Protocol
1. Preparación de embriones
- Si no se hace rutinariamente como parte del cultivo de embriones, de-jalea los embriones utilizando 2,5% de cisteína, pH 8,0 antes de la fijación 8. Aunque no es absolutamente necesario, es útil a continuación, quitar manualmente el sobre fertilización antes de la fijación utilizando unas pinzas finas.
- Utilice pipetas Pasteur de vidrio para transferir los embriones. La pipeta no es lo suficientemente amplia como para transferir los embriones a fin de utilizar una pluma de diamante para cortar la pipeta de vidrio en un punto lo suficientemente amplia como para recoger un embrión. Eliminar los bordes afilados de las pipetas después del corte pasando rápidamente la punta de corte a través de la llama de un mechero Bunsen para fundir los bordes afilados.
NOTA: El cuidado necesita ser tomado, como el vidrio puede todavía ser lo suficientemente caliente como para causar quemaduras a pesar de que parece haber enfriado mediante inspección visual.
- Utilice pipetas Pasteur de vidrio para transferir los embriones. La pipeta no es lo suficientemente amplia como para transferir los embriones a fin de utilizar una pluma de diamante para cortar la pipeta de vidrio en un punto lo suficientemente amplia como para recoger un embrión. Eliminar los bordes afilados de las pipetas después del corte pasando rápidamente la punta de corte a través de la llama de un mechero Bunsen para fundir los bordes afilados.
- Realizar la fijación de embriones en etapas. En primer lugar, preparar viales de vidrio para su uso en la fijación del embrión. Utilice estos viales para todos los pasos incluidos definitivaalmacenamiento. Utilice viales que son claras con una buena junta de teflón en la tapa, lo que permite el seguimiento de los embriones durante todos los pasos del proceso. Etiquetar los viales con información experimental apropiado usando un marcador permanente y luego cubrir la etiqueta con cinta adhesiva transparente, ya que incluso marcador permanente se perderá en el curso del procedimiento debido a la utilización de alcoholes y otros disolventes.
- Utilice Mempfa para fijar los embriones. Hacer un stock de 8% de paraformaldehído en lotes de 50-100 ml a la vez. Utilice aproximadamente el 75% de la H 2 O y se requiere calor a 50-60 ° C, la cual es necesaria para obtener el paraformaldehído en solución.
NOTA: Esta solución es ligeramente diferente que el MEMFA utiliza en las versiones protocolo publicado de edad en que se utiliza paraformaldehído en lugar de formaldehído. - Añadir 2-3 gotas de NaOH 10N o hasta que el pH es de aproximadamente 7,5 (papel de pH uso para comprobar pH). El paraformaldehido es muy tóxico, por lo tanto, generar la solución madre en una campana de humos. Una vez que el párrafoformaldehído está en disolución, filtrar la solución a través de papel Whatman en un recipiente fresco y añadir H2O hasta el volumen final. Si es necesario, almacenar la solución de paraformaldehído al 4 ° C durante 1-2 semanas.
- Montar los componentes restantes de la solución de fijación Mempfa (Tabla 1). Asegúrese de que la concentración final de trabajo de paraformaldehído es del 4%. Guarde todos los componentes de la solución de fijación a 4 ° C como las acciones.
- Con una pipeta de cristal tallado, fijar los embriones mediante la adición de los embriones a los viales de vidrio etiquetados que se han llenado con los aproximadamente 3.4 ml de solución Mempfa (Tabla 1). Evite fijar más de 20 a 30 embriones por vial. Añadir los embriones con un mínimo de transferencia de líquido del medio de embrión. Fijar embriones en solución Mempfa durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Para estructuras endodermo finales de realizar el en situs en aislado manualmente la tripa y endodermo derivados 9,10, Lo que permite una buena penetración de la sonda y también evita la tinción de la cavidad.
- Guarde una solución de metanol al 100% a -20 ° C. Después de la fijación de paraformaldehído, sustituir la solución Mempfa con aproximadamente 4 ml de la -20 ° C, 100% de metanol durante el almacenamiento de los embriones.
- Agitar los viales después de la adición del metanol para evitar que los embriones se pegue a la de vidrio o de otros embriones. También, asegúrese de que los viales se cierran herméticamente porque el metanol puede evaporarse en el congelador con el tiempo si suelta.
NOTA: Los embriones se puede almacenar durante al menos un año, y probablemente más largo, en el metanol antes de la tinción sin pérdida de la calidad de hibridación in situ.
- Utilice Mempfa para fijar los embriones. Hacer un stock de 8% de paraformaldehído en lotes de 50-100 ml a la vez. Utilice aproximadamente el 75% de la H 2 O y se requiere calor a 50-60 ° C, la cual es necesaria para obtener el paraformaldehído en solución.
2. Preparación de la sonda
- Utilice 1-2 g de ADN plantilla para hacer las sondas marcadas con digoxigenina. Cut plásmido que contiene la secuencia de ADN apropiada en el extremo 5 'del gen de interés con un enzima de restricción adecuado para That vector para generar sondas antisentido.
NOTA: El plásmido debe tener un sitio de unión de ARN polimerasa apropiada (por ejemplo, T7, T3, o SP6). - Permitir que el ADN, el agua, mezclar y NTP tampón de polimerasa para calentar a temperatura ambiente antes de montar la reacción de síntesis de la sonda. Añadir los componentes de la reacción de síntesis de ARN a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en el orden que se enumeran en la Tabla 2. Ajustar el volumen de agua añadida para llevar el volumen total de la reacción de síntesis de la sonda a 20 l. Montar la reacción a temperatura ambiente ya que los componentes del tampón de la polimerasa pueden precipitar el ADN de la plantilla cuando se encuentra en altas concentraciones y frío.
- Se incuba la reacción de transcripción durante 2 horas a 37 ° C.
NOTA: Las incubaciones de poco más de dos horas conduce a efectos adversos, pero también muestran poco aumenta el rendimiento. Si se incubaron durante una hora, el rendimiento se reducirá, pero todavía suficiente para hacer una buena sonda.- A la espera de la reacción de transcripción a fin, hacer un gel de agarosa que se utilizará para probar la calidad de la sonda. Derretir 1 g de agarosa en 100 ml de tampón 1x TAE (ver Tabla 1) por calentamiento de la solución a la temperatura de ebullición. Retire la solución del calor cuando el polvo de agarosa se haya disuelto completamente.
- Añadir 2 l de bromuro de etidio solución madre (10 mg / ml) a aproximadamente 100 ml de gel de agarosa cuando la agarosa se ha enfriado a aproximadamente 60 ° C para permitir la visualización de ARN bajo luz ultravioleta (UV).
NOTA: Esta solución de gel de agarosa se puede mantener en una incubadora a 60 °, de modo que los geles futuras se pueden verter sin derretirse repetido. Tenga cuidado en el manejo de bromuro de etidio debido a la toxicidad potencial.
- Añadir 1 l DNAsaI (RNasa libre de grado) a la reacción de transcripción después de la incubación de 2 horas y se incuba durante otros 10 min a 37 ° C para eliminar la plantilla de ADN.
- Retire 1 l de la mezcla de reacción acomprobar en la agarosa TAE-gel 1% y el resto (20 l) añadir 80 l de SDS al 1% en tampón TE (10 mM Tris pH 8,0, EDTA 1 mM), 10 l de 5M NH 4 de etilo y 220 l de etanol de frío. Vortex la mezcla vigorosamente y dejar de lado en hielo hasta que se conozcan los resultados de la verificación de la calidad del ARN.
- Ejecute los 1 l de ARN retirados antes de la precipitación en la agarosa-TAE gel 1%. Para facilitar la carga en el gel, añadir 4-5 l de agua y 1 l de colorante de carga estándar a la ARN. Ver el ARN en el gel usando un transiluminador de luz UV con el fin de comprobar la calidad de la sonda (véase la discusión).
- Precipitar el ARN restante que fue anulada por el hielo en el paso 2.5 al girar en una microcentrífuga a toda velocidad durante 10 a 15 minutos. Trasvasar el sobrenadante con una pipeta de vidrio estirado hacia fuera y dejar secar brevemente.
- Resuspender la sonda con 1 ml de tampón de hibridación de ARN (Tabla 1) en el tubo eppendorf. Vortex y briefly calentar el tubo a 37 ° C y agitar de nuevo. Transferir la solución de la sonda a un 15 ml tornillo tubo de poliestireno tapa y rellene hasta 7-10 ml con tampón de hibridación de RNA. Nota: La sonda puede diluirse más (una dilución adicional de 10 veces todavía puede trabajar) a menudo resulta en una baja de fondo, pero las reacciones de tinción también llevará más tiempo.
3. Hibridación in situ
- Tome los embriones que se almacenaron en -20 ° C metanol y se deja calentar a temperatura ambiente. Realice todo el procedimiento en los frascos de vidrio. Si diferentes embriones de un grupo van a ser examinado por diferentes sondas, mantenerlos en un solo vial hasta justo antes de añadir las sondas para reducir la variabilidad y el trabajo en el primer día.
- Rehidratar los embriones a través de una serie metanol como se indica en la Tabla 3 (véase la Tabla 1 para las recetas de lavado) en preparación para la adición de la sonda. Agite suavemente el embryos después de cada cambio para asegurarse de que no se adhiera a las paredes o entre sí, y el rock los embriones mediante el montaje de los viales en un nutator. Al transferir los líquidos, compruebe el interior de las tapas para asegurarse de que los embriones no han sido atrapados allí.
- Una vez en la solución de la sonda, hibridar los embriones durante la noche como se describe en la Tabla 3.
- Retire la solución de la sonda. Guarde la sonda utilizada mediante el almacenamiento en unos 15 ml tornillo tubo de poliestireno tapa, se indica la fecha y el número de veces que la sonda se ha utilizado, a -20 ° C.
NOTA: La misma sonda se puede reutilizar muchas veces para su posterior hibridaciones in situ hasta que las reacciones colorimétricas comienzan a tomar un tiempo anormalmente largo para llegar a la intensidad deseada.- Una vez que se quita la sonda, la preparación de los embriones para la tinción de anticuerpos contra la sonda a través de la serie de lavados descritas en la Tabla 4. Cambiar la temperatura según sea necesario (Tabla 4) por t moverél nutator, con viales de embriones adjuntos, directamente en hornos de hibridación que se establecen en la temperatura adecuada.
- Completar el volumen apropiado del MAB + HTS + BR + contra Dig-anticuerpo (Tabla 4) en el momento en que los embriones se incuban en el MAB + HTS + BR solución de bloqueo para que el anticuerpo se bloquea antes de añadir a la embriones. Hacer las soluciones de bloqueo fresco en el día de uso.
- Retirar la solución de anticuerpo y comenzar lavados como se indica en la Tabla 5 después de la incubación durante la noche con anticuerpo. Realizar al menos doce 30 min lavados con el fin de preparar para la tinción con el sustrato de fosfatasa alcalina y reducir el fondo tanto como sea posible. Utilice búfer MAB o solución OTC (Tabla 1) para los pasos de lavado.
NOTA: la solución OTC es TTW que tiene 2 mg / ml de BSA.- Sustituir la última solución de lavado con el sustrato de la fosfatasa alcalina púrpura BM. Realice los reac tinciónya sea en la temperatura ambiente o 37 ° C.
NOTA: La tinción es más rápida a 37 ° C pero si se deja durante la noche, la tinción de fondo inaceptable a menudo puede ser el resultado. Las reacciones de tinción a menudo requieren tinción durante la noche y la temperatura ambiente es más seguro para esto. - Si se requiere mayor tinción y la solución púrpura BM está adquiriendo un color azul, sustituir la solución de tinción con frescos BM púrpura y poner los tubos en 37 ° C. Si el ARNm diana es muy abundante, poner los embriones en la solución de tinción a 4 ° C durante la noche y luego pasar los embriones a temperatura ambiente o 37 ° C para permitir un mejor seguimiento de la reacción de tinción.
- Supervisar nuevas reacciones con cuidado, ya que el tiempo de resultado final varía considerablemente entre los diferentes ARN diana. Por coherencia, detener la reacción de tinción (véase 3.4) cuando no hay nuevos sitios de expresión que surge con incubación más largo. Es importante destacar que, si la hibridación in situ se utiliza como un ensayopara los experimentos que buscan en diferentes grupos de tratamiento, utilizar el mismo tiempo para reacciones de color entre el tratamiento y control de los embriones.
- Sustituir la última solución de lavado con el sustrato de la fosfatasa alcalina púrpura BM. Realice los reac tinciónya sea en la temperatura ambiente o 37 ° C.
- Detener la reacción de tinción y preparar los embriones para el almacenamiento y grabación de imagen cambiando los líquidos tal como se indica en la Tabla 6. No balancee los embriones en esta etapa debido a la eliminación de la mancha puede ser visualizado como coloración violeta del metanol alrededor de los embriones.
NOTA: A menudo los embriones tienen una tinción con azul de luz de la solución de tinción y el metanol frío puede eliminar al menos parcialmente que, aunque esto no es suficiente para eliminar el fondo pesado o tinción de la cavidad. Metanol frío se refiere a metanol que se mantiene en un congelador a -20ºC.- Rehidratar los embriones y fijar la mancha con Mempfa (Tabla 6). Una vez fijada, retire el Mempfa y lavar los embriones con 25% de metanol.
- Retire el metanol 25% y añadir la solución de blanqueo si la eliminación de pigmento endógenose requiere. Tenga cuidado en el manejo de la solución de blanqueo, ya que puede causar quemaduras. Observe el blanqueo de cerca como sucede con relativa rapidez y el grado de blanqueo se puede variar para diferentes efectos (Figura 2).
- Deshidratar embriones a través de una serie de metanol al 100% de metanol durante el almacenamiento a largo plazo después de blanqueo, o transferir a PBS para el almacenamiento a corto plazo y la imagen posterior (ver Tabla 6).
4. Imaging embriones
- Una vez que un embrión se ha completado el proceso de tinción, imagen del embrión para que se captura la información en que se expresa el gen de interés para un público más amplio. Use 1% de agarosa como fondo para ver los embriones no despejadas.
NOTA: La agarosa da un fondo azul / gris que contrasta con el embrión y el color azul de la reacción de tinción. También ayuda a difundir sombras molestas y reflexiones que desvían la atención del embrión.- Añadir agarosa al agua y luego llevar a ebullición hasta que la agarosa se encuentra en solución y luego dejar enfriar a 50 antes de verter en la placa de Petri. Al igual que con la solución de gel TAE, almacenar la solución de agarosa en 55 ° C incubadora para múltiples usos. Verter la agarosa a una profundidad de aproximadamente 2 mm en la placa de Petri. Si es necesario, ajustar la profundidad de agarosa para producir un tono ligeramente diferente de la de fondo.
- Después de la rehidratación del almacenamiento en metanol a una solución acuosa (PBS o TTW), utilizando una serie de metanol, colocar los embriones en una placa de Petri con la base de agarosa (véase la Tabla 6). Mantenga la solución limpia y, si es necesario, utilizar el filtrado sencilla para eliminar pequeñas partículas que pueden perturbar el fondo limpio de buenas imágenes.
- Para la imagen de los embriones de los puntos de vista alternativos, como desde el lado ventral, cortan canales delgados en la agarosa para encajar el embrión utilizando unas pinzas finas y colocar los embriones en esos canales para la orientación (Figura 3 NOTA: La mayoría de etapas tienen una posición característica que asumen cuando se coloca en solución. Por ejemplo, los embriones blástula etapas tienden a sentarse animales hacia arriba. Una vez que los embriones comienzan a alargarse, ponen de su lado.
- Utilice la fuente de luz de fibra óptica para iluminar el embrión a partir de un ángulo pequeño, la creación de sombras sobre el embrión que proporcionan profundidad a la imagen y ayudar a discernir estructuras superficiales. Debido a que el blanqueamiento puede eliminar pigmento que proporciona puntos de referencia útiles, utilizar sombreado para los embriones fuertemente blanqueados.
- Desactive los embriones a tinción imagen que es profundo dentro del embrión, como en la notocorda, pulmón, o regiones del cerebro, (Figura 4). Para lograr esto, poner los embriones a través de una serie metanol hasta en 100% de metanol.
- Después de la inmersión completa en metanol, transferir los embriones a una solución de una parte de alcohol bencílico y dos partes de bencilo sernzoate (BABB). Los embriones flotan inicialmente en la superficie, pero como el metanol se mezcla con el Babb, se hundirán en el BABB. Realice cada paso se trata de BABB en viales de vidrio o platos; BABB derretirá cualquier plástico o pintura.
- Una vez aclarado, ver los embriones con luz transmitida procedente de debajo del embrión. Ajustar la intensidad de la luz, así como el ángulo desde abajo para mejorar el contraste y proporcionar el mejor color.
- Al ver embriones despejadas plantean la placa de Petri de vidrio fuera de la base. Para ello, simplemente usando otros dos tapas de los recipientes de Petri para elevar de modo que la región de la placa con los embriones está elevada.
NOTA: Esto tiene la ventaja de tomar la base fuera de foco y la eliminación de efectos de distracción de imperfecciones o manchas en la base del microscopio que puede interferir con la imagen.
5. Haga doble Hibridación in situ
- Con el fin de ver simultáneamente el patrón de expresión de two diferentes genes en un solo embrión, sintetizar dos sondas, una para cada uno de los diferentes genes. Sintetizar una sonda utilizando DIG-11-UTP como una etiqueta como se describe anteriormente. Diluir el producto de la reacción de transcripción de ARN en tampón de hibridación para producir una sonda más concentrado 3x que se utiliza para una sola hibridaciones in situ.
- Sintetizar la otra sonda de interés utilizando el mismo protocolo que para DIG etiquetados sondeó excepto que fluoresceína-12-UTP debe ser sustituido por DIG-11-UTP. Diluir el producto de la reacción de transcripción de ARN en tampón de hibridación para producir una sonda más concentrado 3x que se utiliza para una sola hibridaciones in situ.
- Mezclar las dos sondas concentradas en una relación 1: 1. Para obtener los mejores resultados, utilice la sonda marcada con fluoresceína para el gen que muestra la expresión más fuerte en el único en el protocolo de hibridación in situ.
- Utilice el mismo en el protocolo de hibridación in situ descrito por solo in situ </ Em> hibridaciones, excepto usar el doble de la sonda (sonda que contiene la mezcla de 1,5x concentrado de sondas marcadas con digoxigenina y marcados con fluoresceína) en el extremo de la primera día en lugar de en una sola sonda de hibridación in situ.
- Siga el protocolo de hibridación solo en el segundo día del doble en el protocolo de hibridación in situ, excepto fragmentos uso antifluoresceína-AP Fab en una dilución 1: 4000 en lugar de fragmentos anti-DIG-AP Fab. Lavar el exceso de anticuerpo a partir del embrión como en el único en el protocolo situ y llevar a cabo la primera reacción de color utilizando el sustrato BM-púrpura AP.
- Después de la primera reacción de color, inactivar el anticuerpo fluoresceína en glicina 0,1 M pH 2,0 durante 40 min seguidos por cinco de diez min lavados en MAB. Bloquear los embriones en el MAB + HTS + BR durante 90 min. Añadir el anticuerpo anti-DIG a una dilución 1: 2000 en el MAB + HTS + BR y se incuba a 4 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, lavar los embriones XXoroughly en el MAB (12 lavados de 30 min) para eliminar el exceso de anticuerpo.
- Lavar los embriones durante 10 min en tampón de AP (Tabla 1) y luego teñir con BCIP (0,5 mg / ml en tampón de AP).
NOTA: El combinado situ deberían dar una coloración azul-púrpura oscuro para la primera reacción de color y una reacción de color azul claro para el segundo (Figura 5). - Detener la reacción de color final mediante la eliminación del tampón de AP y enjuagar tres veces con MAB. Fijar los embriones con Mempfa durante 10 min. Lave los embriones con 5 lavados rápidos en el MAB o OTC.
- Con esta combinación de colores, el uso de metanol en los tratamientos de tinción posterior ya no es posible, ya que elimina el color solo BCIP. Almacenar los embriones después de la tinción y fijación en PBS con 0,02% de azida de sodio. Intensidad de la tinción puede ser débil con doble en situs. Si esto es un problema, reducir los lavados a cuatro, cada uno de 2 hr duración.
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Representative Results
El uso de sondas específicas de tejido puede proporcionar información relevante en cuanto a la situación del desarrollo de órganos específicos. En los siguientes ejemplos, la etapa del embrión se basa en la tabla de etapas Nieuwkoop y Faber 11. Si uno utiliza genes forman sondas expresadas después de la diferenciación, la troponina I cardiaca en etapa de 28 a 30, por ejemplo (Figura 1C), la presencia o el tamaño de un órgano diferenciado se pueden evaluar en cualquier diferenciación posterior etapa. Hace años, los embriólogos fueron capaces de hacer este tipo de análisis basado en notable conocimiento de la histología del embrión temprano 12,13 pero que la experiencia que se ha perdido en gran medida a la generación actual de los embriólogos. Aunque, la pérdida de esta experiencia se puede considerar lamentable, la fiabilidad y la facilidad de uso de las técnicas de hibridación in situ hace que la identificación de tejidos específicos disponibles para cualquier investigador. Los tejidos que son relativamente poco visible, tque la eclosión glándula en la etapa embrionaria 25 por ejemplo (Figura 1A), se puede marcar utilizando vívidamente en situs sin la necesidad de anticuerpos específicos o técnicas histológicas (Figura 1C). Además, el uso de todo el montaje en situs permite ver todo el órgano en el contexto de todo el embrión en lugar de confiar en la inferencia a partir de secciones histológicas (Figura 2). Incluso los tejidos que son profundos dentro del embrión incluyendo el tallo óptico (Figura 4) se pueden ver fácilmente y el uso de la compensación de embriones pueden proporcionar agudo delineación de los límites de órganos.
El blanqueo de embriones para eliminar el pigmento endógeno utilizando soluciones de peróxido ha eliminado en gran medida la necesidad de usar embriones albinos que carecen de pigmento. Blanqueo de diferentes momentos puede ser útil. Por ejemplo, si la mancha es fuerte, un blanqueo más ligero que permite por alguna pigmentación para ser visto puede ser útil porque todoOWS para una mejor puesta en escena y la orientación del embrión (Figura 2A). Sin embargo, si la mancha es un área donde hay altos niveles de pigmentación, tales como el riñón (Figura 2B), cerca de la eliminación completa del pigmento por incubación más largo en la solución de blanqueo da un mejor resultado.
Los embriones tienden a ocupar posiciones particulares cuando están en solución. Después neurulation, tienden a poner completamente en sus lados. Esto está muy bien para las imágenes del flanco (Figura 2B), pero puede ser un problema con otras áreas. El uso de una base de agarosa permite para cortar los canales en la agarosa que se pueden utilizar para orientar los embriones. Por ejemplo, los precursores sanguíneos se localizan en la parte ventral del embrión (Figura 2A) y la magnitud de la tinción es difícil de observar. Posicionamiento del embrión en un canal con el lado ventral hacia arriba, a continuación, permite la visualización completa de ese patrón de expresión génica (Figura 3A). El uso de la doble hibridación in situ puede mostrar la relación entre dos patrones de expresión de genes dentro de un solo organismo (Figura 5) la eliminación de la necesidad de comparar entre diferentes embriones que pueden tener pequeñas diferencias en la morfología. Quizás lo más importante, el uso de hibridación in situ da a uno la capacidad para marcar claramente células antes de borrar diferenciación histológica basado en la expresión de genes que se expresan en los primeros progenitores de un linaje, como pax2 que se expresa en muchos tejidos en el embrión temprano, antes de la diferenciación (Figura 4A). La capacidad de identificar los progenitores y los tejidos que claramente no se distinguen basan en la histología, como precursores de células mieloides (Figura 1B), ha permitido a los investigadores a hacer preguntas más detalladas sobre el estado de desarrollo de un órgano y también para evaluar los resultados de la experimentación manipulation diseñado para causar la diferenciación ectópica de un tejido.
Figura 1:. Ejemplos de todo el montaje hibridación in situ en embriones de Xenopus La tinción con azul de una en el experimento de hibridación in situ puede delinear claramente el desarrollo de estructuras en el embrión de Xenopus (A) Una vista anterior de un embrión etapa 26 destacando la glándula de la eclosión. como demarcado por la expresión de uvs.2 14 (B) Una vista ventral de un embriones que muestran la ubicación de las células mieloides tempranas en la etapa 20 utilizando la expresión de la mieloperoxidasa 15 como un marcador (C) El corazón temprano en la etapa 28.. - 30 se visualiza mediante la expresión de la troponina I cardíaca 16. Una clara ventaja de usar este método es que todosestos patrones de expresión génica se visualizaron utilizando diferentes sondas, pero el protocolo utilizado es idéntico en todos los casos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diferentes niveles de blanqueo puede ser utilizado para visualizar la tinción en el embrión (A) Esta tinción azul a lo largo de la parte inferior de este embrión muestra la expresión de la hemoglobina en los islotes sanguíneos ventrales a aproximadamente etapa 36. Esta es una región de la. embrión que está sólo ligeramente pigmentado y por lo tanto el embrión no se blanqueó durante mucho tiempo como puede verse por el pigmento de color tostado en el ojo y a lo largo del flanco del embrión. Ser capaz de ver la pigmentación permite una mejor visualización de la etapa del embrión. Si la tinción es en una región con mayor pigmentación natural, tales como el sistema nervioso y el flanco del embrión, mayor de blanqueo ayudará a ver el in situ como se ve en B. (B) Aquí la expresión de pax8 17 en el riñón formando , conducto pronephric y cerebro posterior se visualiza mejor después del blanqueo ha eliminado casi todo pigmento endógeno. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cálculo de la base de agarosa puede ayudar con la orientación de los embriones regiones específicas de imagen del embrión puede ser difícil debido a que tienden a tomar posiciones particulares en el plato (A) En renacuajo etapas del embrión se acuesta en su lado.. . Por corteTing una multa de canal en la agarosa (flechas negras) el embrión puede ser visto desde el lado ventral, aquí que muestra la expresión de hemoglobina en la etapa 36, con suficiente estabilidad para capturar una buena imagen. (B) Este punto de vista ventral de la expresión en la etapa hand1 20 esboza la placa mesodermo lateral 6. El embrión se coloca en un pequeño agujero que se estabilizó su posición con la parte ventral hacia arriba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Los órganos internos se pueden ver en ambos, embriones liquidados no despejadas y en opacos En un embrión uncleared manchado por pax2 en la etapa 34 (A), el tallo óptico (flecha amarilla) se puede visualizar con relativa facilidadal igual que la tinción por el tubo neural. Sin embargo, los detalles no son nítidas. En la limpieza del embrión (B) los límites de los sitios de expresión, incluyendo el tallo óptico (flecha amarilla) son más nítidas. La extensión de la compensación se muestra por la capacidad de ver los dos ojos en este embrión despejado. También tenga en cuenta que algunas manchas se ha acumulado en las cavidades internas (flecha púrpura), un problema común cuando se ve embriones despejados.
Figura 5:. Un doble representante de hibridación in situ en un embrión de Xenopus La expresión del marcador placa lateral, hand1, se visualiza mediante la tinción con azul de luz en la etapa 26. Expresión de ETV2 dentro de la vasculatura en desarrollo se visualizó mediante tinción de azul púrpura oscuro. Expresión de hand1 es generalmente muy intenso y por lo tanto se utilizó para tél más débil de la sonda marcada con fluoresceína y la combinación BCIP. El utilizaron la sonda marcada con digoxigenina y combinación BM-púrpura para la expresión ETV2 más débil.
| Nombre | Concentración final | Cantidad / 100 ml |
| Mempfa | 1 mM MgSO 4 | 100 l de 1 M MgSO4 |
| (Conservar a 4 ° C) | 2 mM EGTA, pH 8,0 | 10 ml de mM EGTA 20, pH 8,0 |
| 0,1 M MOPS, pH 7,5 | 10 ml de 1 M MOPS, pH 7,5 | |
| 4% de paraformaldehído, pH 7,5 | 50 ml de 8% de paraformaldehído, pH 7,5 | |
| TTW | Tris 50 mM, pH 7,4 | 5 ml de 1 M Tris, pH 7,4 |
| NaCl 200 mM | 4 ml de NaCl 5 M | |
| 0,1% de Tween 20 | 100 l de Tween 20 | |
| Solución de Denhardt 100X | 2% de BSA | 2 g BSA |
| (Filtrado a través de 0,2 micras filtro, | 2% de PVP-40 | 2 g de PVP-40 |
| almacenar a -20 ° C) | 2% de Ficoll 400 | 2 g de Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M NaCl | 17,5 g NaCl |
| 300 mM citrato trisódico | 8,8 g citrato trisódico | |
| Tampón de Hibridación de ARN | 50% de formamida | 50 ml de 100% de formamida |
| (Conservar a 4 ° C) | 5x SSC | 25 ml de 20x SSC |
| 1 mg / ml de ARN de levadura | 4 ml de 1 mg / ml de ARN de levadura disueltos en 50% de formamida | |
| 1X solución de Denhardt | 1 ml de 100x solución de Denhardt | |
| 0,1% de Tween 20 | 100 l de Tween 20 | |
| EDTA 5 mM, pH 8,0 | 1 ml de 0,5 M EDTA, pH 8,0 | |
| MAB | MM Ácido maleico 100 | 1,16 g de ácido maleico |
| (PH 7,5, se almacena a 4 ° C) | NaCl 150 mM | 0,88 g de NaCl |
| MAB + HTS + BR | MM Ácido maleico 100 | 96 ml de MAB |
| 4% con tratamiento térmico Ovejas Serum | 4 ml de Tratamiento Térmico Sheep Serum (tratadas con calor a 55 ° C durante 30 min y aliquoted) | |
| 2% reactivo de bloqueo | 2 g de Roche Reactivo de Parada | |
| MAB + HTS + BR + anticuerpo anti-Dig | MM Ácido maleico 100 | 96 ml de MAB |
| 4% Heat TrSuero Ovejas eated | 4 ml de Tratamiento Térmico Ovejas Serum | |
| 2% reactivo de bloqueo | 2 g de Roche Reactivo de Parada | |
| 1: 10.000 anti-DIG-AP, Fab fragmentos de anticuerpos | 1,5 l de anti-digoxigenina-AP, Fab fragmentos de anticuerpos | |
| Fosfatasa alcalina (AP) Buffer | Tris 100 mM, pH 9,5 | 10 ml de 1 M Tris, pH 9,5 |
| 50 mM de MgCl 2 | 5 ml de 1 M de MgCl2 | |
| MM NaCl 100 | 2,5 ml de 4 M NaCl | |
| 0,1% de Tween 20 | 100 l de Tween 20 | |
| Solución de blanqueo | 0,3% de H 2 O 2 | 3,34 ml de 30% de H 2 O 2 |
| 5% de formamida | 5 ml de 100% formamida | |
| 0,5% SSC | 2,5 ml de 20x SSC | |
| Solución de Compensación | 1/3 Alcohol bencílico | 33 ml |
| 2.3 benzoato de bencilo | 67 ml |
Tabla 1: Recetas Solution
| Nombre | Cantidad |
| Dig-NTP Mix | 5 l de CTP 20 mM |
| (40 l de reacción) | 5 l de 20 mM GTP |
| 5 l de 20 mM ATP | |
| 3,25 l de 20 mM UTP | |
| 3,5 l de 10 mM Dig-11-UTP | |
| 18,25 l destilada, agua tratada en autoclave | |
| Síntesis de Sonda | x l de ADN molde(Dependiendo de la concentración) |
| (20 l de reacción) | x l de agua destilada en autoclave |
| 4 l de mezcla Dig-NTP | |
| 0,5 l de inhibidor de RNasa | |
| 2 l de tampón polimerasa 10X ARN | |
| 2 l de RNA polimerasa |
Tabla 2: Sonda Recetas Síntesis
| Nombre del reactivo | Volumen aproximado | Duración | Temperatura |
| 100% Metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 75% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 50% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| TTW | 2 ml | 10 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| TTW | 2 ml | 10 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| TTW | 2 ml | 10 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| Pre-caliente ARN tampón de hibridación y la sonda a 65 ° C | |||
| TTW | 4 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| TTW | 4 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| Tampón de Hibridación de ARN | 2 ml | 10 min, meciéndose | Sala de Temperaturae |
| Pre-calentado ARN tampón de hibridación | 2 ml | 1 hr, meciéndose | 65 ° C |
| Solución Sonda | 1 ml | Durante la noche, mecedora | 65 ° C |
Tabla 3: Pasos para el primer día de Hibridación In Situ Protocolo (en total alrededor de 3 horas)
| Nombre del reactivo | Volumen aproximado | Duración | Temperatura | ||||
| Pre-caliente ARN Tampón de Hibridación y 02.x SSC a 65 ° C y 2x SSC a 37 ° C | |||||||
| Volver solución de la sonda al tubo, para varios usos | |||||||
| Tampón de Hibridación de ARN | 2 ml | 10 min, meciéndose | 65 ° C | 2X SSC | 2 ml | 20 min, meciéndose | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 ml | 20 min, meciéndose | 37 ° C | ||||
| 0,2x SSC | 4 ml | 1 hr, meciéndose | 65 ° C | ||||
| 0,2x SSC | 4 ml | 1 hr, meciéndose | 65 ° C | ||||
| MAB + HTS + BR | 1,5 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente | ||||
| MAB + HTS + BR + anticuerpo anti-DIG | 1,5 ml | Durante la noche, mecedora | 4 ° C |
Cuadro 4: Pasos para la Segunda Jornada de Hibridación In Situ Protocolo (en total alrededor de 4 horas)
| Nombre del reactivo | Volumen aproximado | Duración | Temperatura |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| BM púrpura AP Sustrato | 500-750 l | Durante la noche, mecedora (ver texto) | Temperatura ambiente / 37 ° C (ver texto) |
Tabla 5: Pasos para la Tercera Jornada de Hibridación In Situ Protocolo (alrededor de 7 horas)
| Nombre del reactivo | Volumen aproximado | Duración | Temperatura |
| 25% de metanol | 2 ml 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente | |
| 50% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 75% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 100% de metanol (frío) | 2 ml | 20 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 100% de metanol (frío) | 2 ml | Varía, sin balanceo | Temperatura Ambiente |
| 75% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 50% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| Mempfa | 2 ml | 30 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| Solución de blanqueo | 4 ml | 40 min-3 hr, meciéndose | Temperatura ambiente / 37 ° C (ver texto) |
| El almacenamiento de los embriones | |||
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 50% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 75% de metanol | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 100% Metanol | 4 ml | Almacenar a -20 ° C | |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, meciéndose | Temperatura Ambiente |
Tabla 6: Pasos para Dejar de hibridación in situ, de blanqueo y conservación de embriones
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Discussion
La capacidad de utilizar la hibridación in situ para visualizar el patrón de expresión de genes específicos sigue siendo el método más comúnmente utilizado para identificar órganos específicos o tipos de células en el embrión de Xenopus. Esto es debido a varias ventajas ofrecidas por esta técnica. La expresión de un gen puede identificar estructuras específicas así antes de cualquier signo histológico de diferenciación como es el caso para la expresión nkx2.5 en los progenitores del corazón antes de cualquier demarcación clara de esas células 18. Una vez que todos los reactivos están en parte, también es muy rentable. Generación de muchas sondas individuales, que pueden ser reutilizados de manera efectiva, es posible con un poco más de tiempo y costo de inversión que no sea la obtención de los plásmidos que codifican los genes de interés. En nuestra experiencia, las sondas pueden ser reutilizados durante años con poca pérdida de actividad a pesar de las pequeñas diluciones inevitables que vienen con cada uso. Por último, hay poco requi optimizaciónrojo cuando la utilización de diferentes sondas.
La calidad de la síntesis de la sonda es un factor clave en el éxito del protocolo. Hay muchas maneras de comprobar la calidad de la sonda de ARN, pero simplemente ejecutando la sonda de ARN en un gel de TAE es un método rápido y fácil que es bastante fiable. Utilizamos rutinariamente bromuro de etidio para teñir el ARN y eso requiere un manejo especial y eliminación de los geles por la mayoría de las instituciones. Las alternativas no tóxicas están disponibles comercialmente aunque no hemos comparado específicamente las de sondas visualizar. La sonda debe funcionar como una única banda a pesar de que aparecerá un poco borrosa en comparación con ADN en un gel de TAE. Una estimación de la cantidad de ARN se puede obtener: una buena reacción tendrá alrededor de 1 g / l de ARN. Una banda puede visualizar fácilmente representará al menos 0,5 g de ARN y una banda brillante representará más de 1 mg. Aunque es evidente que no es completamente exacto y que requiere un poco de experiencia, la cuantificación basada en el gel es el rapIdentificación y la robustez del procedimiento en situ permite que funcione bien. Si existe la preocupación acerca de repetibilidad, se puede utilizar fácilmente absorbancia UV para cuantificar una pequeña cantidad de la reacción de transcripción, aunque no hemos encontrado que esto es una preocupación importante. Finalmente, el gel permite ver si el ADN plantilla ha sido eliminado. Si el gel indica que no hay ARN, las dos explicaciones más probables son una plantilla de ADN mal o que el tampón de transcripción no está funcionando bien. El calentamiento de la transcripción de amortiguación a 37 ° C y la mezcla completa antes de su uso, o la adición de 1 l de DTT 100 mM fresco a la reacción de transcripción de vez en cuando puede ayudar con este último. Un componente importante de tampón de reacción de transcripción es espermidina y puede precipitar la plantilla de ADN a bajas temperaturas hacer del calentamiento de la memoria intermedia importante. TDT en la memoria intermedia también puede precipitar de manera significativa la inhibición de la reacción. Si un precipitado se ve en la memoria intermedia, calentar la solución yagitar vigorosamente. No hay necesidad de tomar precauciones inusuales, tales como el tratamiento del agua con DEPC o autoclave puntas y tubos, para evitar que la actividad RNAsa. La presencia del inhibidor de la ribonucleasa comercial ofrece una protección considerable contra RNAsas desde el medio ambiente. Tenga en cuenta que otras etiquetas UTP se pueden utilizar, por ejemplo, fluoresceína, aunque en nuestra experiencia, la UTP marcado con digoxigenina y la combinación de anticuerpo anti-digoxigenina proporciona los resultados más consistentes.
Los primeros protocolos para la generación de la sonda sugieren que la hidrólisis alcalina de las sondas sintetizadas debe hacerse 4 con el fin de permitir una mayor penetración de la sonda. La hidrólisis de la sonda no parece ayudar con el proceso de hibridación in situ; Sondas de ARN de más de 500 pb por lo general dan una señal y sondas que son más de 2 kb de longitud también funcionan bien excelente. Sondas más cortas pueden funcionar si el ARN objetivo es abundante, pero las sondas más largas darán btinción Etter. No parece haber ninguna ventaja clara en el uso de la digestión alcalina para romper las sondas más largas.
El cuidado en el manejo inicial de los embriones es muy importante. La eliminación del sobre fertilización es particularmente útil para los embriones después del cierre pliegue neural y antes de la eclosión naturales del sobre fertilización. Durante la elongación del embrión dentro del sobre la fertilización, el embrión se convierte encrespado y si fija en esa posición, los embriones son más difíciles de imagen después de la hibridación in situ. Sin embargo, si los embriones son retirados de la envolvente de la fertilización antes de la fijación, se enderezan a cabo rápidamente. Si los embriones son dañados durante la extracción de la membrana, que puedan curar la herida antes de la fijación porque el tejido dañado puede resultar errónea en señal de hibridación in situ en el lugar de la herida. Si es pequeño, las heridas se curan muy rápidamente, a menudo dentro de 19 minutos. Pasos posteriores también pueden dañar los embriones dues necesaria la transferencia y así que el cuidado líquido anillo al cambiar soluciones. Daños en los primeros pasos por lo general significa que el embrión será muy dañada por el final del procedimiento y de las regiones dañadas provocará falsa en señales in situ a la vista de los daños. Además, hasta 30 embriones pueden ser probaron en un solo vial, pero con más embriones hay mayores posibilidades de alto fondo en desarrollo durante la reacción colorimétrica, sin embargo el aumento de los lavados en el día 3 o el lavado durante la noche puede compensar esto.
En este protocolo, el número de pasos se ha reducido y el uso de varios reactivos comúnmente utilizados se ha eliminado. Tenga en cuenta que este protocolo elimina varios pasos que se utilizan en muchos otros protocolos, incluyendo una digestión con proteinasa K y el uso de anhídrido acético para bloquear los grupos cargados positivamente. Esas medidas todavía pueden ser útiles cuando se mira en los embriones de mamíferos y aves, pero en el uso de Xenopus, la eliminación de esas medidas tiene poco impacto on los resultados finales de la hibridación in situ. Nuestro laboratorio no ha determinado si estos mismos simplificaciones pueden aplicarse a en los protocolos de hibridación in situ para otras especies. Proteinasa K digestión en particular, puede ser necesaria en otros embriones como pollito o el ratón, donde la penetración de la sonda puede tener mayores limitaciones.
El uso de BM púrpura sustrato es conveniente y confiable. Sin embargo, hay un número de otras opciones disponibles para los precipitantes, sustratos alcalinos de color que son necesarios para localizar el ARN diana en el embrión. En particular, una combinación de NBT / BCIP es comúnmente utilizado 4 y funciona bien. Algunos reactivos de color son solubles en metanol, en cuyo caso, el uso de metanol después de la tinción eliminará la mancha y debe ser evitado. Otras combinaciones también pueden utilizarse al realizar doble en situs. El uso de una combinación similar (NBT / BCIP en lugar de BM púrpura) También se ha demostradoser muy robusto cuando se utiliza embriones de ratón 20. El color azul de la tinción y el pigmento endógeno del embrión son a menudo difíciles de distinguir claramente en las fotografías. El uso de embriones albinos también eliminará pigmento pero la solución de blanqueo es casi tan eficaz y es mucho más conveniente, ya que no requiere el mantenimiento de los adultos albinos para la cría. Si la tinción es relativamente débil, fuerte blanqueo puede hacer hincapié en que las manchas. Si la tinción es fuerte, dejando un poco de pigmento luz puede ser un contraste eficaz y también ayuda con la orientación y puesta en escena del embrión.
Después de la hibridación durante la noche en sonda de ARN, el protocolo puede divergir del protocolo estrictamente manual expuestas aquí para el uso de un robot en hibridación in situ. El uso del robot en la hibridación in situ ahorra casi un día completo como el segundo día y el día tres del protocolo Manual se puede reducir a un día, mientras el robot funciona a través de la noche und puede hacer todos los cambios de temperatura apropiadas. El robot también es muy consistente en sus resultados y permite para el sondeo simultáneo de muchas muestras de manera eficiente. Sigue siendo ventajosa para hacer el primer día por la mano como que permite la reutilización de las sondas y el uso de volúmenes más pequeños de reactivos. La única desventaja significativa de la utilización de un robot es el costo inicial del instrumento.
Este protocolo se analizan algunas de las formas de manera efectiva una imagen en la hibridación in situ. Es importante hacerlo como parte de la información se puede perder si la imagen es pobre. En muchos casos, las imágenes de los in situ resultados de un experimento requiere el mismo tiempo que el experimento inicial. Algunos elementos de las variables de procedimiento, tales como el grado de blanqueo tienen un elemento de preferencia personal. Otros efectos de imágenes puede lograrse colocando el plato sobre una base coloreada. A menudo un tono ligero azul para el agar puede destacar la profunda coloración azul de la en situ hibridación. Simplemente ponga la placa de Petri que contiene el agar sobre una hoja de plástico azul para obtener el efecto deseado.
Sin embargo, los métodos descritos aquí proporcionan una base con la que explorar posibilidades de imagen. Los embriones se pueden ver ya sea borran (hecho transparente para estructuras internas mejor vista) o sin declarar (visto como aparecen en condiciones de luz normales). Algunos de la decisión en cuanto a cómo la imagen del embrión depende en el sitio de expresión. Si la expresión es en o cerca de la superficie del embrión, lo mejor es la imagen que el embrión es sin compensación. Hay varias ventajas de utilizar los embriones no despejadas. El proceso de limpieza de los embriones requiere muchos pasos y los productos químicos utilizados para limpiar los embriones son difíciles de manejar. Además, varias cavidades en el embrión permitir la precipitación de los sustratos de fosfatasa alcalina que pueden resultar en la tinción de la cavidad falsa. En particular, el blastocele de embriones tempranos y la pharyncavidad geal menudo muestran tinción (Figura 4). Esta falsa tinción no es visible en los embriones que no se borran. En su mayor parte, incluso moderadamente profunda expresión puede ser visualizado en los embriones no despejadas, incluyendo tejidos mesodérmicos tales como corazón, riñón, y somitas, y Construcciones endodérmico tales como la tiroides y el hígado. Mover los embriones a través de una serie de metanol a cualquiera de hidratos en PBS para su visualización o poner en metanol al 100% para el almacenamiento permite múltiples rondas de almacenamiento y de imagen. El almacenamiento de metanol permite probar diferentes modificaciones de la imagen a través del tiempo extendido.
Hay algunas desventajas en el uso de la técnica de hibridación in situ para mirar la expresión génica. Los niveles de expresión no son estrictamente cuantificable aunque la comparación dentro de un embrión y cambios gruesos en la expresión y los cambios en el tamaño del dominio de expresión son generalmente obvios. Al igual que con otras técnicas basadas en el ARN, no proporciona ninguna información como to las proteínas codificadas por el gen de interés, que pueden limitar la interpretación de los resultados. Finalmente, a menudo es difícil determinar lo que podría ser la tinción de fondo en comparación con el dominio de expresión verdadera. Esto es particularmente un problema con los genes con un patrón de expresión desconocida que puede ser generalizada. A menudo, una sonda generada a partir de la cadena con sentido del mismo gen se utiliza como un control para la tinción no específica. El uso de un control de cadena con sentido puede proporcionar alguna información acerca de un problema con los reactivos pero no proporciona evidencia definitiva de que la tinción basado en la sonda antisentido es totalmente exacta. Los resultados de un in situ suelen ser notablemente consistente a través de los embriones cuando se utilizan múltiples embriones y esto puede ser usado como una medida de confianza en un patrón de tinción. Además, diferentes sondas antisentido, generados a partir de diferentes partes del gen, en particular las regiones no traducidas, se pueden usar para ver si dan el mismo patrón de tinción. Si lo hacen,sino que también proporciona la confianza en el patrón de tinción observado si es idéntico. Sondas diluidas también se pueden utilizar con la exposición prolongada a la solución de tinción para ver si el mismo patrón de tinción emerge. Un factor que generalmente inspira confianza en un patrón de tinción es si ese patrón corresponde a una estructura embrionaria específica. Suficiente en situs ahora se han hecho con una gran variedad de genes que nuevos patrones de expresión es probable que eventos relativamente raros. Las grandes bases de datos de imágenes en situ se han establecido para los diferentes organismos que pueden utilizarse para comparar los resultados de imagen. Para los embriones de Xenopus, Xenbase (www.xenbase.org) es un excelente ejemplo de un recurso que se puede utilizar para comprender los patrones de expresión. Otros organismos modelo también tienen amplias bases de datos similares, de imágenes.
A pesar de estos posibles advertencias, la hibridación in situ sigue siendo una herramienta poderosa y confiable que es extremadamente útil parael estudio de la organogénesis. Es probable que siga siendo el método de elección para la identificación de los tipos de células y examinar el cambio en los dominios de expresión génica en el futuro previsible.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
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