Protocol
1. 배아 준비
- 배아 문화, pH가 8.0 이전의 고정 8 2.5 % 시스테인을 사용하여 드 젤리 배아의 일환으로 정기적으로하지 않으면. 이 절대적으로 필요하지 않지만 수동으로 미세 집게를 사용하기 전에 고정에 시비 봉투를 제거하려면 유용합니다.
- 배아를 전송하는 데 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 피펫은 배아 그렇게 배아를 선택하기에 충분히 넓은 지점에서 유리 피펫을 절단하는 다이아몬드 펜을 사용하여 전송하기에 충분히 넓은 없습니다. 신속하게 날카로운 모서리 용융 분젠 버너의 불꽃을 통해 절단 팁을 전달하여 절단 후 피펫의 날카로운 모서리를 제거합니다.
참고 : 관리는 육안 검사로 냉각 한 것으로 나타나더라도 유리가 여전히 화상을 초래할 정도로 뜨거울 수 있습니다로, 촬영해야합니다.
- 배아를 전송하는 데 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 피펫은 배아 그렇게 배아를 선택하기에 충분히 넓은 지점에서 유리 피펫을 절단하는 다이아몬드 펜을 사용하여 전송하기에 충분히 넓은 없습니다. 신속하게 날카로운 모서리 용융 분젠 버너의 불꽃을 통해 절단 팁을 전달하여 절단 후 피펫의 날카로운 모서리를 제거합니다.
- 단계의 배아 고정을 수행합니다. 첫째, 배아 고정에 사용되는 유리 병을 준비합니다. 마지막 포함한 모든 단계에 대해이 유리 병을 사용하여저장. 프로세스의 모든 단계에서 배아를 모니터링 할 수 있도록 뚜껑에 좋은 테프론 씰 분명 유리 병을 사용합니다. 영구 마커를 사용하여 적절한 실험 정보와 함께 유리 병에 레이블을, 심지어 영구 마커 인해 알코올 및 기타 용매의 사용 절차의 과정을 통해 손실됩니다로서 다음, 투명 테이프로 라벨을 커버한다.
- 배아를 해결하기 위해 Mempfa를 사용합니다. 한 번에 50 ~ 100 ml의 배치로 8 % 파라 포름 알데히드의 재고를 확인하십시오. 용액에 파라 포름 알데히드를 얻기 위해 필요한 50 ~ 60 ° C에 필요한 H 2 O 및 열의 약 75 %를 사용합니다.
참고 :이 솔루션은 포름 알데히드보다는 파라 포름 알데히드를 활용한다는 점에서 Memfa 나이가 발표 된 프로토콜 버전에서 사용보다 약간 다릅니다. - 10N NaOH를 2 ~ 3 방울을 추가 또는 pH가 7.5까지 (산도를 확인하기 위해 사용 산도 용지) 약. 파라 포름 알데히드는 매우 독성, 따라서 흄 후드에서 원액을 생성합니다. 파라 번포름 알데히드 용액에, 신선한 컨테이너로 와트 만 여과지 용액을 필터 및 최종 부피로 H 2 O를 추가한다. 필요한 경우 1 ~ 2 주 동안 4 ° C에서 파라 포름 알데히드 용액을 저장합니다.
- Mempfa 고정 용액 (표 1)의 나머지 구성 요소를 조립한다. 파라 포름 알데히드의 최종 작업 농도가 4 % 있는지 확인합니다. 주식으로 4 ° C에서 고정 솔루션의 모든 구성 요소를 저장합니다.
- 컷 유리 피펫을 사용하여, Mempfa 용액 (표 1)의 약 3-4 ml로 충전 된 라벨 유리 병에 배아를 추가하여 배아를 수정. 유리 병 당 이상의 20 ~ 30 배아를 고정하지 마십시오. 배아 매체로부터 액체 전사의 최소 배아를 추가합니다. 실온에서 2 시간 또는 밤새 4 ° C에 대한 Mempfa 솔루션에 배아를 수정합니다.
- 후반 내배엽 구조에 대해서는 수동으로 고립 장과 내배엽 파생 상품 9,10에 원위치에서 수행프로브의 좋은 침투 할 수 있으며 또한 공동의 얼룩을 방지한다.
- -20 ℃에서 100 %의 메탄올 용액을 저장한다. 파라 포름 알데히드 고정 후, 약 4 ml의 -20 ° C, 배아의 저장을위한 100 % 메탄올 Mempfa 솔루션을 교체합니다.
- 유리 또는 다른 배아 달라 붙는 것을 방지하기 위해 배아 메탄올을 첨가 한 후, 바이알 소용돌이 친다. 또한, 느슨한 경우 메탄올이 시간에 냉장고에 증발 할 수 있기 때문에 병이 단단히 밀봉되어 있는지 확인합니다.
주 : 배아 보체 품질의 손실없이 염색 전에 메탄올 가능성 이상 1 년 이상 저장 될 수있다.
- 배아를 해결하기 위해 Mempfa를 사용합니다. 한 번에 50 ~ 100 ml의 배치로 8 % 파라 포름 알데히드의 재고를 확인하십시오. 용액에 파라 포름 알데히드를 얻기 위해 필요한 50 ~ 60 ° C에 필요한 H 2 O 및 열의 약 75 %를 사용합니다.
2. 프로브 준비
- 제닌 표지 프로브를 만들기 위해 주형 DNA의 1-2 μg의를 사용합니다. 제한하여 원하는 유전자의 5 '말단에 적절한 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 절단하기에 적합한 효소 그쪽t 벡터는 안티센스 프로브를 생성한다.
참고 : 플라스미드 적절한 RNA 중합 효소 결합 부위 (예를 들어 T7, T3, 또는 SP6)을 가져야한다. - DNA, 물, NTP는 프로브 합성 반응을 조립하기 전에 실온까지 가온 혼합하고 중합 효소 완충액 허용. 표 2에 열거 된 순서대로 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 RNA 합성 반응의 요소를 추가한다. 물의 양을 조절하여 20 ㎕의 프로브 합성 반응의 총 부피를 가지고 첨가. 중합 효소 완충액 성분 및 고농도에서 냉간시 주형 DNA를 침전 할 수 있기 때문에, 실온에서 반응을 조립한다.
- 37 ° C에서 2 시간 동안 전사 반응을 품어.
참고 : 약간 긴 두 시간 이상의 항온 부작용없이 리드뿐만 아니라, 약간의 수율은 커지고있다. 한 시간 동안 배양 한 경우, 수율은 여전히 좋은 프로브를 확인하기에 충분 감소하지만됩니다.- 마무리 전사 반응을 기다리는 동안, 프로브의 품질을 테스트하기 위해 사용되는 아가 로스 겔을 만든다. 1X TAE 완충액 100 mL에 아가 1 μg의 용융 비점 용액을 가열하여 (표 1 참조). 아가로 오스 분말이 완전히 용해 될 때 열에서 솔루션을 제거합니다.
- 아가로 오스는 자외선 (UV) 빛 아래 RNA의 시각화를 허용하도록 약 60 ° C로 냉각되면, 아가 로스 겔을 약 100 ㎖로 2 μL 티듐 브로마이드 스톡 용액 (10 ㎎ / ㎖)를 첨가.
주 : 겔 미래 반복 용융시키지 않고 주입 될 수 있도록이 아가 로스 겔 용액을 60 ° C의 배양기에서 유지 될 수있다. 때문에 잠재적 인 독성에 티듐 브로마이드 처리에주의하십시오.
- 주형 DNA를 제거하기 위해 37 ℃에서 10 분 동안 추가로 2 시간 배양 한 후에 전사 반응에 1 μL DNAseI (RNAse가없는 등급)를 첨가하고, 배양한다.
- 반응물 믹스 1 μL를 제거TE 완충액 (10 mM 트리스 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA), 5M NH 4 아세테이트 10 μL, 220 μL에 1 % SDS의 80 μl를 추가 1 % 아가로 오스-TAE 젤과 나머지 (20 μL)에 확인 차가운 에탄올. 와류 혼합하고 격렬 RNA 품질 검사 결과가 공지 될 때까지 얼음 상 방치.
- 1 % 아가로 오스-TAE 젤에 침전하기 전에 제거 RNA의 1 μl를 실행합니다. 젤에 로딩을 쉽게하기 위해, 물 4 ~ 5 μL와 RNA 표준 로딩 염료 1 μl를 추가합니다. (설명 참조) 프로브의 품질을 확인하기 위해 UV 광 트랜스 일루미네이터를 이용하여 겔상에서 RNA보기.
- 10 ~ 15 분 동안 전속력으로 마이크로 원심에서 회전에 의해 단계 2.5에서 얼음에 방치 된 나머지 RNA를 침전. 인출 유리 피펫으로 상층 액을 배출시킵니다 간략하게 건조 할 수 있습니다.
- 에펜 도르프 튜브에서 RNA 혼성화 완충액 1 ㎖ (표 1)에 프로브를 재현 탁. 소용돌이와 BRiefly 다시 37 ° C와 소용돌이에 튜브를 가열한다. 15 ml의 캡 폴리스티렌 튜브를 나사에 프로브 솔루션을 전송하고 RNA 하이브리드 버퍼가 7-10 ml의 입력합니다. 참고 : 프로브 (10 배 더 희석 여전히 작동 할 수 있습니다) 종종 낮은 배경의 결과로하지만, 염색 반응이 또한 오래 걸릴 더 희석 될 수있다.
현장 하이브리드 3.
- -20 ° C 메탄올에 기억 된 배아를 취하여 실온으로 가온 할 수있다. 유리 병에 전체 절차를 수행합니다. 한 그룹에서 다른 배아가 다른 프로브에 의해 바라 보았다 될하려는 경우, 프로브는 첫날 변동과 노동을 줄이기 위해 추가 직전까지 하나의 유리 병에 보관하십시오.
- 프로브의 첨가에 대비하여 표 3 (워시 레시피 표 1 참조)에 설명 된대로 일련의 메탄올 배아를 재수. 조심스럽게 엠브리 소용돌이각 변경 후 운영 체제는이 측면 또는 서로 부착되지 않도록하고, nutator에 튜브를 장착하여 배아를 바위합니다. 액체를 전송하는 경우, 배아가 갇혀되지 않았는지 확인하기 위해 캡의 내부를 확인합니다.
- 표 3에 기재된 바와 같이 용액 중 프로브되면 배아를 밤새 혼성화.
- 프로브 솔루션을 제거합니다. 15 ㎖에 저장함으로써 저장 사용되는 프로브는 -20 ° C에서 날짜와 프로브가 사용 된 횟수로 표시 캡 폴리스티렌 튜브, 스크류.
주 : 비색 반응이 원하는 강도에 도달하기 위해 비정상적으로 긴 시간이 걸릴 것을 시작까지 동일한 프로브 계내 혼성화에 대한 후속 여러 번 재사용 될 수있다.- 프로브가 제거되면, 표 4에 제시된 일련의 세척을 통해 상기 프로브에 대해 항체 염색을 위해 배아를 준비한다. 온도를 변경 t를 이동하여 (표 4)를 필요에 따라직접 적절한 온도로 설정되어 하이브리드 레인지에 부착 된 배아의 병을 가진 그는 nutator.
- MAB의 적절한 음량을 확인 + HTSS + BR + 배아 항체를 첨가하기 전에 차단되도록 + HTSS + BR 차단 용액 MAB 배양되고 있음을 한번에 항 발굴 항체 (표 4) 배아. 사용의 날에 차단 솔루션은 신선한합니다.
- 항체 용액을 제거하고 항체와 하룻밤 배양 한 다음 표 5에 설명 된대로 세척을 시작합니다. 알칼리 포스 파타 아제 염색 기재를 준비하고 최대한 배경을 감소시키기 위해, 적어도 열두 30 분 세척을 수행한다. 세척 단계는 MAB 버퍼 또는 TBT 용액 (표 1)를 사용합니다.
참고 : TBT 솔루션은 2 mg의이 TTW입니다 / BSA의 ㎖를 추가했다.- BM 퍼플 알칼리 포스 파타 아제 기판과 마지막 세척 용액을 교체합니다. 염색 REAC를 수행실내 온도 37 ° C에서 하나의 기.
참고 : 염색은 37 ° C에서 더 빠른하지만 밤새 방치하면, 받아 들일 수없는 배경 염색 종종 결과 일 수있다. 염색 반응은 종종 밤새 염색을 필요로하고 실내 온도가 이것에 대한 가장 안전하다. - 또한 염색이 필요하며 BM 퍼플 솔루션은 푸른 색을 복용 한 경우 신선한 BM 보라색으로 염색 액을 교체하고 37 ° C의에 튜브를 넣어. 표적 mRNA의 매우 풍부한 경우, 밤새 4 ℃에서 염색 액에서 배아를 넣고 실온 배아를 움직이거나 37 ° C는 염색 반응을 더 잘 모니터링을 허용하도록.
- 최종 결과에 시간이 다른 대상 RNA를 사이에 상당한 차이로, 조심스럽게 새로운 반응을 모니터링합니다. 일관성을 위해, 이상 발생에 배양 발현은 새로운 사이트가없는 경우 (3.4) 염색 반응을 정지. 중요한 것은, 계내 혼성화 경우 세이로 사용되고다른 치료 그룹에서 찾고 실험, 치료 및 제어 배아 사이의 색상 반응에 대해 동일한 시간을 사용합니다.
- BM 퍼플 알칼리 포스 파타 아제 기판과 마지막 세척 용액을 교체합니다. 염색 REAC를 수행실내 온도 37 ° C에서 하나의 기.
- 염색 반응을 중지하고 표 6에 설명 된대로 액체를 변경하여 저장 및 이미지를 촬영할 수있는 배아를 준비합니다. 얼룩 제거는 배아 주변의 메탄올 보라색 색상으로 시각화 할 수 있기 때문에이 단계에서 배아를 흔들지 마십시오.
참고 :이 무거운 배경 또는 공동 얼룩을 제거하기에 충분하지 않지만 종종 배아, 염색 액의 적어도 일부가 제거 할 수 있습니다 냉 메탄올에서 밝은 파란색 염색이있다. 냉 메탄올은 -20 ° C 냉장고에 유지되는 메탄올을 의미한다.- 배아를 재수와 Mempfa (표 6)으로 얼룩을 수정합니다. 고정되면, Mempfa를 제거하고 25 % 메탄올로 배아를 씻으십시오.
- 25 %의 메탄올을 제거하고 경우 표백 용액을 추가 내인성 안료의 제거필요합니다. 화상을 입을 수 있으므로 표백 솔루션을 취급에주의하십시오. 상대적으로 빠르게 일어나고 표백의 정도가 서로 다른 효과 (그림 2)에 대한 변화 될 수 밀접하게 표백을 준수하십시오.
- 다음 표백 장기 저장을 위해 100 % 메탄올 메탄올 시리즈를 통해 탈수 배아, 또는 단기 보관 및 후속 이미징 PBS로 전송 (표 6 참조).
4. 이미징 태아
- 배아 염색 공정을 완료하면, 화상 배아 관심 유전자가 발현되는 위치에 정보는 넓은 청중 포착되도록. 해제되지 않은 배아를 볼 수 배경으로 아가로 오스 1 %를 사용합니다.
참고 : 아가로 오스는 배아 및 염색 반응의 블루 컬러와 잘 대조 파란색 / 회색 배경을 제공합니다. 또한 산만 그림자와 배아의 관심을 전환 반사를 확산하는 데 도움이됩니다.- 물에 아가로 오스 추가 아가로 오스 솔루션에 때까지 끓인다 다음 페트리 접시에 쏟아져 전에 50 식힌다. TAE 젤 솔루션과 마찬가지로, 여러 용도에 55 ° C 배양기에서 아가로 오스 솔루션을 저장합니다. 페트리 접시에 약 2 mm의 깊이로 아가로 오스를 따르십시오. 필요한 경우, 배경은 약간 다르게 그늘을 산출하기 위해 아가로 오스의 깊이를 조정합니다.
- 수용액 (PBS 또는 TTW)에 메탄올 저장에서 재수에 따라, 메탄올 시리즈를 사용하여, (표 6 참조) 아가로 오스베이스와 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 깨끗한 솔루션을 유지하고 필요한 경우, 좋은 이미지의 깨끗한 배경을 방해 할 수있는 작은 입자상 물질을 제거하는 간단한 필터링을 사용합니다.
- 이미지와 같은 복부 측면에서와 같은 다른 뷰에서 배아는, 그림 3 미세 집게를 사용하여 배아를 맞게 (방향에 대한 그 채널에서 배아를 배치 아가로 오스 얇은 채널을 잘라 주 : 대부분의 단계는 솔루션에 배치 때 가정 특성 위치를 가지고있다. 예를 들어, 포배 단계의 배아는 동물 쪽을 앉아서하는 경향이있다. 배아 신장하기 시작하면, 그들은 그들의 옆에 누워.
- 이미지에 깊이를 제공하는 배아에 그림자를 만들어, 얕은 각도에서 배아를 조명 및 표면 구조를 식별하는 데 도움이 광섬유 광원을 사용합니다. 표백 유용 랜드 마크를 제공 색소를 제거 할 수 있기 때문에 강력하게 표백 된 배아 그림자 사용합니다.
- 이러한 뇌, (그림 4)의 척색, 폐, 또는 지역에서와 같이, 깊은 배아 내에 이미지 염색에 배아를 취소합니다. 이를 위해, 100 % 메탄올까지 메탄올 일련 배아를 넣어.
- 메탄올 침지 완료 후, 용액의 한 부분과 벤질 알콜 배아를 전송하고 두 부분이있을 벤질nzoate (BABB). 초기 배아 표면에 떠 있지만 메탄올 BABB와 혼합, 그들은 BABB로 가라 앉는다. 유리 병이나 요리 BABB 다루는 모든 단계를 수행; BABB은 플라스틱이나 페인트를 녹여 것입니다.
- 일단, 클리어 배아 아래에서 오는 투과광와 배아를 볼 수 있습니다. 콘트라스트를 개선하고 최적의 색을 제공하기 위해 아래에서 광의 세기뿐만 아니라 각도를 조정한다.
- 보기 삭제 배아는 기본 떨어져 유리 페트리 접시를 제기합니다. 단순히 배아와 접시의 영역이 상승되도록을 높이기 위해 두 개의 다른 페트리 접시 뚜껑을 사용하여이 작업을 수행합니다.
주 :이 초점을 취하고베이스 이미지를 방해 할 수 현미경 받침대 결함 나 얼룩에서 산만 한 효과를 제거하는 이점을 갖는다.
5 번에서의 현장 하이브리드
- 동시에 TW의 발현 양상를 이용하기 위해서는단일 배아 상이한 유전자 O를 두 프로브, 상이한 유전자 각각에 대한 하나의 합성. 전술 한 바와 같이 라벨로서 DIG-11-UTP를 이용하여 하나의 프로브를 합성. 계내 혼성화에서 단일 사용보다 3 배 더 농축 된 프로브를 수득 RNA 혼성화 완충액 전사 반응 생성물을 희석.
- DIG는 DIG-11-UTP 대체되어야한다는 레세 -12- 표지 된 프로브를 제외 UTP와 동일한 프로토콜을 사용하여 관심있는 다른 프로브를 합성. 계내 혼성화에서 단일 사용보다 3 배 더 농축 된 프로브를 수득 RNA 혼성화 완충액 전사 반응 생성물을 희석.
- : 1의 비율로 1 개의 농축 프로브를 섞는다. 최상의 결과를 위해 현장 하이브리드 프로토콜의 하나에서 가장 강한 표현을 보여줍니다 유전자의 형광 표지 된 프로브를 사용합니다.
- 현장 하이브리드 프로토콜에서 동일하게 사용이 <현장에서 하나에 대한 설명/ EM> 혼성화, 이중 프로브를 사용한 것 이외는 보체 단일 프로브 대신에 제 하루의 끝에 (디곡시 제닌 - 표지와 형광 표지 된 프로브의 1.5 배를 함유하는 혼합물을 농축 프로브).
- 안티 DIG-AP Fab 단편 대신에 4,000 희석 : 1에서 사용 방지 형광-AP Fab 단편을 제외하고, 현장 하이브리드 프로토콜의 이중의 두 번째 날에 단일 하이브리드 프로토콜을 따르십시오. 동일계 프로토콜에서와 같이 하나의 배아로부터 과량의 항체를 씻어 BM-AP 퍼플 기판을 사용하여 제 1 색 반응을 수행.
- 제 1 색 반응 후, 0.1 M 글리신 pH를 MAB에서 5-10 분간 세척 한 다음 2.0 40 분 flourescein 항체를 비활성화. 90 분 동안 MAB + HTSS + BR의 배아를 차단합니다. 1 항 DIG 항체를 추가 MAB + HTSS + BR 2,000 희석 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.
- 다음 날 번째 배아를 씻어oroughly MAB (30 분의 12 세척)에 과량의 항체를 제거합니다.
- AP 버퍼에서 10 분 (표 1)의 배아를 세척 한 후 BCIP (AP 버퍼에서 0.5 ㎎ / ml)로 얼룩.
참고 : 현장 조합은 제 1 색 반응과 두 번째 (그림 5)에 대한 빛 푸른 색 반응 어두운 파란색 보라색 얼룩을 제공해야합니다. - AP 버퍼를 제거함으로써 최종 색 반응을 정지하고 MAB로 3 회 헹군다. 10 분 동안 Mempfa와 배아를 수정합니다. MAB 또는 TBT 5 빠른 세척과 배아를 씻으십시오.
- 그것은 BCIP 단독 색상을 제거하므로,이 색상 조합으로, 사후 염색 처리 메탄올의 사용은 더 이상 가능하지 않다. 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 함께 PBS에 고정하고 염색 후 배아 보관. 강도를 염색하는 것은 원위치에 두 번에 약이 될 수 있습니다. 이 문제라면, 4 개의 2 시간 기간의 각각을 세척을 감소시킨다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
조직 특이 적 프로브의 사용은 특정 기관에 대한 개발의 상태에 관해서 뛰어난 정보를 제공 할 수있다. 다음 예에서, 배아 단계는 Nieuwkoop 및 파버 스테이징 테이블 (11)에 기초한다. 하나는 프로브 형태 분화 후 유전자 발현, 단계 28-30에서 심장 트로포 닌 I (예를 들어,도 1C), 차별화 된 장기의 존재 또는 크기를 사용하는 경우, 어느 단계 포스트 분화에서 평가 될 수있다. 몇 년 전, embryologists 초기 배아 12, 13의 조직학의 놀라운 지식을 바탕으로 이러한 분석을 수행 할 수 있었다하지만 전문 지식은 크게 embryologists의 현재 세대에 손실되었습니다. 하지만이 전문 손실은 연구원에 사용할 특정 조직을 식별하게 보체 기법의 신뢰성 및 사용의 용이성, 유감 고려 될 수있다. 상대적으로 눈에 띄지있는 조직, t배아 단계 25 예 (그림 1A)에서 선을 부화 그는 생생하게 특정 항체 또는 조직 학적 기법 (그림 1C)를 필요로하지 않고 원위치에 사용하여 표시 할 수 있습니다. 또한, 원위치에서 전체 마운트의 사용은 하나가 아니라 조직 학적 섹션 (그림 2)에서 추론에 의존하기보다는 전체 배아의 맥락에서 전체 기관을 볼 수 있습니다. 광섬유 스토킹 (도 4)을 포함 배아 내의 깊은 조직에도 쉽게 볼 수 있고, 배아 삼투 사용 기관의 날카로운 경계 묘사를 제공 할 수있다.
배아의 표백은 크게 부족 안료 알비노 배아를 사용하기위한 요구를 없앴다 과산화수소 용액을 사용하여 내인성 안료를 제거한다. 다른 시간에 대한 표백하는 것은 유용 할 수 있습니다. 얼룩이 강한 경우에 볼 수 몇 가지 색소 침착이 유용 할 수 있습니다에 대한 예를 들어, 가벼운 표백 허용하는 모든 때문에더 나은 준비 및 배아 (그림 2A)의 방향에 대한 OWS. 얼룩 표백 용액 이상 인큐베이션 안료 완전히 제거 될 근처 예컨대 신장 (도 2B)과 같은 높은 수준의 색소 침착, 거기 영역 인 경우에는, 더 나은 결과를 제공한다.
태아 때 용액에서 특정 위치를 차지하는 경향이있다. neurulation 후, 양쪽에 평평하게 배치하는 경향이있다. 이 측면 (그림 2B)의 이미지에 잘하지만 다른 영역에 문제가 될 수 있습니다. 아가로 오스베이스의 사용은 하나가 배아의 방향을 사용할 수 있습니다 아가로 오스로 채널을 절단 할 수 있습니다. 예를 들어, 혈액 전구체 배아 (그림 2A) 및 염색의 전체 범위의 복부 측면에 관찰하기 어려운 지역화됩니다. 복부면을 위로 채널에서 배아의 위치는, 그 유전자 발현 패턴 (그림 3A)의 전체 볼 수 있습니다. 계내 혼성화 더블의 사용 형태의 작은 차이를 가질 수있다 상이한 배아 간 비교의 필요성을 제거하는 하나의 유기체 (도 5) 내에서 두 유전자 발현 패턴 사이의 관계를 표시 할 수있다. 아마도 가장 중요한 것은, 계내 혼성화의 사용은 하나에게 분명히 많은 조직에서 발현되는 그러한 pax2 같은 혈통 초기 전구 세포에서 발현되는 유전자의 발현에 기초하여 조직 학적 분화를 취소하기 전에 셀을 표시 할 수있는 기능을 제공 초기 배아, 이전에 분화 (그림 4A). 그러한 골수 세포 전구체 (도 1b)와 같은 명확 조직학에 기초하여 구별되지 조상 및 조직을 식별 할 수있는 능력은, 기관의 발전 상태에 대한 더 상세한 질문 연구자 수 있고 또한 실험의 결과를 평가하는 manipulation는 조직의 이소성 분화를 일으킬 수 있도록 설계되었습니다.
그림 1 :. 아프리카 발톱 개구리 배아에 현장 하이브리드의 전체 마운트의 예 보체 실험에서 파란색 염색은 분명히 초기 Xenopus의 배아의 구조를 개발 묘사 수 (A) 단계 26 배아의 앞쪽보기를 부화 선을 강조. uvs.2 14의 발현에 의해 경계가로 (B) 단계 28에서 마커로 (C) 초기 심장 폐장 내 myeloperoxidase (15)의 표현을 사용하여 단 20 초 골수 세포의 위치를 표시하는 배아의 복부보기.. - 30 심장 트로포 닌 I (16)의 식에 의해 가시화된다. 이 방법을 사용의 명확한 장점은 모든 것입니다이러한 유전자 발현 패턴이 다른 프로브를 사용하여 시각 만 사용되는 프로토콜은 모든 경우에 동일했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 표백 다양한 수준의 배아에서 염색을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다 (A)이 배아의 하단이 파란색 염색이의 영역입니다 단계 (36)에 대해에 복부 혈액 섬에서 헤모글로빈의 발현을 보여줍니다. 가볍게 착색되고, 따라서 배아 눈 황갈색으로 착색 안료 및 배아의 측면을 따라 볼 수있는 바와 같이 오랜 시간 동안 표백되지 않은 배아. 색소 침착을 볼 수있는 것은 배아의 무대를보다 효율적으로 시각화 할 수 있습니다. 염색은 신경계와 배아의 측면으로 큰 천연 색소를 가진 영역에있는 경우, 더 표백 B. (B)에 도시 된 바와 같이 형성 신장 여기 시츄 pax8 (17)의 표현을 볼 도움 , pronephric 덕트와 후뇌가 가장 표백 거의 모든 내인성 안료를 제거 후 보여집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 아가로 오스베이스의 조작은 배아의 방향에 도움이 될 수 있습니다 그들은 접시에 특정 위치를 차지 경향이 있기 때문에 배아의 이미징 특정 지역이 어려울 수있다 (A) 올챙이에서 옆에 놓여있는 것이다 배아를 단.. . 컷으로팅 아가로 오스의 미세 채널 (검은 색 화살표) 배아 좋은 이미지를 캡처 할 수있는 충분한 안정성, 여기 단계 (36)에서 헤모글로빈 식 게재, 복부 측면에서 볼 수 있습니다. (B) 단계에서 hand1의 발현이 복부보기 (20)는 측면 판 중배엽 (6)을 간략하게 설명합니다. 배아는 복부면을 위로하여 그 위치를 안정화 작은 구멍에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 내부 장기가 불투명 해제되지 않은 및에서 삭제 배아에서 모두 볼 수 있습니다 pax2 스테인드 해제되지 않은 배아에서 단계 34 (A), 광학 스토킹 (노란색 화살표)에서 비교적 쉽게 시각화 할 수 있습니다신경 튜브 아래로 염색 할 수있다. 그러나 세부 사항은 날카로운하지 않습니다. 광섬유 스토킹 (노란색 화살표)를 포함 배아 (B) 식 부위의 경계를 취소하여 선명하다. 청산의 범위는이 클리어 배아 양쪽 눈을 볼 수있는 능력에 의해 도시된다. 또한 일부 염색 내부 공동 (보라색 화살표), 클리어 배아를 보는 일반적인 문제에 축적 된 있습니다.
그림 5 :. Xenopus의 배아에 현장 하이브리드의 대표적인 두 측면 판 마커의 발현, hand1는 개발 혈관 내 etv2의 26 표현이 진한 파란색, 보라색 얼룩에 의해 가시화되는 단계에서 라이트 블루 염색에 의해 가시화된다. hand1의 발현은 일반적으로 매우 강렬하고 따라서는 t에 활용되었다형광 표지 된 프로브와 조합 BCIP 그 약한. 는 약한 etv2 식의 제닌 표지 프로브와 BM-보라색 조합을 이용했다.
| 이름 | 최종 농도 | 금액 / 100 ml의 |
| Mempfa | 1 mM의 황산 | 1 M 황산 100 ㎕ |
| (4 ℃에서 저장) | 2 mM의 EGTA, pH가 8.0 | 20 mM의 EGTA, pH를 10 ㎖의 8.0 |
| 0.1 M MOPS, pH가 7.5 | 1 M MOPS, pH를 10 ㎖의 7.5 | |
| 4 % 파라 포름 알데히드, pH가 7.5 | 8 % 파라 포름 알데히드, pH가 7.5을 50ml | |
| TTW | 50mM 트리스, pH가 7.4 | 1 M 트리스, pH가 7.4 5 ㎖ |
| 200 mM의 NaCl을 | 5 M NaCl을 4㎖의 | |
| 0.1 % 트윈 20 | 트윈 20 100 ㎕ | |
| 100X 덴 하르트 솔루션 | 2 % BSA | 2g BSA |
| (0.2 μm의 필터를 통해 필터링, | 2 % PVP-40 | 2g의 PVP-40 |
| -20 ° C에서 보관) | 2 % 피콜 (400) | 2g 피콜 (400) |
| 20X SSC | 3 M의 NaCl | 17.5 g의 NaCl |
| 300 mM의 인산 나트륨 구연산 | 8.8 g 인산 나트륨 구연산 | |
| RNA 하이브리드 버퍼 | 50 % 포름 아미드 | 100 %의 포름 아미드 50 ml를 |
| (4 ℃에서 저장) | 5 배 SSC | 20 배의 25 ㎖ SSC |
| 1 ㎎ / ㎖ 효모 RNA | 50 %의 포름 아미드에 용해시킨 1 ㎎ / ㎖의 효모 RNA 4ml의 | |
| 1X 덴 하르트 솔루션 | 100 배 덴 하르트 용액 1 ㎖ | |
| 0.1 % 트윈 20 | 트윈 20 100 ㎕ | |
| 5 mM의 EDTA, pH가 8.0 | 0.5 M EDTA, pH가 8.0 1 ㎖ | |
| MAB | 100 mM의 말레 산 | 말레 산 1.16 g의 |
| (4 ° C에서의 pH 7.5, 저장) | 150 mM의 NaCl을 | 염화나트륨 0.88 g |
| MAB + HTSS + BR | 100 mM의 말레 산 | MAB 96 ml의 |
| 4 % 열처리 양 세럼 | 열처리 양 세럼 4 ml의 (열이 30 분 동안 55 ° C에서 처리하고 분주) | |
| 2 % 차단 시약 | 로슈 차단 시약 2g | |
| MAB + HTSS + BR + 안티 파 항체 | 100 mM의 말레 산 | MAB 96 ml의 |
| 4 % 열 TR어갈 양 세럼 | 열처리 양 세럼 4ml의 | |
| 2 % 차단 시약 | 로슈 차단 시약 2g | |
| 1 : 10,000 안티 파-AP, 팹 조각 항체 | 안티 Digoxygenin-AP, 팹 조각 항체의 1.5 μL | |
| 알카라인 포스파타제 (AP) 버퍼 | 100 mM 트리스, 산도 9.5 | 1 M 트리스, pH를 10 ㎖의 9.5 |
| 의 50 mM의 MgCl 2 | 1 M의 MgCl 2 5 ㎖ | |
| 100 mM의 NaCl을 | 4 M NaCl을 2.5 ml의 | |
| 0.1 % 트윈 20 | 트윈 20 100 ㎕ | |
| 표백 솔루션 | 0.3 % H 2 O 2 | 30 %의 3.34 ml의 H 2 O 2 |
| 5 % 포름 아미드 | 100 % 포름 아미드 5 ml의 | |
| 0.5 % SSC | 20 배 SSC의 2.5 ml의 | |
| 지우기 솔루션 | 1/3 벤질 알코올 | 33 ml의 |
| 2/3 벤질 벤조 에이트 | 67 ml의 |
표 1 : 솔루션 조리법
| 이름 | 양 |
| 파 - NTP 믹스 | 20 MM의 CTP의 5 μL |
| (40 μL 반응) | 20 mM의 GTP의 5 μL |
| 20 mM의 ATP의 5 μL | |
| 를 20mM의 UTP의 3.25 μL | |
| 10 mM이 파-11 UTP의 3.5 μL | |
| 18.25 ㎕의 증류수, 멸균 물 | |
| 프로브 합성 | 주형 DNA의 X μL(농도에 따라 다름) |
| (20 μL 반응) | 증류수, 멸균 물 X μL |
| 파 - NTP 믹스의 4 μL | |
| 의 RNAse 억제제 0.5 μL | |
| 10X RNA 폴리머 라제 완충액 2 μL | |
| RNA 중합 효소의 2 μL |
표 2 : 프로브 합성 조리법
| 시약의 이름 | 대략적인 볼륨 | 지속 | 온도 |
| 100 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 75 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 50 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 25 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| TTW | 2 ml의 | 10 분, 요동 | 실내 온도 |
| TTW | 2 ml의 | 10 분, 요동 | 실내 온도 |
| TTW | 2 ml의 | 10 분, 요동 | 실내 온도 |
| RNA 하이브리드 버퍼 및 프로브 사전 따뜻한 65 ° C | |||
| TTW | 4 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| TTW | 4 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| RNA 하이브리드 버퍼 | 2 ml의 | 10 분, 요동 | 룸 그리고 온도전자 |
| RNA 하이브리드 버퍼 미리 예열 | 2 ml의 | 1 시간, 흔들 | 65 ° C |
| 프로브 솔루션 | 1 ml의 | 하룻밤, 흔들 | 65 ° C |
표 3 : 첫 날의 현장에서 하이브리드 프로토콜 (약 3 시간 총)에 대한 단계
| 시약의 이름 | 대략적인 볼륨 | 지속 | 온도 | ||||
| 사전 따뜻한 RNA 하이브리드 버퍼 및 37 ° ~ 65 ° C 및 2 배 SSC에 02.x SSC C | |||||||
| 반복 사용을 위해 튜브에 프로브 솔루션을 반환 | |||||||
| RNA 하이브리드 버퍼 | 2 ml의 | 10 분, 요동 | 65 ° C | 2X SSC | 2 ml의 | 20 분, 흔들 | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 ml의 | 20 분, 흔들 | 37 ° C | ||||
| 0.2X SSC | 4 ml의 | 1 시간, 흔들 | 65 ° C | ||||
| 0.2X SSC | 4 ml의 | 1 시간, 흔들 | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1.5 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 | ||||
| MAB + HTSS + BR + 안티 DIG 항체 | 1.5 ml의 | 하룻밤, 흔들 | 4 ° C |
표 4 : 두 번째 날의 현장에서 하이브리드 프로토콜 (약 4 시간 총)에 대한 단계
| 시약의 이름 | 대략적인 볼륨 | 지속 | 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| MAB | 4 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| BM 퍼플 AP 기질 | 500-750 μL | 숙박, 락 (텍스트 참조) | 실내 온도 / 37 ° C에서 (텍스트 참조) |
표 5 : 셋째 날 현장에서 하이브리드 프로토콜 (약 7 시간)에 대한 단계
| 시약의 이름 | 대략적인 볼륨 | 지속 | 온도 |
| 25 % 메탄올 | 2 ml의 5 분, 흔들 | 실내 온도 | |
| 50 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 75 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 100 % 메탄올 (감기) | 2 ml의 | 20 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 100 % 메탄올 (감기) | 2 ml의 | 다름없이 흔들 | 실내 온도 |
| 75 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 50 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 25 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| Mempfa | 2 ml의 | 30 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 25 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 25 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 25 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 표백 솔루션 | 4 ml의 | 40 분 - 3 시간, 흔들 | 실내 온도 / 37 ° C에서 (텍스트 참조) |
| 배아 저장 | |||
| 25 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 50 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 75 % 메탄올 | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 100 % 메탄올 | 4 ml의 | -20 ° C에서 | |
| 1X PBS | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 1X PBS | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
| 1X PBS | 2 ml의 | 5 분, 흔들 | 실내 온도 |
표 6 : 태아의 원위치 하이브리드, 표백 및 스토리지에서 중지하는 단계
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
특정 유전자의 발현 패턴을 시각화하는 계내 혼성화에 사용하는 능력은 제노 푸스 배아의 특정 기관 또는 세포 유형을 식별하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법에 남아있다. 이는이 기술에 의해 제공되는 몇몇 이점이다. 유전자의 발현은 해당 셀 (18)의 명확한 경계하기 전에 심장 전구 세포에서 nkx2.5 식의 사례로 잘 분화의 조직 학적 서명하기 전에 특정 구조를 식별 할 수 있습니다. 모든 시약은 손에 이동 한 후에, 또한 매우 비용 효과적이다. 효과적으로 재사용 할 수있는 많은 개별 프로브의 세대는 약간의 여분의 시간과 관심의 유전자를 인코딩 플라스미드를 취득 이외의 비용을 투자 할 수있다. 우리의 경험에 의하면, 프로브는 각각의 사용과 함께 제공되는 피할 수없는 작은 희석에도 불구하고 활동에 약간의 손실이 년 동안 재사용 할 수있다. 마지막으로, 약간의 최적화 requi가빨간색은 다른 프로브를 사용하는 경우.
프로브 합성의 품질은 프로토콜의 성공에 중요한 요소이다. 이 RNA 프로브의 품질을 확인하는 방법에는 여러 가지가 있지만 단순히 TAE 젤에 RNA 프로브를 실행하는 것은 매우 신뢰성이 빠르고 쉬운 방법입니다. 우리는 일상적으로 RNA를 염색 에티 디움 브로마이드를 사용하고는 대부분의 기관 특수 처리와 젤의 폐기해야합니다. 우리가 구체적으로 시각화 프로브들을 비교되지 않았지만 비 독성 대안이 시판되고있다. 이 TAE 젤에 DNA에 비해 다소 흐릿하게 나타날지라도 프로브는 하나의 밴드로 실행해야합니다. RNA의 양의 추정치를 얻을 수있다 : 좋은 반응이 RNA의 약 1 ㎍ / μl를해야합니다. 쉽게 시각화 밴드는 RNA의 적어도 0.5 μg의를 대표하고 밝은 밴드는 1 μg의 이상 나타냅니다. 분명히 완전히 정확하고 경험을 필요로하지 않지만 젤 랩이에, 정량을 기반으로ID와 현장 절차의 견고성은 잘 작동 할 수 있습니다. 반복성에 대한 우려가있는 경우, 하나의 우리는 쉽게 발견되지 않았지만이 주요 관심사로, 전사 반응의 소량을 정량 UV 흡광도를 사용할 수있다. 마지막으로, 젤 템플릿 DNA가 제거 된 경우 하나를 볼 수 있습니다. 젤에는 RNA가 없다는 것을 나타내는 경우, 두 개의 가장 가능성이 설명은 나쁜 DNA 템플릿 또는 전사 버퍼는 잘 작동하지 않은 것. 전사 37 ° C에 버퍼와 완전히 혼합 사용하기 전에, 또는 전사 반응에 신선한 100 mM의 DTT의 1 μL를 첨가 난방 가끔 후자에 도움이 될 수 있습니다. 전사 반응 완충액의 중요한 구성 요소는 스퍼 미딘이며 중요한 버퍼 온난화을 저온에서 DNA 템플릿을 석출 할 수있다. 버퍼 DTT 또한 반응을 현저하게 저해 석출 할 수있다. 침전물 버퍼에서 볼 경우, 용액을 따뜻하게소용돌이 적극적으로. RNAse가 그러한 활성을 방지하기 위해, 고압 증기 멸균 또는 DEPC 팁과 관으로 물을 처리하는 등의 임의의 특이 사항을 촬영할 필요가 없다. 상업용 리보 뉴 클레아 제 억제제의 존재는 환경으로부터 RNAses 대해 상당한 보호를 제공한다. 다른 라벨 UTP가 우리의 경험하지만, 실제 레세으로 사용될 수는 없으므로, 디곡 시게 닌 - 표지 된 UTP 및 항 - 디곡시 제닌 항체의 조합은 가장 일관된 결과를 제공한다.
프로브 생성을위한 초기 프로토콜은 합성 된 프로브의 알칼리 가수 분해 프로브는 큰 침투를 허용하기 위해 (4)을 수행 할 것을 제안한다. 프로브의 가수 분해는 보체 프로세스에 도움이 나타나지 않는다; 보다 큰 500 BP의 RNA 프로브는 일반적으로 우수한 신호 길이 이상 2킬로바이트도 잘 작동됩니다 프로브를 제공합니다. 대상 RNA가 풍부한 경우 짧은 프로브가 작동 할 수 있지만 더 이상 프로브는 B를 제공합니다에터 염색. 이상 프로브를 나누는 알칼리 소화를 사용하여 뚜렷한 장점이있는 것은 아니다.
배아의 초기 처리에 관심이 매우 중요합니다. 수정 봉투의 제거는 신경 배 폐쇄 및 이전에 수정 봉투 중 자연 부화 후 배아에 특히 도움이된다. 시비 봉투 안에 태아의 신장 동안, 배아가 말려된다, 그 위치에 고정 된 경우, 배아는 현장 하이브리드의 후 이미지 어렵습니다. 배아는 고정하기 전에 수정 봉투에서 제거하는 경우에는, 그들은 신속하게 똑 바르게. 배아 막 제거하는 동안 손상되는 경우, 손상된 조직은 상처 부위에서 보체 신호 거짓 초래할 수 있으므로이를 정착 전에 상처를 치유 할 수있다. 작은 경우, 상처는 종종 19 분 이내에 매우 빠르게 치유. 또한 배아 뒤 손상 될 수 있습니다 나중에 단계솔루션을 변경할 때 링 액체 전사 때문에주의가 필요하다. 초기 단계의 손상은 일반적으로 배아가 심하게 절차의 종료에 의해 손상되고 손상된 영역은 손상의 광경에 현장 신호 거짓의 원인이된다는 것을 의미합니다. 또한, 최대 30 배아 그러나이 보상 할 수 하룻밤 3 일 또는 세척에 세척을 증가 비색 반응 중에 개발 높은 배경의 큰 기회가 하나의 유리 병에하지만 더 배아로 탐색 할 수 있습니다.
이 프로토콜에서, 단계들의 수가 감소되었고 몇몇 일반적으로 사용되는 시약의 사용이 배제되어왔다. 이 프로토콜은 단백질 분해 효소 K의 소화와 양전하 그룹을 차단하는 무수 초산의 사용을 포함하여 많은 다른 프로토콜에 사용되는 여러 단계를 제거합니다. 포유류와 조류 배아에서하지만 아프리카 발톱 개구리를 사용하여 볼 때 그 단계는 아직 그 단계를 제거하여 오 거의 영향을 미치지, 유용 할 수있다N 현장 하이브리드에서의 최종 결과. 이 같은 단순화가 다른 종에 대한 현장 하이브리드 프로토콜에 적용 할 수 있는지 여부를 우리 연구소는 결정되지 않았습니다. 특히 테 K 소화는 여전히 프로브 침투 큰 제한이있을 수 있습니다 병아리 나 마우스와 같은 다른 배아에 요구 될 수있다.
BM 보라색 기판의 사용은 편리하고 신뢰할 수 있습니다. 그러나, 배아 표적 RNA 지역화해야 석출 컬러 알칼리 기판 가능한 다른 옵션이 존재한다. 특히, NBT / BCIP의 조합은 일반적으로 4를 사용하고 잘 작동된다. 일부 색상 시약이 경우, 염색 후 메탄올의 사용이 스테인을 제거하며 피해야을 메탄올에 용해된다. 원위치에서 더블을 수행 할 때, 다른 색 조합도 사용될 수있다. 유사한 조합 (BM 퍼플보다 오히려 NBT / BCIP)의 사용은 또한 도시 된마우스 배아 (20)를 사용할 때 매우 견고합니다. 염색의 푸른 색과 배아의 내인성 안료는 명확하게 사진에 구별하기가 어렵 있습니다. 알비노 배아의 사용은 또한 안료를 제거하지만 표백 용액을 거의 유효하고 번식 알비노 성인의 유지 보수가 필요하지 않기 때문에 훨씬 더 편리하다. 염색이 비교적 약한 경우, 강한 표백은 염색을 강조 할 수있다. 염색이 강한 경우 일부 빛 안료를 떠나 효과적인 대비하고 또한 배향과 배아를 준비에 도움이 될 수 있습니다.
RNA 프로브 밤새 혼성화 후, 프로토콜은 보체 로봇의 용도에 여기에 설명 엄격 매뉴얼 프로토콜에서 발산 할 수있다. 로봇이 밤을 통해 작품으로 현장 하이브리드 로봇에서의 사용은 일일 감소 될 수있다 둘째 날과 수동 프로토콜의 셋째 날 거의 하루 종일을 절약d는 적절한 온도 변화를 모두 만들 수 있습니다. 로봇은 또한 그것의 결과에 매우 일관성과 동시에 효율적으로 많은 샘플 프로빙 수 있습니다. 즉 프로브의 재사용 및 시약의 작은 볼륨의 사용을 허용 그것은 손으로 첫날을 수행하는 것이 유리 남아있다. 로봇을 사용하는 유일한 중요한 단점은 악기의 초기 비용이다.
이 프로토콜은 현장 하이브리드의 방법에 효과적으로 이미지의 일부를 설명합니다. 이것은 이미지가 나쁘면 정보 너무 많이 손실 될 수있는 것이 중요하다. 많은 경우에서, 실험의 결과를 인 시츄 촬상 초기 실험과 동일한 시간을 필요로한다. 표백 정도로서 절차 변수 중 일부 요소는 개인적인 취향의 요소를 가지고있다. 다른 이미징 효과는 컬러베이스에 접시를 배치함으로써 달성 될 수있다. 종종 한천에 약간의 푸른 그늘 앉아에서의 깊고 푸른 염색을 강조 할 수 있습니다U 하이브리드. 간단하게 원하는 효과를 얻기 위해 파란색 플라스틱의 장을 통해 한천이 포함 된 배양 접시를 넣어.
그러나, 여기에 설명 된 방법은 영상의 가능성을 탐구하는과 기초를 제공한다. (그들은 일반 조명 조건에서 나타나는 볼) 배아를 볼 하나를 지울 수 있습니다 또는 해제되지 않은 (더 잘 볼 내부 구조에 투명하게). 이미지에 배아 표현의 사이트에 의존하는 방법에 관해서 결정의 일부. 발현 또는 배아의 표면 근방 인 경우, 삭제하지 않고 화상 배아 것이 최상이다. 해제되지 않은 배아를 사용하는 몇 가지 장점이있다. 배아를 제거하는 과정은 여러 단계와 배아를 취소하는 데 사용되는 화학 물질이 취급하기 어려운이 필요합니다. 또한, 배아의 여러 공동 거짓 공동 염색이 발생할 수 있습니다 알칼리성 인산 기판의 침전을 할 수 있습니다. 초기 배아와 pharyn의 특히, blastocoelgeal 공동 자주 염색 (그림 4)를 보여줍니다. 이 거짓 얼룩이 지워지지 않습니다 배아에 표시되지 않습니다. 대부분의 경우, 심지어 적당히 깊은 발현은 심장, 신장, 및 somites 같은 중배엽 조직 및 갑상선 간 등을 포함한 내배엽 철골 구조, 해제되지 않은 배아에서 가시화 될 수있다. 볼 PBS의 수화물 또는 저장을위한 100 %에 넣고 메탄올 중 하나에 메탄올 시리즈를 통해 배아를 이동하면 저장 및 이미징의 여러 라운드 수 있습니다. 메탄올 저장 한 연장 시간이 지남에 따라 영상에 다른 수정을 시도 할 수 있습니다.
유전자 발현을보고 동일계 하이브리드 화 기법에서를 사용하는 몇 가지 단점이있다. 배아 표현과 표현 영역 크기의 변화에 총 변경 내 비교는 일반적으로 분명하지만 표현의 수준은 엄격하게 정량화 할 수 없습니다. 다른 RNA 기반 기술들과 같이,이 t와 같은 임의의 정보를 제공하지 않는다결과 해석을 제한 할 목적 유전자에 의해 코딩되는 단백질 O. 마지막으로, 실제 발현 도메인에 비해 백그라운드 염색가 무엇인지를 결정하기가 어렵다. 특히 널리 알려져 있지 않은 발현 유전자 패턴에 문제가있다. 종종, 동일한 유전자의 센스 가닥으로부터 발생 프로브 비특이적 염색을위한 대조군으로 사용된다. 센스 가닥 조절 시약의 사용과 관련된 몇 가지 문제에 대한 정보를 제공 할 수 있지만, 안티센스 프로브에 기초하여 염색하는 완전히 정확하다는 결정적인 증거를 제공하지 않는다. 여러 배아가 사용될 때 시츄 결과는 일반적으로 현저 배아 일관성 있고 이는 염색 패턴에 대한 신뢰 계수로서 사용될 수있다. 또한, 유전자의 다른 부분, 특히 비 번역 영역에서 생성 된 다른 안티센스 프로브는, 동일한 염색 패턴을 부여하는지 사용될 수있다. 그들이 그렇게 할 경우,이 동일한 경우 그것은 또한 관찰 염색 패턴에 대한 신뢰를 제공합니다. 희석 프로브도 동일한 염색 패턴이 출현하는지 염색 액에 장시간 노출로 사용될 수있다. 일반적으로 염색 패턴에 대한 자신감을 고취 한 가지 요인은 패턴이 특정 배아 구조에 해당하는지 여부입니다. 원위치에 충분한 이제 새로운 발현 패턴이 비교적 드문 이벤트에 가능성이 유전자의 큰 다양성으로 수행되었다. 동일계에서의 큰 이미지 데이터베이스는 이미지 결과를 비교하는데 사용될 수있는 다른 생물 확립되었다. 아프리카 발톱 개구리 배아, Xenbase는 (www.xenbase.org) 발현 양상을 이해하는 데 사용될 수 리소스의 좋은 예이다. 다른 모델 생물은 이미지의 비슷한 광범위한 데이터베이스를 가지고있다.
이러한 잠재적주의 사항에도 불구하고, 현장에서 하이브리드는 매우 유용 강력하고 신뢰할 수있는 도구를 유지기관 형성의 연구. 그것은 세포 유형을 식별하고 당분간 유전자 발현의 변화 영역을 조사하기위한 선택의 방법을 유지하기 쉽다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
