Protocol
1. Embryo Vorbereitung
- Wenn nicht routinemäßig als Teil des Embryokultur, de-Gelee Embryonen mit 2,5% Cystein, pH 8,0 vor der Fixierung 8 durchgeführt. Obwohl es nicht unbedingt notwendig ist, ist es sinnvoll, dann manuell die Befruchtung Umschlag vor der Fixierung zu entfernen unter Verwendung einer feinen Pinzette.
- Verwenden Sie Glas Pasteurpipetten, um die Embryonen zu übertragen. Die Pipette ist nicht breit genug, um zu übertragen Embryonen so verwenden Sie ein Diamant-Stift, um die Glaspipette in einem Punkt weit genug, um holen einen Embryo zu schneiden. Beseitigen Sie die scharfen Kanten der Pipetten nach dem Schneiden durch die schnelle Weitergabe der Schnittspitze durch die Flamme eines Bunsenbrenners, um die scharfen Kanten schmelzen.
HINWEIS: Es muss dafür genommen werden, da das Glas noch heiß genug ist, um Verbrennungen zu verursachen, auch wenn sie durch eine Sichtprüfung abgekühlt haben wird.
- Verwenden Sie Glas Pasteurpipetten, um die Embryonen zu übertragen. Die Pipette ist nicht breit genug, um zu übertragen Embryonen so verwenden Sie ein Diamant-Stift, um die Glaspipette in einem Punkt weit genug, um holen einen Embryo zu schneiden. Beseitigen Sie die scharfen Kanten der Pipetten nach dem Schneiden durch die schnelle Weitergabe der Schnittspitze durch die Flamme eines Bunsenbrenners, um die scharfen Kanten schmelzen.
- Führen Sie den Embryo Fixierung in Etappen. Zuerst bereiten Glasflaschen für den Einsatz in Embryo-Fixierung. Verwenden Sie diese Fläschchen für alle Schritte einschließlich der endgültigenLagerung. Verwenden Fläschchen, die klar mit einer guten Teflon-Dichtung im Deckel gibt, so dass für die Überwachung der Embryonen in allen Phasen des Prozesses. Beschriften Sie die Röhrchen mit entsprechenden experimentellen Daten mit Permanentmarker und dann bedecken Sie das Etikett mit durchsichtigem Klebeband, als auch Permanentmarker werden im Laufe des Verfahrens durch die Verwendung von Alkoholen und anderen Lösungsmitteln verloren.
- Verwenden Mempfa, um die Embryonen zu beheben. Einen Vorrat von 8% Paraformaldehyd in Chargen von 50-100 ml auf einmal. Verwenden etwa 75% des erforderlichen H 2 O und Erhitzen auf 50-60 ° C, die notwendig ist, um das Paraformaldehyd in Lösung zu bekommen.
ANMERKUNG: Diese Lösung ist etwas anders als die Memfa bei älteren veröffentlichten Protokoll-Versionen verwendet, daß es verwendet Paraformaldehyd anstelle Formaldehyd. - 2-3 Tropfen 10 N NaOH oder bis der pH-Wert ca. 7,5 (Verwendung von pH-Papier einen pH-Wert zu überprüfen). Para ist sehr giftig, daher erzeugen die Stammlösung in einem Abzug. Sobald der paraFormaldehyd liegt in der Lösung, filtriert die Lösung durch Whatman-Papier in einem frischen Gefäß gegeben und mit H 2 O auf ein Endvolumen. Falls erforderlich, speichern Sie die Paraformaldehydlösung bei 4 ° C für 1-2 Wochen.
- Montieren der übrigen Bestandteile des Mempfa Fixierungslösung (Tabelle 1). Dass in der endgültigen Arbeitskonzentration von Paraformaldehyd 4%. Bewahren Sie alle Komponenten der Fixierungslösung bei 4 ° C als Aktien.
- Mit einem Schnitt Glaspipette, fixieren die Embryonen aus der Addition der Embryonen an die markierten Glasfläschchen, die mit den etwa 3-4 ml Mempfa Lösung (Tabelle 1) gefüllt wurden. Vermeiden Befestigungs mehr als 20 bis 30 Embryonen pro Fläschchen. Hinzufügen der Embryos mit einem Minimum an Flüssigkeitstransfer vom Embryo Medium. Fix Embryonen Mempfa Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Bei verspäteter Endoderm Strukturen führen die in Situs manuell isoliert gut und Endoderm-Derivate 9,10, Die für ein gutes Eindringen der Sonde ermöglicht und vermeidet auch Höhle Färbung.
- Speichern eine Lösung von 100% Methanol bei -20 ° C. Nach der Para Fixierung, ersetzen Sie die Mempfa Lösung mit etwa 4 ml der -20 ° C, 100% Methanol für die Lagerung der Embryonen.
- Verwirbeln die Fläschchen nach Zusatz des Methanols, um die Embryonen Kleben an der Glas oder anderen Embryos zu verhindern. Stellen Sie außerdem sicher die Fläschchen dicht geschlossen, weil das Methanol kann in den Gefrierschrank im Laufe der Zeit, wenn lose verdampfen.
HINWEIS: Embryonen für mindestens ein Jahr gelagert werden, und wahrscheinlich länger, in dem Methanol vor ohne Verlust der in-situ-Hybridisierung Qualität der Färbung.
- Verwenden Mempfa, um die Embryonen zu beheben. Einen Vorrat von 8% Paraformaldehyd in Chargen von 50-100 ml auf einmal. Verwenden etwa 75% des erforderlichen H 2 O und Erhitzen auf 50-60 ° C, die notwendig ist, um das Paraformaldehyd in Lösung zu bekommen.
2. Sondenvorbereitung
- Verwenden 1-2 ug der Ziel-DNA, die mit Digoxigenin markierten Sonden zu machen. Cut Plasmid, das das geeignete DNA-Sequenz am 5'-Ende des Gens von Interesse mit einem Restriktionsenzym für That-Vektor, um Antisense-Sonden erzeugen.
ANMERKUNG: Das Plasmid sollte einen geeigneten RNA-Polymerase-Bindungsstelle (zB T7, T3 oder SP6) haben. - Lassen Sie die DNA, Wasser, NTP mischen und Polymerase-Puffer auf Raumtemperatur erwärmen, sie vor der Montage der Sonde Synthesereaktion. Die Komponenten des RNA-Synthesereaktion in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in der Reihenfolge, wie in Tabelle 2 aufgeführt. Einstellen der Lautstärke der Wasser zugegeben, um das Gesamtvolumen des Sondensynthesereaktion auf 20 ul zu bringen. Bauen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur, weil Komponenten des Polymerase-Puffer können die Matrizen-DNA, wenn sie in hohen Konzentrationen und Kalt auszufällen.
- Die Transkription über 2 h bei 37 ° C.
HINWEIS: Die Inkubation von etwas mehr als zwei Stunden, führt zu keinen negativen Auswirkungen, sondern auch zeigen, etwas erhöhte Ausbeute. Wenn für eine Stunde inkubiert, wird die Ausbeute reduziert, aber immer noch ausreichend, um eine gute Probe zu machen.- Während des Wartens auf die Transkriptionsreaktion zu beenden, geben Sie ein Agarose-Gel, die verwendet werden, um die Qualität der Sonde zu testen wird. Schmelze 1 ug Agarose in 100 ml 1x TAE-Puffer (siehe Tabelle 1) durch Erhitzen der Lösung bis zum Siedepunkt. Entfernen Sie die Lösung von der Hitze, wenn die Agarosepulver vollständig gelöst hat.
- Add 2 ul Ethidiumbromid-Stammlösung (10 mg / ml) bis ungefähr 100 ml Agarose-Gel, wenn die Agarose wurde auf ca. 60 ° C abgekühlt, um die Visualisierung von RNA unter ultraviolettem (UV) Licht zu ermöglichen.
Hinweis: Dieses Agarosegel Lösung kann in einem Inkubator von 60ºC gehalten, so dass zukünftige Gele können ohne erneute Schmelzen gegossen werden kann. Achten Sie beim Umgang mit Ethidiumbromid durch potentielle Toxizität.
- 1 ul DNAseI (RNAse frei grade) zur Transkriptionsreaktion nach der 2-stündigen Inkubation und Inkubieren für weitere 10 min bei 37 ° C, um Matrizen-DNA zu eliminieren.
- Entfernen 1 ul der Reaktionsmischung aufCheck auf 1% Agarose-TAE-Gel und dem Rest (20 ul) in 80 ul 1% SDS in TE-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), 10 ul 5 M NH 4 Acetate, und 220 & mgr; kaltem Ethanol. Vortex die Mischung kräftig und zur Seite auf Eis gesetzt, bis die Ergebnisse der RNA Qualitätskontrolle bekannt.
- Führen Sie die 1 ul RNA vor der Fällung auf dem 1% Agarose-TAE-Gel entfernt. Um das Laden auf das Gel zu erleichtern, fügen Sie 4-5 ul Wasser und 1 ul der Standardladefarbstoff an die RNA. Sehen Sie sich die RNA auf dem Gel mit Hilfe eines UV-Licht-Transilluminator, um die Qualität der Sonde zu überprüfen (siehe Diskussion).
- Man fällt die verbleibende RNA, die beiseite auf Eis in Schritt 2.5 durch Schleudern in einer Mikrozentrifuge bei voller Geschwindigkeit für 10 bis 15 min eingestellt wurde. Beziehen Sie den Überstand mit einer Glaspipette herausgezogen und lassen kurz trocknen.
- Resuspendieren Fühler mit 1 ml RNA-Hybridisierungspuffer (Tabelle 1) in der Eppendorf-Röhrchen. Vortex und briefly erhitzen das Rohr auf 37 ° C und Wirbel wieder. Übertragen Sie die Sondenlösung auf eine 15 ml Schraubkappe Polystyrolröhrchen und füllen auf 7-10 ml mit RNA-Hybridisierungspuffer. Hinweis: Die Sonde kann weiter verdünnt werden (eine 10-fach weitere Verdünnung noch funktionieren kann) häufig zu geringe Hintergrundfärbung, aber die Reaktionen auch länger dauern.
3. In situ-Hybridisierung
- Nimm die Embryonen, die -20 ° C Methanol gelagert wurden genommen und auf Raumtemperatur erwärmen. Führen Sie den gesamten Vorgang in den Glasfläschchen. Wenn verschiedene Embryonen aus einer Gruppe werden in Zukunft an die von verschiedenen Sonden betrachtet werden, halten sie in einem einzigen Fläschchen bis kurz vor die Sonden werden hinzugefügt, um die Variabilität und Arbeit am ersten Tag zu reduzieren.
- Rehydrieren der Embryonen durch eine Methanolreihe, wie in Tabelle 3 (siehe Tabelle 1 für Wasch Rezepturen) in Vorbereitung für das Hinzufügen der Sonde dargestellt. Leichte Kreisbewegungen ausführen embryos nach jeder Änderung, um sicherzustellen, sie werden nicht an den Wänden zu oder voneinander, und Rock die Embryonen durch die Montage der Ampullen auf einem Kolbenpendel. Bei der Übertragung der Flüssigkeiten, überprüfen Sie das Innere der Kappen zu gewährleisten, dass Embryonen nicht dort gefangen.
- Einmal in der Sondenlösung, hybridisieren die Embryos über Nacht, wie in Tabelle 3 beschrieben.
- Nehmen Sie die Sondenlösung. Speichern Sie die verwendete Sonde durch Lagerung in einem 15 ml Schraubkappe Polystyrolröhrchen, mit Datum und wie oft die Sonde verwendet wurde markiert, bei -20 ° C.
HINWEIS: Die gleiche Sonde kann viele Male für die nachfolgende in situ Hybridisierungen wiederverwendet werden, bis die kolorimetrischen Reaktionen beginnen, eine ungewöhnlich lange Zeit in Anspruch nehmen, um die gewünschte Intensität zu erreichen.- Sobald die Sonde entfernt wird, bereiten die Embryonen für die Antikörperfärbung gegen die Sonde durch die Reihe von Waschvorgängen in der Tabelle 4 dargestellt. Ändern Sie die Temperatur nach Bedarf (Tabelle 4), indem Sie ter Kolbenpendel, mit Fläschchen von Embryonen angebracht, direkt in Hybridisierungs Öfen, die auf die entsprechende Temperatur eingestellt sind.
- Bilden das entsprechende Volumen des MAB + HTSS + BR + anti-Dig-Antikörper (Tabelle 4) zu der Zeit, daß die Embryonen in der MAB inkubiert + HTSS + BR Blockierungslösung, so dass der Antikörper vor der Zugabe zu dem blockierten Embryonen. Stellen Sie die Sperr Lösungen frisch am Tag der Nutzung.
- Entfernen der Antikörperlösung und beginnen wäscht wie in Tabelle 5 nach Inkubation über Nacht mit Antikörper beschrieben. Führen mindestens zwölf 30minütigen Spülungen, um für die Färbung mit der alkalischen Phosphatase-Substrats herzustellen und reduzieren den Hintergrund, so viel wie möglich. Entweder MAB Puffer oder TBT-Lösung (Tabelle 1) für die Waschschritte.
HINWEIS: TBT Lösung TTW die 2 mg hat / ml BSA zugegeben.- Ersetzen Sie die letzte Waschlösung mit dem BM Lila alkalische Phosphatase-Substrat. Führen Sie die Färbung reaction entweder bei Raumtemperatur oder 37 ° C.
HINWEIS: Die Färbung wird bei 37 ° C schneller, aber wenn über Nacht stehen gelassen, unannehmbare Hintergrundfärbung oft eine Folge sein. Die Färbung Reaktionen erfordert häufig über Nacht-Färbung und Raumtemperatur ist am sichersten für diese. - Wenn weitere Färbung erforderlich ist und die BM purple Lösung nimmt eine blaue Farbe, ersetzen Sie die Farblösung mit frischen BM Lila und setzen Sie die Rohre in 37 ° C. Wenn die Ziel-mRNA ist sehr reichlich, legen Sie die Embryonen in der Färbelösung bei 4 ° C über Nacht und verschieben Sie die Embryonen auf Raumtemperatur oder 37 ° C, um eine bessere Überwachung der Farbreaktion zu ermöglichen.
- Günstige Mietwagen finden Reaktionen sorgfältig, da die Zeit, um endgültige Ergebnis variiert beträchtlich zwischen den verschiedenen Ziel-RNAs. Aus Gründen der Einheitlichkeit, stoppen Sie die Farbreaktion (siehe 3.4), wenn es keine neuen Seiten des Ausdrucks, die sich mit längeren Inkubationszeiten. Wichtig ist, dass, wenn in situ-Hybridisierung wird nach einer Untersuchung verwendetfür Experimente eine Betrachtung der verschiedenen Behandlungsgruppen, die gleiche Zeit für die Farbreaktionen zwischen Behandlung und Kontrolle Embryonen.
- Ersetzen Sie die letzte Waschlösung mit dem BM Lila alkalische Phosphatase-Substrat. Führen Sie die Färbung reaction entweder bei Raumtemperatur oder 37 ° C.
- Stoppen Sie die Farbreaktion und Vorbereitung der Embryonen für die Lagerung und die Bildaufzeichnung, indem Sie die Flüssigkeiten, wie in Tabelle 6 dargestellt. Die Embryonen rocken Sie zu diesem Zeitpunkt nicht, weil die Entfernung von Flecken kann als lila Färbung des Methanols um die Embryos visualisiert werden.
HINWEIS: Oft Embryonen haben eine leichte Blaufärbung von der Färbelösung und kaltem Methanol zumindest teilweise zu entfernen, dass, obwohl dies nicht ausreichend ist, um schwere Hintergrund oder Hohlraum Färbung zu entfernen. Kaltem Methanol bezieht sich auf Methanol, das in einem -20ºC Gefrierschrank gehalten wird.- Rehydrieren die Embryonen und befestigen Sie den Fleck mit Mempfa (Tabelle 6). Einmal befestigt, entfernen Sie die Mempfa und waschen Sie die Embryonen mit 25% Methanol.
- Nehmen Sie die 25% Methanol und fügen Sie die Bleichlösung, wenn die Entfernung von endogenen Pigmenterforderlich. Achten Sie beim Umgang mit der Bleichlösung, wie es kann zu Verbrennungen führen. Beachten Sie die Bleich eng wie es geschieht relativ schnell, und die Bleichgrad für verschiedene Effekte (2) variiert werden.
- Dehydratisieren Embryonen durch eine Methanolreihe bis 100% Methanol für die Langzeitlagerung nach der Aufhellung oder übertragen zu PBS für die kurzzeitige Lagerung und nachfolgende Abbildungs (siehe Tabelle 6).
4. Imaging Embryonen
- Sobald ein Embryo hat die Färbung abgeschlossen, Bild der Embryo, so dass die Informationen darüber, wo das Gen von Interesse exprimiert wird für ein breiteres Publikum erobert. Verwenden Sie 1% Agarose als Hintergrund zu ungeklärten Embryonen zu sehen.
HINWEIS: Die Agarose gibt einen blau / grauen Hintergrund, die gut mit dem Embryo und dem Blau des Farbreaktion kontrastiert. Es hilft auch, diffundieren störende Schatten und Reflexionen, die Aufmerksamkeit von der Embryo abzulenken.- Fügen Agarose zu Wasser und dann zum Kochen bringen, bis die Agarose in Lösung und vor dem Einfüllen in die Petrischale abkühlen lassen 50. Wie bei der TAE-Gel-Lösung, speichern Sie die Agarose-Lösung in 55 ° C Inkubator für verschiedene Zwecke verwendet werden. Gießen der Agarose zu einer Tiefe von etwa 2 mm in die Petrischale. Falls erforderlich, stellen Sie die Tiefe von Agarose, ein wenig anders Schatten der Hintergrund ergeben.
- Nach der Rehydratisierung durch die Lagerung in Methanol zu einer wässrigen Lösung (PBS oder TTW), unter Verwendung eines Methanol-Reihe, legen die Embryos in einer Petrischale mit dem Agarose-Basis (siehe Tabelle 6). Bewahren Sie die Lösung sauber und, falls erforderlich, verwenden Sie einfache Filterung, um kleine Partikel, die den sauberen Hintergrund der guten Bilder stören können, zu beseitigen.
- Um die Bild die Embryonen aus alternative Ansichten, beispielsweise von der Bauchseite, schneiden dünne Kanäle in der Agarose, um den Embryo zu passen mit feinen Pinzette und legen Sie die Embryonen in die Kanäle, für Orientierung (Abbildung 3 HINWEIS: Die meisten Stadien haben eine charakteristische Position, dass sie, wenn sie in Lösung gebracht zu übernehmen. Zum Beispiel neigen Blastula-Embryonen zu Tier Seite nach oben zu sitzen. Sobald die Embryonen beginnen zu verlängern, lagen sie auf ihrer Seite.
- Verwenden des Faseroptik-Lichtquelle, um das Embryo aus einem flachen Winkel zu beleuchten, wodurch Schatten auf dem Embryo, der Tiefe, um das Bild und helfen erkennen Oberflächenstrukturen. Da Bleich kann Pigment, das nützlich Sehenswürdigkeiten bietet, zu beseitigen verwenden Shadowing für stark gebleicht Embryonen.
- Deaktivieren der Embryonen zur Bildfärbung, die tief innerhalb des Embryos ist, wie im Notochord, Lunge oder Gehirnregionen, (Figur 4). Um dies zu erreichen, setzen Sie die Embryonen durch eine Methanol-Serie bis in 100% Methanol.
- Nach vollständigem Eintauchen in Methanol, Transfer der Embryonen zu einer Lösung aus einem Teil Benzylalkohol und zwei Teile Benzylnzoate (BABB). Die Embryonen werden zunächst auf der Oberfläche schwimmen, sondern als das Methanol vermischt sich mit dem BABB, werden sie in die BABB sinken. Führen Sie jeden Schritt den Umgang mit BABB in Glasfläschchen oder Gerichte; BABB wird jeden Kunststoff oder Lack zu schmelzen.
- Einmal gelöscht, zeigen Sie die Embryonen mit Durchlicht von unten kommend den Embryo. Stellen Sie die Intensität des Lichtes als auch die schräg von unten, um den Kontrast zu verbessern und die beste Farbe.
- Bei der Anzeige gelöscht Embryonen erhöhen die Glas-Petrischale aus der Basis. Tun Sie dies, indem Sie einfach mit zwei anderen Petrischale Deckel um sie zu erhöhen, so dass die Region der Schale mit Embryonen erhöht ist.
HINWEIS: Dies hat den Vorteil der Einnahme des Basis unscharf und die Beseitigung der störenden Effekte von Fehlstellen oder Flecken auf dem Mikroskopbasis, die mit dem Bild stören können.
5. Doppelklicken Sie in situ Hybridisierung
- Um gleichzeitig zu betrachten das Expressionsmuster von two verschiedener Gene in einem einzigen Embryo synthetisieren zwei Sonden, eine für jede der verschiedenen Gene. Synthetisieren einer Sonde mit DIG-11-UTP als Etikett wie oben beschrieben. Verdünnen Sie das Produkt aus der Transkriptionsreaktion in RNA-Hybridisierungspuffer, um eine 3x konzentrierter Sonde ergeben als für einzelne in situ-Hybridisierungen verwendet.
- Synthetisieren die andere Sonde von Interesse mit dem gleichen Protokoll wie für DIG markiertem außer dass Fluorescein-12-UTP sondiert muss für DIG-11-UTP ersetzt werden. Verdünnen Sie das Produkt aus der Transkriptionsreaktion in RNA-Hybridisierungspuffer, um eine 3x konzentrierter Sonde ergeben als für einzelne in situ-Hybridisierungen verwendet.
- Mischen Sie die beiden konzentrierten Proben in einem Verhältnis 1: 1. Die besten Ergebnisse erzielen, verwenden Sie die fluoreszenzmarkierte Sonde für das Gen, das den stärksten Ausdruck in der einzigen in-situ-Hybridisierung Protokoll zeigt.
- Verwenden Sie dasselbe in situ Hybridisierung Protokoll beschrieben für Einzel in situ </ Em> Hybridisierungen mit Ausnahme der doppelte Sonde (Sonde, die die 1,5-fach konzentrierten Mischung aus Digoxigenin-markierte und Fluorescein-markierten Sonden) am Ende des ersten Tages an Stelle eines einzigen in situ Hybridisierungssonde.
- Folgen der einzigen Hybridisierungsprotokoll am zweiten Tag des Doppel in situ Hybridisierungsprotokoll, mit der Ausnahme, Anti-Fluorescein-AP Fab-Fragmenten bei einer 1: 4.000-Verdünnung anstelle von Anti-DIG-AP Fab-Fragmenten. Waschen Sie die überschüssige Antikörper aus dem Embryo, wie im einzelnen in situ-Protokoll und die Durchführung der ersten Farbreaktion unter Verwendung des BM-Purpur AP-Substrat.
- Nach der ersten Farbreaktion, inaktivieren die Fluorescein-Antikörper in 0,1 M Glycin, pH 2,0 für 40 Minuten, gefolgt von fünf zehn min Waschen in MAB. Blockieren Sie die Embryonen in MAB + HTSS + BR 90 min. Hinzufügen des Anti-DIG-Antikörper in einer 1: 2.000-Verdünnung in MAB + HTSS + BR und Inkubieren bei 4 ° C über Nacht.
- Am folgenden Tag, waschen Sie die Embryonen thoroughly in MAB (12 Wäschen von 30 min), um den überschüssigen Antikörper zu entfernen.
- Waschen der Embryos für 10 min in AP-Puffer (Tabelle 1) und dann mit BCIP (0,5 mg / ml in AP-Puffer) zu färben.
ANMERKUNG: Die in situ-Kombination sollte einen dunklen blau-violett-Färbung für die erste Farbreaktion und eine hellblaue Farbreaktion für die zweite (5) zu ergeben. - Stoppen Sie die letzte Farbreaktion durch Entfernen der AP-Puffer und spülen dreimal mit MAB. Befestigen Sie die Embryonen mit Mempfa 10 min. Mit 5 schnelle Waschungen in MAB oder TBT waschen Embryonen.
- Mit dieser Farbkombination, ist die Verwendung von Methanol in den post Färbung Behandlungen nicht mehr möglich ist, da es die BCIP allein Farbe zu beseitigen. Speichern der Embryonen nach dem Färben und Fixieren in PBS mit 0,02% Natriumazid. Färbeintensität kann schwach mit Doppel in Situs sein. Wenn dies ein Problem ist, reduzieren die Wäschen auf vier, die jeweils 2 Stunden Dauer.
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Representative Results
Die Verwendung von gewebespezifischen Sonden können hervorragende Informationen in Bezug auf den Stand der Entwicklung für spezifische Organe bereitzustellen. In den folgenden Beispielen wird die Stufe des Embryos auf der Nieuwkoop und Faber Staging-Tabelle 11 basieren. Wenn man Sonden Form Gene nach der Differenzierung zum Ausdruck, Troponin I in der ersten Stufe 28 bis 30, zum Beispiel (1C), die Anwesenheit oder die Größe eines differenzierten Organs verwendet, kann zu jedem Zeitpunkt nach der Differenzierung zu bewerten. Vor Jahren waren Embryologen in der Lage, eine solche Analyse zu tun, basierend auf bemerkenswerte Kenntnis der Histologie des frühen Embryos 12,13 aber das Know-how ist weitgehend auf die aktuelle Generation von Embryologen verloren. Zwar kann der Verlust dieser Know-how berücksichtigt werden bedauerlich, die Zuverlässigkeit und Benutzerfreundlichkeit der In-situ-Hybridisierungstechniken macht Identifizierung von spezifischen Geweben für jeden Forscher. Die Gewebe, die relativ unauffällig sind, ter Brut Drüse an embryonalen Phase 25, beispielsweise (Figur 1A) können anschaulich Verwendung in situs ohne die Notwendigkeit für spezifische Antikörper oder histologischen Verfahren (1C) gekennzeichnet werden. Außerdem ermöglicht die Verwendung von Whole Mount in Situs man das ganze Organ im Kontext des gesamten Embryo, anstatt sich auf Folgerung aus histologischen Schnitten (Abbildung 2) zu sehen. Auch Gewebe, die tief in der Embryo einschließlich der Optik Stiel (Abbildung 4) sind leicht eingesehen werden und die Verwendung von Embryos Clearing können scharfe Abgrenzung der Organgrenzen bereitstellen.
Bleichen von Embryonen, die endogene Pigment zu entfernen unter Verwendung von Peroxid-Lösungen hat sich weitgehend die Voraussetzung für die Nutzung Albino-Embryonen, die Pigment fehlt eliminiert. Bleichen für verschiedene Zeiten sinnvoll sein. Zum Beispiel, wenn der Fleck stark ist, ein Feuerzeug Bleichbedingungen für einige Pigmentierung abzuwarten kann nützlich sein können, da es allenOWS bessere Staging und Orientierung des Embryos (2A). Wenn der Fleck ist ein Bereich, wo es hoher Pigmentierung, wie die Niere (2B), eine nahezu vollständige Eliminierung des Pigments durch längere Inkubation in der Bleichlösung gibt jedoch ein besseres Ergebnis.
Die Embryonen sind in der Regel für die Aufnahme einer bestimmten Stellung, wenn in Lösung. Nach Neurulation, neigen sie dazu, auf ihren Seiten flach zu legen. Das ist gut für Bilder von der Flanke (2B), kann aber ein Problem mit anderen Bereichen. Die Verwendung einer Agarose-Basis ermöglicht es, Kanäle in die Agarose, die verwenden können, um die Embryonen zu orientieren werden abgeschnitten. Beispielsweise werden Blutvorläuferzellen zur ventralen Seite des Embryos (2A) und das volle Ausmaß der Färbung lokalisiert ist schwer zu beobachten. Positionierung des Embryos in einem Kanal mit der ventralen Seite nach oben ermöglicht dann komplette Anzeige dieser Genexpressionsmuster (3A). Die Verwendung von Doppel in situ-Hybridisierung, das die Beziehung zwischen zwei Genexpressionsmuster in einem einzelnen Organismus (Abbildung 5), wobei die Notwendigkeit des Vergleichens zwischen verschiedenen Embryonen, kleine Unterschiede in der Morphologie aufweisen kann zeigen. Vielleicht am wichtigsten ist, die Verwendung von in situ Hybridisierung gibt einem die Möglichkeit, deutlich zu kenn Zellen vor der histologischen Differenzierungs löschen, basierend auf der Expression von Genen, die in frühen Vorläuferzellen von einer Linie, wie PAX2, die in vielen Geweben exprimiert wird, das exprimiert werden frühen Embryos, vor der Differenzierung (4A). Die Fähigkeit, Vorläufern und Geweben, die nicht deutlich basieren auf Histologie, wie myeloischen Vorläuferzellen (1B) zu identifizieren, hat die Forscher gestattet, wesentlich detaillierter Fragen über den Entwicklungszustand eines Organs zu stellen und auch um die Ergebnisse der experimentellen beurteilen manipulation zur Eileiter Differenzierung eines Gewebes verursachen.
Fig. 1: Beispiele der whole mount in situ-Hybridisierung auf Xenopus-Embryonen Die blaue Färbung aus einem in situ-Hybridisierungsexperiment deutlich abgrenzen entwickelnden Strukturen des frühen Embryos von Xenopus (a) eine Vorderansicht einer Bühne 26 Embryos Hervorhebung der Brutdrüse. wie durch die Expression von uvs.2 14 abgegrenzt (B) A ventralen Ansicht eines Embryos zeigt den Standort der frühen myeloiden Zellen in Stufe 20 unter Verwendung der Expression von Myeloperoxidase 15 als Markierung (C) die frühen Herz bei Stufe 28.. - 30 wird durch die Expression von kardialem Troponin I 16 visualisiert. Ein klarer Vorteil dieser Methode ist, dass allediese Genexpressionsmuster wurden mit verschiedenen Sonden werden sichtbar aber der verwendete Protokoll ist in allen Fällen identisch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Figur 2: Verschiedene Stufen des Bleichens kann zur Färbung im Embryo zu visualisieren (A) Diese Blaufärbung an der Unterseite dieser Embryos zeigt die Expression von Hämoglobin in den ventralen Blutinseln etwa Stufe 36. Dies ist ein Bereich, der. Embryo, der nur leicht pigmentiert ist und somit die Embryos nicht für eine lange Zeit, wie sie durch den hautfarbenen Pigments in das Auge und entlang der Flanke des Embryos ersichtlich gebleicht. Die Möglichkeit, die Pigmentierung siehe ermöglicht eine bessere Visualisierung der Stufe der Embryo. Wenn die Färbung ist in einer Region mit mehr natürliche Pigmentierung, wie das Nervensystem und die Flanke des Embryos, wird eine größere Bleich helfen sehen die in situ wie in B (B) Im Folgenden finden Sie den Ausdruck PAX8 17 in der Formnieren , pronephric Kanal und Hinterhirn ist am besten sichtbar nach dem Bleichen fast alle endogenen Pigment entfernt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: Manipulation der Agarose Base kann bei der Orientierung der Embryonen helfen Imaging spezifischen Regionen des Embryos kann schwierig sein, weil sie dazu neigen, sich einer bestimmten Stellung in der Schale zu ergreifen (A) bei Kaulquappen Stadien der Embryo auf der Seite liegen.. . Durch Schnittting ein feiner Kanal in der Agarose (schwarze Pfeile) der Embryo von der Bauchseite eingesehen werden, hier, die Hämoglobin-Ausdruck in der ersten Stufe 36, mit genügend Stabilität, um ein gutes Bild aufzunehmen. (B) Das ventrale Ansicht der hand1 Ausdruck auf der Bühne 20 umreißt die Seitenplatte Mesoderm 6. Der Embryo wird in einem kleinen Loch, das seine Position mit der Bauchseite nach oben platziert stabilisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 4: Innere Organe können sowohl undurchsichtig, unverzollt und in frei verfügbaren Embryonen im Stadium 34 (A), der Optik Stiel (gelber Pfeil) gesehen werden In einem ungeklärten Embryo für PAX2 befleckt relativ leicht visualisiert werdenebenso wie die Färbung sich das Neuralrohr. Einzelheiten sind jedoch nicht scharf. Durch das Löschen des Embryos (B) die Grenzen der Ausdrucks Websites, einschließlich der optischen Stiel (gelber Pfeil) sind schärfer. Das Ausmaß der Rodung wird durch die Fähigkeit, beide Augen in dieser gelöscht Embryo sehen angezeigt. Beachten Sie auch, dass einige Färbung wurde in den inneren Hohlräumen (lila Pfeil), ein häufiges Problem bei der Anzeige gelöscht Embryonen akkumuliert.
Abb. 5: Eine repräsentative Doppel in situ Hybridisierung auf einem Xenopus Embryo Expression der Seitenplatte Marker, hand1, wird durch die hellblaue Färbung auf der Bühne sichtbar 26. Expression von ETV2 in der Entwicklung von Gefäßsystem wird von dunkelblau lila Flecken sichtbar gemacht. Expression von hand1 gewöhnlich sehr intensiv und damit war es für t verwendeter schwächer fluoresceinmarkierten Sonde und BCIP Kombination. Das verwendete Digoxigenin-markierten Sonde und BM-Purpur-Kombination für die schwächere ETV2 Ausdruck.
| Name | Endkonzentration | Anzahl / 100 ml |
| Mempfa | 1 mM MgSO 4 | 100 ul 1 M MgSO 4 |
| (Bei 4 ° C) | 2 mM EGTA, pH 8,0 | 10 ml von 20 mM EGTA, pH 8,0 |
| 0,1 M MOPS, pH 7,5 | 10 ml 1 M MOPS, pH 7,5 | |
| 4% Paraformaldehyd, pH 7,5 | 50 ml 8% Paraformaldehyd, pH 7,5 | |
| TTW | 50 mM Tris, pH 7,4 | 5 ml 1 M Tris, pH 7,4 |
| 200 mM NaCl | 4 ml von 5 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 & mgr; l Tween 20 | |
| 100X Denhardt-Lösung | 2% BSA | 2 g BSA |
| (Über 0,2 um Filter zu filtern, | 2% PVP-40 | 2 g PVP-40 |
| bei -20 ° C) | 2% Ficoll 400 | 2 g Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M NaCl | 17,5 g NaCl |
| 300 mM Trinatriumcitrat | 8,8 g Trinatriumcitrat | |
| RNA-Hybridisierungspuffer | 50% Formamid | 50 ml 100% Formamid |
| (Bei 4 ° C) | 5 × SSC | 25 ml 20x SSC |
| 1 mg / ml Hefe-RNA | 4 ml von 1 mg / ml Hefe-RNA in 50% Formamid | |
| 1X Denhardt-Lösung | 1 ml der 100x Denhardt-Lösung | |
| 0,1% Tween 20 | 100 & mgr; l Tween 20 | |
| 5 mM EDTA, pH 8,0 | 1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 | |
| MAB | 100 mM Maleinsäure | 1,16 g Maleinsäure |
| (PH-Wert 7,5, bei 4 ° C) | 150 mM NaCl | 0,88 g NaCl |
| MAB + HTSS + BR | 100 mM Maleinsäure | 96 ml MAB |
| 4% wärmebehandelt Sheep Serum | (Aliquotiert Wärme bei 55 ° C für 30 min behandelt) 4 ml wärmebehandeltem Schafserum | |
| 2% Blocking Reagenz | 2 g Roche Blocking-Reagenz | |
| MAB + HTSS + BR + Anti-Dig-Antikörper | 100 mM Maleinsäure | 96 ml MAB |
| 4% Wärme Treated Sheep Serum | 4 ml wärmebehandelt Sheep Serum | |
| 2% Blocking Reagenz | 2 g Roche Blocking-Reagenz | |
| 1: 10.000 Anti-DIG-AP, Fab-Fragmenten Antikörper | 1,5 & mgr; l Anti-Digoxygenin-AP, Fab-Fragmenten Antikörper | |
| Alkalische Phosphatase (AP) Puffer | 100 mM Tris, pH 9,5 | 10 ml 1 M Tris, pH 9,5 |
| 50 mM MgCl 2 | 5 ml 1 M MgCl 2 | |
| 100 mM NaCl | 2,5 ml 4 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 & mgr; l Tween 20 | |
| Bleichlösung | 0,3% H 2 O 2 | 3,34 ml 30% H 2 O 2 |
| 5% Formamid | 5 ml 100% Formamid | |
| 0,5% SSC | 2,5 ml 20x SSC | |
| Clearing-Lösung | 1/3 Benzylalkohol | 33 ml |
| 2/3 Benzyl Benzoate | 67 ml |
Tabelle 1: Lösungs Rezepte
| Name | Höhe |
| Dig-NTP Mix | 5 ul 20 mM CTP |
| (40 & mgr; l Reaktion) | 5 ul 20 mM GTP |
| 5 ul 20 mM ATP | |
| 3,25 & mgr; l von 20 mM UTP | |
| 3,5 ul 10 mM Dig-11-UTP | |
| 18,25 ul destilliertem, autoklaviertem Wasser | |
| Probe Synthesis | x & mgr; l Matrizen-DNA(Abhängig von der Konzentration) |
| (20 & mgr; l-Reaktion) | x ul destilliertem, autoklaviertem Wasser |
| 4 ul Dig-NTP-Mix | |
| 0,5 ul RNAse-Inhibitor | |
| 2 ul 10fach RNA-Polymerase-Puffer | |
| 2 & mgr; l RNA-Polymerase |
Tabelle 2: Probe Synthese-Rezepte
| Name der Reagenz | Ungefähre Volume | Dauer | Temperatur |
| 100% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 50% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| Vorwärmen RNA Hybridisierungspuffer und Probe auf 65 ° C | |||
| TTW | 4 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| TTW | 4 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| RNA-Hybridisierungspuffer | 2 ml | 10 min, Schaukel | Raumtemperature |
| Vorgewärmte RNA Hybridisierungspuffer | 2 ml | 1 Stunde, Schaukel | 65 ° C |
| Sondenlösung | 1 ml | Übernachtung, Schaukel | 65 ° C |
Tabelle 3: Schritte zur Erster Tag der In situ-Hybridisierung Protocol (ca. 3 Stunden insgesamt)
| Name der Reagenz | Ungefähre Volume | Dauer | Temperatur | ||||
| Vorwärmen RNA Hybridisierungspuffer und 02.x SSC bis 65 ° C und 2 × SSC und 37 ° C | |||||||
| Zurück Sonde Lösung Rohr zur wiederholten Nutzung | |||||||
| RNA-Hybridisierungspuffer | 2 ml | 10 min, Schaukel | 65 ° C | 2 × SSC | 2 ml | 20 min, Schaukel | 37 ° C |
| 2 × SSC | 2 ml | 20 min, Schaukel | 37 ° C | ||||
| 0,2x SSC | 4 ml | 1 Stunde, Schaukel | 65 ° C | ||||
| 0,2x SSC | 4 ml | 1 Stunde, Schaukel | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1,5 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur | ||||
| MAB + HTSS + BR + anti-DIG-Antikörper | 1,5 ml | Übernachtung, Schaukel | 4 ° C |
Tabelle 4: Schritte zur Zweiter Tag der In situ-Hybridisierung Protocol (ca. 4 Stunden insgesamt)
| Name der Reagenz | Ungefähre Volume | Dauer | Temperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| BM Lila AP Substrat | 500 bis 750 & mgr; | Übernachtung, Schaukel (siehe Text) | Raumtemperatur / 37 ° C (siehe Text) |
Tabelle 5: Schritte zur Dritter Tag der In situ-Hybridisierung Protocol (ca. 7 Stunden)
| Name der Reagenz | Ungefähre Volume | Dauer | Temperatur |
| 25% Methanol | 2 ml 5 min, Schaukel | Raumtemperatur | |
| 50% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 100% Methanol (kalt) | 2 ml | 20 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 100% Methanol (kalt) | 2 ml | Variiert, kein Schaukeln | Raumtemperatur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 50% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| Mempfa | 2 ml | 30 Min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| Bleichlösung | 4 ml | 40 min-3 h, Schaukel | Raumtemperatur / 37 ° C (siehe Text) |
| Speichern von Embryonen | |||
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 50% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 100% Methanol | 4 ml | Lagerung bei -20 ° C | |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, Schaukel | Raumtemperatur |
Tabelle 6: Schritte zum Stoppen in situ-Hybridisierung, Bleaching und Lagerung von Embryonen
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Discussion
Die Fähigkeit, in situ Hybridisierung verwendet werden, um die Expressionsmuster von spezifischen Genen sichtbar bleibt das am häufigsten verwendete Verfahren zur spezifischen Organen oder Zelltypen in Xenopus Embryo identifizieren. Dies ist wegen der verschiedenen Vorteile, die diese Technik bietet. Die Expression eines Gens spezifischen Strukturen und vor jedem histologischen Zeichen der Differenzierung zu identifizieren, wie die Hülle für Nkx2.5-Expression in den Herz Progenitoren vor einer klaren Abgrenzung dieser Zellen 18. Sobald alle Reagenzien sind in der Hand, ist es auch sehr kostengünstig. Erzeugung von vielen einzelnen Sonden, die effektiv wiederverwendet werden können, ist bei minimalem Zeit- und Kostenaufwand als die Erzielung der Plasmide, die die Gene von Interesse codieren, möglich. Nach unserer Erfahrung können Sonden Jahren mit wenig Aktivitätsverlust trotz der unvermeidlichen kleinen Verdünnungen, die bei jedem Gebrauch gekommen wiederverwendet werden. Schließlich gibt es wenig Optimierungs requirot, wenn die Verwendung unterschiedlicher Sonden.
Die Qualität der Sondensynthese ist ein Schlüsselfaktor für den Erfolg des Protokolls. Es gibt viele Möglichkeiten, um die Qualität der RNA-Sonde überprüfen, sondern einfach laufen die RNA-Sonde auf einem TAE-Gel ist eine schnelle und einfache Methode, die sehr zuverlässig ist. Wir verwenden routinemäßig Ethidiumbromid, um die RNA zu färben und das erfordert eine spezielle Handhabung und Entsorgung der Gele von den meisten Institutionen. Nicht-toxische Alternativen sind im Handel erhältlich, obwohl wir nicht speziell verglichen haben, die zur Visualisierung der Sonden. Die Sonde sollte als eine einzelne Bande laufen obwohl es im Vergleich zu DNA auf einem TAE-Gel etwas unscharf erscheinen. Eine Schätzung der Menge von RNA erhalten werden kann: eine gute Reaktion wird etwa 1 ug / ul RNA haben. Ein leicht visualisiert Band mindestens 0,5 ug RNA darstellen und ein helles Band über 1 & mgr; darstellen. Obwohl offensichtlich nicht ganz richtig und einige Erfahrung erfordert, Quantifizierung basierend auf das Gel rapID und die Robustheit der in situ Verfahren ermöglicht es, gut zu arbeiten. Wenn es Besorgnis über die Wiederholbarkeit, kann man leicht zu verwenden UV-Absorption, eine kleine Menge des Transkriptionsreaktion zu quantifizieren, obwohl wir nicht fanden, dass dies ein wichtiges Anliegen sein. Schließlich erlaubt das Gel ein, um zu sehen, wenn die Matrizen-DNA eliminiert wurde. Wenn das Gel zeigt, daß es keine RNA, die zwei wahrscheinlichsten Erklärungen schlechte DNA-Template oder die Transkriptionspuffer nicht gut funktioniert. Erwärmen des Transkriptionspuffer auf 37 ° C und guter Durchmischung vor der Verwendung oder Zugabe von 1 ul 100 mM DTT frischen zur Transkriptionsreaktion kann gelegentlich Hilfe bei der letzteren. Eine wichtige Komponente des Transkriptionsreaktionspuffer Spermidin und es kann die DNA-Matrize bei niedrigen Temperaturen machen Erwärmung des Puffers wichtig auszufällen. DTT im Puffer kann auch erheblich zu fällen Hemmung der Reaktion. Wenn ein Niederschlag im Puffer gesehen, erwärmen die Lösung undVortex kräftig. Es besteht keine Notwendigkeit für die Aufnahme einer ungewöhnlichen Vorsichtsmaßnahmen, wie beispielsweise die Behandlung des Wassers mit DEPC oder Autoklavierung Spitzen und Röhrchen, um RNase-Aktivität zu verhindern. Die Anwesenheit des Handels Ribonukleasehemmers bietet erhebliche Schutz gegen RNasen aus der Umwelt. Man beachte, dass andere UTP Etiketten verwendet werden, wie Fluorescein, nach unserer Erfahrung, die Digoxigenin-markierte UTP und Anti-Digoxigenin-Antikörper-Kombination liefert die konsistente Ergebnisse.
Frühe Protokolle für Sondenerzeugung nahe, dass die alkalische Hydrolyse der synthetisierten Sonden sollten, um für eine größere Eindringen der Sonde erlauben, durchgeführt werden 4. Die Hydrolyse der Sonde scheint nicht mit der in-situ-Hybridisierung Prozess zu helfen; RNA-Sonden von mehr als 500 bp in der Regel geben ein ausgezeichnetes Signal und Sonden, die länger als 2 kb in der Länge ebenfalls gut arbeiten. Kürzere Sonden können, wenn der Ziel-RNA ist reichlich vorhanden, aber mehr Sonden b gebenetter Färbung. Es scheint nicht, eine klare Vorteil bei der Verwendung alkalischen Aufschluss zu brechen mehr Sonden sein.
Sorgfalt bei der anfänglichen Behandlung der Embryonen ist sehr wichtig. Die Entfernung der Befruchtung Umschlag ist besonders hilfreich für die Embryonen nach neuronalen fache Schließung und vor Natur Schraffur aus der Befruchtung Umschlag. Bei der Elongation des Embryos innerhalb des Befruchtungs Umschlag, der Embryo wird gekräuselt und wenn in dieser Position fixiert ist, werden die Embryonen härter ein, sobald die in situ Hybridisierung. Allerdings, wenn die Embryonen von der Befruchtung Umschlag vor der Fixierung entfernt, sie schnell begradigen. Wenn Embryonen während der Membranentfernung beschädigt sind, damit sie die Wunde vor der Fixierung heilen, weil beschädigte Gewebe können in einem falschen Signal in situ Hybridisierung an der Wundstelle führen. Wenn klein, die Wunden zu heilen sehr schnell, oft innerhalb von Minuten 19. Später Schritte können auch beschädigt werden die Embryonen duRingflüssigkeitstransfer und so Pflege benötigt wird, bei einem Wechsel Lösungen. Schäden in der frühen Schritte bedeutet in der Regel, dass der Embryo wird stark von der Ende des Verfahrens beschädigt und beschädigt Regionen werden beim Anblick der Schäden verursachen falsch in situ-Signale. Weiterhin können bis zu 30 Embryonen in einem einzelnen Fläschchen, aber mit mehr Embryos sondiert es mehr Chancen für hohe Hinter Entwicklung während der Farbreaktion ist jedoch eine Erhöhung der Waschungen an Tag 3 oder Waschen über Nacht kann dies zu kompensieren.
In diesem Protokoll wurde die Anzahl der Schritte reduziert und die Verwendung von mehreren üblicherweise verwendeten Reagenzien beseitigt ist. Man beachte, dass dieses Protokoll beseitigt mehrere Schritte, die in viele andere Protokolle, die eine Proteinase K-Verdau und die Verwendung von Essigsäureanhydrid, um positiv geladene Gruppen zu blockieren verwendet. Diese Schritte können noch nützlich sein, wenn man Säugetier- und Vogelembryonen, aber bei der Verwendung von Xenopus, sodass diese Schritte hat nur geringe Auswirkungen on die endgültigen Ergebnisse der in-situ-Hybridisierung. Unser Labor ist nicht bestimmt, ob diese gleichen Vereinfachungen können in situ Hybridisierung Protokolle für andere Tierarten angewendet werden. Proteinase K Digestion vor allem noch in anderen Embryonen, wie Küken oder Maus wo Sonde Eindringen größer Einschränkungen erforderlich.
Die Verwendung von BM purple Substrat ist bequem und zuverlässig. Es gibt jedoch eine Reihe von anderen Möglichkeiten für die Fällungs, Farbe alkalische Substrate, die benötigt werden, um die Ziel-RNA in dem Embryo zu lokalisieren erhältlich. Insbesondere ist eine Kombination von NBT / BCIP üblicherweise verwendeten 4 und funktioniert gut. Einige Farb Reagenzien sind löslich in Methanol, wobei in diesem Fall wird die Verwendung von Methanol nach der Färbung den Fleck zu beseitigen und zu vermeiden. Andere Farbkombinationen können auch bei der Durchführung von Doppel in Situs verwendet werden. Die Verwendung einer ähnlichen Verbindung (NBT / BCIP anstatt BM purple) wurde auch gezeigt,sehr robust, wenn Sie Mausembryonen 20. Die blaue Farbe der Färbung und der endogene Pigment der Embryos sind oft schwierig, klar in Bildern zu unterscheiden. Verwendung von Albino Embryonen auch Pigment zu beseitigen, sondern die Bleichlösung ist nahezu so effektiv und viel bequemer ist, da sie nicht die Aufrechterhaltung von Albino Erwachsenen Zucht haben. Wenn die Färbung ist relativ schwach ist, können starke Bleich diese Färbung zu betonen. Wenn die Färbung ist stark, kann verlassen einige leichte Pigment einen wirkungsvollen Kontrast und auch mit Ausrichtung und Durchführung der Embryo helfen.
Nach der Hybridisierung über Nacht in RNA-Sonde kann das Protokoll von der rein manuellen Protokoll Sie hier, um die Verwendung eines in situ Hybridisierung Roboter umrissen abweichen. Die Verwendung der in-situ-Hybridisierung Roboter spart fast einen ganzen Tag als Tag zwei und drei Tage der manuellen Protokoll kann auf einen Tag reduziert werden, da der Roboter durch die Nacht arbeitet eind können sie alle den entsprechenden Temperaturänderungen. Der Roboter ist auch sehr konsequent in ihre Ergebnisse und ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung vieler Proben effizient. Es bleibt vorteilhaft, den ersten Tag von Hand machen wie die ermöglicht die Wiederverwendung von Sonden und Verwendung von kleineren Mengen an Reagenzien. Der einzige signifikante Nachteil der Verwendung eines Roboters ist die Anfangskosten des Instruments.
Dieses Protokoll beschreibt einige der Wege, um effektiv Bild eine in situ Hybridisierung. Es ist wichtig, dies zu tun, wie viele der Informationen können verloren gehen, wenn das Bild ist schlecht. In vielen Fällen ist die Abbildung der in situ Ergebnisse eines Experiments, erfordert die gleiche Zeit wie die ersten Experiment. Einige Elemente der Prozedurvariablen wie der Bleichgrad haben ein Element der persönlichen Präferenz. Andere bildgebende Effekte, indem Sie den Teller auf einem farbigen Grund erreicht werden. Oft ist eine leichte Blauton zu dem Agar kann das tiefblaue Färbung des in Sit betonenu Hybridisierung. Setzen Sie einfach die Petrischale mit dem Agar über ein Blatt aus blauem Kunststoff, um den gewünschten Effekt zu erzielen.
Die hier beschriebenen Methoden bieten jedoch eine Grundlage, mit dem bildgebenden Möglichkeiten zu erkunden. Embryonen können eingesehen entweder gelöscht (transparent gemacht, um bessere Sicht internen Strukturen) oder ungeklärten (betrachtet, wie sie bei normalen Lichtverhältnissen erscheinen). Einige der Entscheidung in Bezug darauf, wie auf dem Bild der Embryo ist von der Stelle des Expressions. Wenn der Ausdruck auf oder nahe der Oberfläche des Embryos ist es am besten, um Bild der Embryo ohne Lichtung. Es gibt mehrere Vorteile der Verwendung der ungeklärten Embryonen. Der Vorgang des Löschens der Embryonen erfordert viele Schritte und die verwendeten Chemikalien, um die Embryonen zu löschen sind schwierig zu handhaben. Auch mehrere Hohlräume im Embryo ermöglichen Fällung von alkalischer Phosphatase Substrate, die in falschen Hohlraum Färbung führen kann. Insbesondere die Blastocoel von frühen Embryonen und der pharyngeal Höhle zeigen oft Färbung (Abbildung 4). Diese falsche Färbung ist nicht in Embryonen, die nicht gelöscht werden sichtbar. In den meisten Fällen, auch nur mäßig kann tiefen Ausdruck in ungeklärten Embryonen sichtbar gemacht werden, einschließlich mesodermalen Geweben wie Herz, Niere, und Somiten und endodermalen stuctures wie Schilddrüse und Leber. Das Verschieben der Embryonen durch eine Methanol-Serie entweder Hydrat in PBS zur Ansicht oder in 100% gesetzt Methanol für die Lagerung ermöglicht mehrere Runden der Lagerung und Bildgebung. Das Methanol Lagerung ermöglicht es, verschiedene Änderungen an der Bild über längere Zeit versuchen.
Es gibt einige Nachteile bei der Verwendung der in situ-Hybridisierungstechnik auf Genexpression aussehen. Expressionsniveaus sind nicht streng quantifizierbare obwohl Vergleich innerhalb eines Embryos und grobe Veränderungen in der Expression und Veränderungen in der Expression Domänengröße sind in der Regel auf der Hand. Wie bei anderen RNA-basierte Techniken, spielt es keine Informationen, wie t bereitzustelleno der Proteine, die von dem Gen von Interesse, die Interpretation der Ergebnisse zu begrenzen können codiert. Schließlich ist es oft schwierig zu bestimmen, was möglicherweise eine Hintergrundfärbung im Vergleich zu der wahren Ausdruck Domäne sein. Dies ist insbesondere ein Problem mit Genen mit unbekannter Expressionsmuster, das weit verbreitet sein kann. Oft wird eine Sonde aus dem Sinnstrang des gleichen Gens erzeugt als Kontrolle für nicht-spezifische Färbung verwendet. Verwendung eines Sense-Stranges Steuer einige Informationen zu einem Problem mit Reagenzien bieten jedoch keine definitive Beweis dafür, dass der Färbung auf der Basis der Antisense-Sonde vollständig genau. Die Ergebnisse einer in situ in der Regel merklich konsistent Embryonen, wenn mehrere Embryonen verwendet werden, und dies kann als ein Maß für das Vertrauen in ein Färbungsmuster verwendet werden. Auch können verschiedene Antisense-Sonden, aus verschiedenen Teilen des Gens, insbesondere nicht-translatierten Regionen, erzeugt werden, um zu sehen, wenn sie dasselbe Färbemuster geben. Wenn sie dies tun,sie stellt auch das Vertrauen in die beobachtet Färbemuster falls er identisch ist. Das verwässerte Sonden können auch bei längerer Einwirkung auf die Farblösung verwendet werden, um zu sehen, wenn die gleiche Färbungsmuster ergibt. Ein Faktor, der in der Regel schafft Vertrauen in einem Färbungsmuster ist, ob diese Muster entspricht einer bestimmten embryonalen Struktur. Genug in Situs haben nun mit einer großen Vielfalt von Genen, die neuartige Expressionsmuster dürften relativ seltene Ereignisse geschehen. Große Datenbanken in situ Bilder für unterschiedliche Organismen, die verwendet werden können, um die Bildergebnisse vergleichen etabliert. Für Xenopus-Embryonen, Xenbase (www.xenbase.org) ist ein ausgezeichnetes Beispiel für eine Ressource, die verwendet werden, um Expressionsmuster zu verstehen. Andere Modellorganismen haben auch ähnliche, umfangreiche Datenbanken von Bildern.
Trotz dieser potenziellen Vorbehalte in situ Hybridisierung bleibt ein leistungsfähiges und zuverlässiges Tool, das sehr nützlich für istdas Studium der Organentwicklung. Es ist wahrscheinlich die Methode der Wahl zur Identifizierung von Zelltypen und Prüfung Änderung der Genexpression Domänen für die absehbare Zukunft bleiben.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
