu potansiyel uyarılar rağmen, in situ hibridizasyon için son derece yararlı olan güçlü ve güvenilir bir araç kalırorganogenezisin çalışma. Bu hücre tipleri belirleme ve öngörülebilir gelecekte gen ifadesi etki değişikliği incelemek için tercih edilen yöntem kalması muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
