Protocol
1.胚の準備
- 胚培養、pH8.0の固定前8に2.5％のシステインを使用して、デゼリー胚の一部として日常的に行われていない場合。それは絶対に必要ではありませんが、手動で微鉗子を用いて固定前に受精エンベロープを削除するには、それが便利です。
- 胚を転送するためにガラスパスツールピペットを使用してください。ピペットはそう胚をピックアップするのに十分な幅の点でガラスピペットをカットするダイヤモンドペンを使って胚を転送するのに十分な幅ではありません。シャープなエッジを溶融するために迅速にブンゼンバーナーの炎を通してカットチップを渡すことで、切断した後、ピペットのシャープなエッジを排除します。
注：ガラスはまだそれが目視で冷却されているように見えても火傷を引き起こすのに十分熱くなっていることなどの注意が必要がある。
- 胚を転送するためにガラスパスツールピペットを使用してください。ピペットはそう胚をピックアップするのに十分な幅の点でガラスピペットをカットするダイヤモンドペンを使って胚を転送するのに十分な幅ではありません。シャープなエッジを溶融するために迅速にブンゼンバーナーの炎を通してカットチップを渡すことで、切断した後、ピペットのシャープなエッジを排除します。
- 段階的に胚の固定を実行します。まず、胚固定で使用するためのガラスバイアルを準備します。最終含むすべてのステップのためにこれらのバイアルを使用してくださいストレージ。プロセスのすべてのステップの間、胚を監視するためにできるように、ふたに優れたテフロンシール付きクリアされているバイアルを使用してください。恒久的なマーカーを使用して、適切な実験情報とバイアルにラベルを付け、その後にも恒久的なマーカーによるアルコールおよび他の溶媒の使用手順の過程で失われてしまうように、明確なテープでラベルをカバーしています。
- 胚を修正するMempfaを使用してください。一度に50〜100ミリリットルのバッチで8％パラホルムアルデヒドの株式を行います。溶液中にホルムアルデヒドを得るために必要とされる50〜60℃に必要なH 2 Oと熱の約75％を使用してください。
注：このソリューションは、それがホルムアルデヒドではなく、パラホルムアルデヒドを利用していることにMemfa古い公開されたプロトコルのバージョンで使用されるよりも若干異なります。 - 10N NaOHを2〜3滴を追加したり、pHが約7.5（使用pH試験紙pHをチェックする）である。パラホルムアルデヒドは毒性が非常に強いので、ヒュームフード内原液を生成する。パラ一度ホルムアルデヒドは、新鮮な容器の中にワットマン紙を通して溶液を濾過し、最終体積にH 2 Oを追加し、溶液中にある。必要に応じて、1〜2週間、4℃でパラホルムアルデヒド溶液を保存する。
- Mempfaの固定液（ 表1）の残りのコンポーネントを組み立てます。パラホルムアルデヒドの最終的な作業濃度は4％であることを確認してください。ストックとして4℃で固定液のすべてのコンポーネントを格納します。
- カットガラスピペットを用いて、Mempfa溶液（ 表1）の約3~4 mlの満たされた標識されたガラスバイアルに胚を追加することによって、胚を固定する。バイアルあたり以上の20〜30の胚を固定しないでください。胚培地から液体転送を最小限に抑えて胚を追加します。室温で2時間または4℃で一晩のためにMempfa溶液中の胚を固定してください。
- 後半内胚葉構造については、手動で孤立した腸および内胚葉デリバティブ9,10に原位置で行う、プローブの良好な浸透を可能にし、また空洞染色を回避する。
- -20℃で100％メタノールの溶液を保管してください。パラホルムアルデヒド固定した後、約4ミリリットル-20℃で、胚を保存するための100％メタノールとMempfa液を交換する。
- ガラスまたは他の胚に付着胚を防止するためにメタノールを添加した後、バイアルを旋回させる。また、緩い場合、メタノールは時間をかけて冷凍庫で蒸発することができるので、バイアルを密封していることを確認してください。
注：胚のin situハイブリダイゼーションの品質を損なうことなく、染色の前にメタノール中で、おそらく長い少なくとも1年間保管することができる。
- 胚を修正するMempfaを使用してください。一度に50〜100ミリリットルのバッチで8％パラホルムアルデヒドの株式を行います。溶液中にホルムアルデヒドを得るために必要とされる50〜60℃に必要なH 2 Oと熱の約75％を使用してください。
2.プローブの準備
- ジゴキシゲニン標識プローブを作るために鋳型DNAの1〜2μgのを使用してください。股関節のための適当な制限酵素で目的の遺伝子の5 '末端に適当なDNA配列を含むプラスミドをカットアンチセンスプローブを生成するためにトンベクター。
注：このプラスミドは、適切なRNAポリメラーゼ結合部位（ 例えば、T7、T3、またはSP6）を有するべきである。 - DNA、水、NTPミックスおよびポリメラーゼ緩衝液がプローブ合成反応を組み立てる前に室温に温める。 表2に記載されている順序での1.5mlマイクロ遠心チューブにRNA合成反応の成分を加える。水の量を調節することは、20μlのプローブ合成反応の全量を添加した。ポリメラーゼ緩衝液の成分が高濃度と寒いとき、テンプレートDNAを沈殿させることができるので、室温で反応を組み立てる。
- 37℃で2時間転写反応をインキュベートする。
注：2時間よりも少し長いのインキュベーションは悪影響なしにつながるだけでなく、少し収量の増加を示している。 1時間インキュベートした場合、収率は減少したが、良好なプローブを作ることが依然として十分であろう。- 仕上げに転写反応を待っている間、プローブの品質をテストするために使用されるアガロースゲルを作る。 1×TAE緩衝液100ml中のアガロースを1μgを溶融沸点まで溶液を加熱することにより（ 表1参照）。アガロース粉末が完全に溶解したときに熱からソリューションを削除します。
- アガロースは、紫外線（UV）光下でRNAの可視化を可能にするために約60℃に冷却したときに、約100mlのアガロースゲルを2μlのエチジウムブロミドストック溶液（10mg / ml）を加える。
注：将来のゲルを繰り返し溶融することなく注ぐことができるように、このアガロースゲル溶液を60℃のインキュベーター中に保持することができる。潜在的な毒性によるエチジウムブロマイドの取り扱いに注意してください。
- テンプレートDNAを除去するために37℃でさらに10分間、2時間のインキュベーション後に転写反応に1μlのDNアーゼI（RNアーゼフリーグレード）を添加し、インキュベートする。
- に反応ミックス1μlのを削除TEバッファー（10 mMトリスpH8.0,1mMのEDTA）、5M NH 4アセテート10μlの、そして220μlの1％SDSの80μlを添加する1％アガロースTAEゲルで、残り（20μL）に確認してください冷エタノールの。ボルテックスで激しく混合し、RNAの品質チェックの結果が判明するまで氷上に取っておく。
- 1％アガロースTAEゲル上での析出する前に除去RNAの1μlのを実行します。ゲル上にロードを容易にするために、RNAへの水の4-5μLと標準ローディング色素の1μlを添加する。 （説明を参照してください）、プローブの品質をチェックするために、UV光トランスイルミを用いてゲル上でRNAを表示します。
- 10から15分間フルスピードで微量紡糸してステップ2.5で氷の上に放置した残りのRNAを沈殿さ。引き出されたガラスピペットで上清を描画し、簡単に乾燥させます。
- エッペンドルフチューブ中のRNAハイブリダイゼーション緩衝液1ml（ 表1）を用いてプローブを再懸濁する。ボルテックスとBRiefly再び37℃、ボルテックスにチューブを加熱する。 15mlをキャップポリスチレンスクリュー管にプローブ溶液を移し、RNAハイブリダイゼーション緩衝液7-10 mlに満たす。注：プローブは、多くの場合、低バックグラウンドで結果が、染色反応にも時間がかかります（10倍、さらに希釈がまだ働くことができる）をさらに希釈することができる。
in situハイブリダイゼーション 3.
- -20℃のメタノール中で保存した胚を取り、室温に温める。ガラスバイアルに全体の手順を実行します。 1グループとは異なる胚が異なるプローブによって見しようとしている場合は、プローブは初日にばらつきや労力を軽減するために追加される直前まで単一バイアルに保管してください。
- 表3に概説されるように、プローブの添加のための調製において（洗浄レシピについては表1を参照）のメタノール一連の胚を再水和する。静かにエンブリーを旋回各変更後のOSは、彼らが側面またはお互いに付着していないことを確認し、旋回装置にバイアルを装着することにより胚を岩に。液体を転送する場合、胚がそこに閉じ込められていないことを確実にするためにキャップの内部を確認してください。
- 表3に記載したように、一度プローブ溶液で、一晩胚をハイブリダイズする。
- プローブ溶液を除去します。 15mlに格納することによって使用されるプローブを保存は-20℃での日付とプローブが使用された回数でマークキャップポリスチレンチューブを、スクリュー。
NOTE：比色反応は、所望の強度を達成するために異常に長い時間がかかり始めるまで同じプローブはin situハイブリダイゼーション 、その後のために何度も再利用することができる。- プローブが除去されると、 表4に概説する一連の洗浄を通してプローブに対する抗体染色のための胚を準備する。トンを移動させることである（ 表4）必要に応じて温度を変更する彼旋回装置、直接適切な温度に設定されているハイブリダイゼーションオーブンに、添付の胚のバイアルと。
- 抗体の前に添加することによってブロックされるように、胚は、ブロッキング溶液MAB + HTSS + BR中でインキュベートされた時点でMAB + HTSS + BR +抗DIG抗体（ 表4）の適切なボリュームを構成する胚。利用当日の阻止ソリューションは新鮮なことを確認します。
- 抗体溶液を除去し、抗体と一晩インキュベーションし下記の表5に概説されるように洗浄をし始める。アルカリホスファターゼ基質を染色するための準備を可能な限りバックグラウンドを低減するために、少なくとも12の30分間の洗浄を行う。 MABバッファまたは洗浄ステップのためのTBT溶液（ 表1）のいずれかを使用してください。
NOTE：TBT溶液はBSAの2ミリグラム/ミリリットルを加えたことTTWある。- BMパープルアルカリホスファターゼ基質との最後の洗浄溶液を交換してください。染色REACを実行します室温または37℃のいずれかでる。
注：染色は、37℃で、より迅速であるが、一晩放置した場合、許容できないバックグラウンド染色は、多くの場合の結果であり得る。染色反応は、多くの場合、一晩染色し、室温がこのための最も安全である必要があります。 - さらに染色が必要であるとBM紫色の溶液が青色に取っている場合は、新鮮なBMパープルに染色液を交換し、37℃Cにチューブを入れる。標的mRNAが非常に豊富である場合は、4℃で一晩染色溶液中で胚を配置し、染色反応をより良くモニタリングを可能にするために、室温または37℃に胚を移動する。
- 最終結果までの時間が異なる標的RNAとの間でかなり変化するように、慎重に新しい反応を監視します。一貫性を保つため、より長いインキュベーションで生じる表現の新たなサイトが存在しない場合（3.4を参照）染色反応を停止します。重要なことは、in situハイブリダイゼーションした場合は、アッセイとして使用されている異なる治療群見実験のため、治療群と対照胚との間の呈色反応のために同じ時間を使用する。
- BMパープルアルカリホスファターゼ基質との最後の洗浄溶液を交換してください。染色REACを実行します室温または37℃のいずれかでる。
- 染色反応を停止し、 表6に概説されているような液体を変更することで、ストレージと画像記録のための胚を準備する。汚れの除去は、胚の周りのメタノールの紫色の着色として可視化することができるので、この段階での胚を揺するしないでください。
注：これは重いバックグラウンドまたは空洞染色を除去するのに十分ではないが、多くの場合、胚は、染色溶液及び少なくとも部分的にそれを削除することができ、冷メタノールからの光ブルー染色を持つ。冷メタノールで-20°Cの冷凍庫内に維持されるメタノールを指す。- 胚を再水和とMempfa（ 表6）で汚れを固定します。固定後、Mempfaを除去し、25％メタノールで胚を洗浄する。
- 25％のメタノールを除去し、内因性顔料の除去場合に漂白液を追加必要とされている。それは火傷の原因となりますので漂白液の取り扱いに注意してください。それは比較的迅速に発生し、漂白の程度は異なる効果（ 図2）のために変化させることができるように密接に漂白を観察します。
- （ 表6参照）漂白以下の長期保存のために100％メタノールをメタノール一連の胚を脱水、または短期記憶およびその後のイメージングのためにPBSに移す。
4.イメージング胚
- 胚は、染色処理を完了すると、画像は、胚、目的の遺伝子が発現される場所に関する情報がより多くの人のために捕捉されるようになっている。未確認の胚を表示するには、背景としてアガロース1％を使用してください。
注：アガロースが胚および染色反応の青色とよく対照的でブルー/グレーの背景を提供します。また、胚から注意をそらす気が散る影や反射を拡散させるのに役立ちます。- 水にアガロース追加し、アガロースが溶液中になるまで沸騰させると、その後ペトリ皿に注ぐ前に50に冷ます。 TAEゲル溶液と同様に、複数の用途のために55℃のインキュベーター中でアガロース溶液を保存する。シャーレに約2ミリメートルの深さまでアガロースを注ぐ。必要に応じて、バックグラウンドの若干異なる色合いを得るためにアガロースの深さを調整。
- 水溶液（PBSまたはTTW）に、メタノール中のストレージから再水和した後、メタノール系を用いて、（ 表6参照）アガロースベースとペトリ皿に胚を置く。きれいなソリューションを保持し、必要であれば、良好な画像のきれいな背景が中断する可能性が小さな粒子状物質を除去するために単純なフィルタリングを使用しています。
- 画像にそのような腹側からのような代替ビューから胚は、 図3の細かい鉗子を使用して胚にフィットし、（オリエンテーションのためにこれらのチャネルに胚を配置するためにアガロースに薄いチャンネルをカット注：ほとんどのステージは、溶液中に置かれたとき、彼らが前提と特徴位置を持っている。例えば、胞胚段階の胚は動物の側を上に座ってする傾向がある。胚が細長くし始めたら、彼らは彼らの側に横たわっていた。
- 画像に奥行きを与え、表面構造を見分ける助け胚に影を作る、浅い角度から胚を照明するための光ファイバ光源を用いる。漂白は便利なランドマークを提供顔料を、排除することができますので、強く漂白胚についてシャドーイングを使用します。
- そのような脳、（ 図4）の脊索、肺、または地域のように、深い胚内にある画像の染色に胚をクリアします。これを達成するために、100％メタノール中になるまでメタノールを一連の胚を置く。
- メタノールにおける完全浸漬した後、一部のベンジルアルコールの溶液に胚を転送する2つの部分のベンジルであるnzoate（BABB）。胚は、最初に表面に浮くが、メタノールがBABBと混合するように、彼らはBABBに沈んでしまう。ガラスバイアルまたは皿でBABBを扱うすべてのステップを実行します。 BABBは任意のプラスチックや塗料を溶かすします。
- 一度クリアされ、透過光が胚の下から来るとの胚を表示します。コントラストを改善し、最良の色を提供するために、下から光の強度ならびに角度を調整する。
- クリア胚を表示しているときにベースのオフガラスシャーレを上げる。単に胚と皿の領域が上昇しているように、それを高めるために他の二つのペトリ皿の蓋を使用して行います。
注：これは、焦点が外れベースを取得し、画像を妨害し得る顕微鏡ベース上の欠陥や汚れから邪魔影響を排除するという利点を有する。
in situハイブリダイゼーション 5.ダブル
- 同時にTWの発現パターンを表示するには単一胚における異なる遺伝子oを、二つのプローブ、異なる遺伝子のそれぞれについて1つの合成。上記のように標識としてDIG-11-UTPを用いて一つのプローブを合成する。 in situハイブリダイゼーションの単一のために使用されるよりも3倍以上濃縮されたプローブを生成するためにRNAのハイブリダイゼーション緩衝液中で転写反応の生成物を希釈する。
- DIGはDIG-11-UTPの代わりにする必要があり、そのフルオレセイン-12-UTPを除いてプローブ標識されたと同じプロトコルを使用して、関心のある他のプローブを合成。 in situハイブリダイゼーションの単一のために使用されるよりも3倍以上濃縮されたプローブを生成するためにRNAのハイブリダイゼーション緩衝液中で転写反応の生成物を希釈する。
- 1：1の比率で2濃プローブを混ぜる。最良の結果を得るには、in situハイブリダイゼーションプロトコルでのシングル最強発現を示す遺伝子のためのフルオレセイン標識プローブを使用しています。
- in situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて同じを使用の<インサイチュで単について記載in situハイブリダイゼーションプローブ、 単一の代わりに最初の日の終わりに、二重プローブ（ジゴキシゲニン標識およびフルオレセイン標識プローブの1.5倍濃縮された混合物を含有するプローブ）を使用して除く/ em>のハイブリダイゼーション、。
- 抗DIG-AP Fab断片の代わりに4000希釈、1：抗フルオレセイン-AP Fab断片を使用して除いて、in situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて二重の二日目に単一のハイブリダイゼーションプロトコールに従う。 インサイチュプロトコルにおける単一のように胚から過剰な抗体を洗い流し、BMパープルAP基質を用いて第一の色反応を行う。
- 最初の呈色反応に続いて、MABで5~10分間の洗浄、続いて40分間、0.1 MグリシンpHを2.0にフルオレセイン抗体を不活性化する。 90分間MAB + HTSS + BRで胚をブロックします。 1での抗DIG抗体を追加します。MAB + HTSS + BR 2,000希釈し、4℃で一晩インキュベートする。
- 次の日、胚目を洗うoroughly MAB（30分の12回の洗浄）の過剰な抗体を除去する。
- APバッファー（ 表1）に10分間の胚を洗浄した後BCIP（APバッファでは0.5mg / ml）で染色する。
注： 現場の組み合わせの最初の色反応および第二（ 図5）のためのライトブルー色反応のための濃い青紫色の染みを与える必要があります。 - APバッファーを除去することによって、最終的な呈色反応を停止させ、MABで三回すすぐ。 10分間Mempfaとの胚を固定してください。 MABまたはTBTで5クイック回の洗浄で胚を洗浄する。
- それはBCIP色だけを排除するように、この色の組み合わせでは、ポスト染色治療中のメタノールの使用は、もはや不可能である。 0.02％のアジ化ナトリウムを含むPBS中で染色し、固定後胚を保管してください。強度の染色は、 原位置で二重に弱いことができます。これが問題である場合、4つの2時間の持続時間の各洗浄を減らす。
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Representative Results
組織特異的プローブの使用は、特定の臓器の開発の状態に関してで優れた情報を提供することができる。以下の例では、胚のステージはNieuwkoopとフェーバーステージング表11に基づいています。 1プローブを使用している場合、私は例（ 図1C）のために、段階28-30で、 心筋トロポニンの分化後に発現する遺伝子を形成し、差別化器官の存在又は大きさはどの段階ポスト分化で評価することができる。数年前、胎生学者は、初期胚12,13の組織学の顕著な知識に基づいて、このような分析を行うことができましたが、その専門知識は、主に胎生の現在の世代のために失われています。なお、この専門知識の損失は任意の研究者が利用可能な特定の組織の識別を行い、in situハイブリダイゼーション技術の信頼性および使用の容易さ、残念と考えることができる。比較的目立たない組織トン彼例えば胚ステージ25（ 図1A）で腺を孵化、鮮やかに特異的な抗体または組織学的技術（ 図1C）を必要とせずに原位置で使用してマークすることができます。また、 原位置でのホールマウントを使用することは1つがむしろ組織切片（ 図2）からの推論に頼るよりも、全胚のコンテキストで臓器全体を表示することができます。眼茎（ 図4）を含む、胚内の深いであっても組織は簡単に見ることができ、胚クリアの使用は、臓器の境界のシャープな描写を提供することができます。
胚の漂白は、主に顔料を欠くアルビノ胚を使用する必要性を排除して過酸化水素溶液を使用して、内因性色素を除去する。異なる時間漂白すると便利です。汚れが強い場合は、見られるように、いくつかの色素沈着を可能にし軽い漂白はそれのためのすべての便利です胚（ 図2A）のより良いステージングとオリエンテーションのためのOWS。汚れが漂白液中でより長いインキュベーションによる顔料の完全な排除に近いような腎臓（ 図2B）などの色素沈着高レベルの、ある領域である場合は、より良い結果を与える。
胚は、時、溶液中の特定のポジションを取る傾向がある。神経胚形成の後、彼らは彼らの側に平らにする傾向があります。これは脇腹（ 図2B）の画像のための罰金ですが、他の領域に問題があることができます。アガロース塩基の使用は1つが胚を方向付けるために使用することができ、アガロースにチャンネルをカットすることができます。例えば、血液前駆体は、胚（ 図2A）の腹側に局在化され、染色の全範囲を観察することは困難である。腹側を上にしてチャンネル内の胚の位置決めは、その遺伝子発現パターン（ 図3A）の完全な閲覧が可能になります。 in situハイブリダイゼーション二重の使用は、形態学的に小さな違いがある場合があり、異なる胚の間で比較することの必要性を排除する単一の生物（ 図5）内の2つの遺伝子発現パターンとの関係を示すことができる。おそらく最も重要なことは、in situハイブリダイゼーションを使用することは一つを明確にそのように多くの組織で発現されるPAX2等の系統の初期の前駆細胞において発現される遺伝子の発現に基づいて、組織学的分化をクリアする前に細胞をマークする機能を提供初期胚、分化前に（ 図4A）。明らかにそのような骨髄細胞前駆体として組織学、（ 図1B）に基づいて区別されていない前駆細胞および組織を同定する能力は、研究者が臓器の開発の状態について、より詳細な質問をすると、実験の結果を評価することができましたManipulationは、組織の異所性分化を引き起こすために設計されています。
図1： アフリカツメガエル胚でのin situハイブリダイゼーション全体のマウントの例として in situハイブリダイゼーション実験でからブルー染色は明らかに初期のアフリカツメガエル胚の構造を開発して描くことができます（A）ステージ26胚の前面図を孵化腺を強調。 uvs.2 14の発現によって区切らように（B）ステージ28にマーカーとして（C）早期の心をミエロ 15の表現を使用して、ステージ20で初期の骨髄細胞の位置を示す胚の腹側ビュー。。 - 30は、心臓トロポニンI 16の発現によって可視化される。この方法を使用することの明らかな利点は、すべての点であるこれらの遺伝子発現パターンが異なるプローブを用いて可視化が、使用されるプロトコルは、すべての場合において同一であるた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：漂白、異なるレベルの胚における染色を視覚化するために使用することができる（A）この胚の底部に沿ってこの青い染色は、これの領域であるステージ36付近で腹側血島中のヘモグロビンの発現を示す。軽く着色され、従って胚眼の胚の脇腹に沿って褐色顔料から分かるように、長い間、漂白されなかった胚。色素沈着を見ることができることは、胚の段階のより良い可視化を可能にする。染色は、神経系の胚の側面としての自然な色素沈着、を有する領域内にある場合、より大きな漂白B.（B）に示すように形成腎臓ここでその場で pax8 17の表現を表示するのに役立ちます漂白は、ほとんどすべての内因性の顔料を削除した後に、前腎管と後脳が最高の可視化される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：アガロースベースの操作は、胚の向きを支援することができ 、彼らは皿の中の特定の位置を取る傾向があるので、胚のイメージング特定の領域が困難な場合があります（A）オタマジャクシにおいてその側に位置することになる胚ステージ。。 。カットすることによりティン胚がここで良いイメージをキャプチャするのに十分な安定性と、ステージ36で、 ヘモグロビン発現を示す、腹側から見ることができるアガロース（黒矢印）に微細なチャネル。（B）の段階でHAND1式のこの腹側ビュー図20は、側板中胚葉6の概要を説明します。胚は、腹側を上にして、その位置を安定化し、小さな穴に配置されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：内部器官は、不透明な未確認とクリア胚における両方で表示することができ 、ステージ34（A）にPAX2について染色未確認胚では、視神経の茎（黄色の矢印）は比較的容易に可視化することができる。神経管ダウン染色できますように。しかし、詳細はシャープではありません。眼茎（黄色の矢印）を含む胚（B）発現部位の境界を、クリアすることでよりシャープである。クリアリングの程度は、このクリア胚で両目を見る能力で示されている。また、クリア胚を表示するときに、いくつかの染色は、内部の空洞（紫矢印）に共通の問題を蓄積してきたことに注意してください。
図5： アフリカツメガエル胚におけるin situハイブリダイゼーションの代表二重側板のマーカーの発現は、HAND1、現像血管系内etv2 26.発現は濃い青紫色に染色によって可視化された段階で、光ブルー染色により可視化される。 HAND1の発現は、通常、非常に強烈であり、従って、それはトンのために利用したフルオレセイン標識プローブとBCIPを組み合わせ、彼は弱い。弱いetv2発現用のジゴキシゲニン標識プローブとBM-紫の組み合わせを利用した。
| 名前 | 最終濃度 | 量/ 100mlで |
| Mempfa | 1mMのMgSO 4を | 1 M MgSO 4を100μlの |
| （4℃で保存） | 2 mMのEGTA、pH8.0の | 20mMのEGTA、pH8.0の10mlの |
| 0.1 M MOPS、pH7.5で | 1 M MOPS、pH7.5の10mlの | |
| 4％パラホルムアルデヒド、pH7.5の | 8％パラホルムアルデヒド、pH7.5の50mlの | |
| TTW | 50mMトリス、pH7.4中 | 1Mトリス、pH7.4を5mlの |
| 200mMのNaCl | 5 M NaClを4mlの | |
| 0.1％のTween 20 | トゥイーン20100μlの | |
| 100Xデンハルト溶液 | 2％BSA | 2gのBSA |
| （0.2μmのフィルターで濾過し、 | 2％PVP-40 | 2gのPVP-40 |
| -20℃で保存） | 2％フィコール400 | 2グラムフィコール400 |
| 20X SSC | 3 MのNaCl | 17.5グラムのNaCl |
| 300 mMのクエン酸三ナトリウム | 8.8グラムクエン酸三ナトリウム | |
| RNAハイブリダイゼーションバッファー | 50％ホルムアミド | 100％ホルムアミド50mlの |
| （4℃で保存） | 5×SSC | 20X SSCの25ミリリットル |
| 1mg / mlの酵母RNA | 50％ホルムアミドに溶解を1mg / mlの酵母RNAを4ml | |
| 1Xデンハルト溶液 | 100Xデンハルト溶液の1ミリリットル | |
| 0.1％のTween 20 | トゥイーン20100μlの | |
| 5 mMのEDTA、pH8.0で | 0.5 M EDTA、pH8.0の1mlの | |
| MAB | 100 mMのマレイン酸 | マレイン酸1.16グラム |
| （pHは7.5、4℃で保存） | 150mMのNaCl | NaClを0.88グラム |
| MAB + HTSS + BR | 100 mMのマレイン酸 | MAB 96mlの |
| 4％の熱処理したヒツジ血清 | 加熱処理されたヒツジ血清4mlを（熱を30分間55℃で処理し、等分） | |
| 2％ブロッキング試薬 | ロシュブロッキング試薬の2グラム | |
| MAB + HTSS + BR +抗DIG抗体 | 100 mMのマレイン酸 | MAB 96mlの |
| 4％ヒートTrがeatedヒツジ血清 | 熱処理したヒツジ血清の4ミリリットル | |
| 2％ブロッキング試薬 | ロシュブロッキング試薬の2グラム | |
| 1：10,000抗DIG-AP、Fab断片抗体 | アンチジゴキシゲニンAP、Fab断片抗体の1.5μL | |
| アルカリホスファターゼ（AP）バッファ | 100 mMトリス、pHは9.5 | 1Mトリス、pHが9.5の10ミリリットル |
| 50mMのMgCl 2を | 1 MのMgCl 2の5ミリリットル | |
| を100mMのNaCl | 4 MのNaClの2.5ミリリットル | |
| 0.1％のTween 20 | トゥイーン20100μlの | |
| 漂白液 | 0.3％H 2 O 2 | 30％H 2 O 2を3.34ミリリットル |
| 5％のホルムアミド | 100％ホルムアミド5mlの | |
| 0.5％SSC | 20X SSCの2.5ミリリットル | |
| クリアソリューション | 1/3ベンジルアルコール | 33ミリリットル |
| 2/3安息香酸ベンジル | 67ミリリットル |
表1：ソリューションのレシピ
| 名前 | 額 |
| DIG-NTPミックス | 20 mMのCTPの5μL |
| （40μlの反応） | 20 mMのGTPの5μL |
| 20 mMのATPの5μL | |
| の20mM UTPの3.25μL | |
| 10mMの掘る-11-UTPの3.5μL | |
| 18.25μlの蒸留、オートクレーブ処理水 | |
| プローブ合成 | 鋳型DNAのXμlを（濃度に依存） |
| （20μlの反応） | 蒸留、オートクレーブ処理水のXμL |
| 掘る-NTPミックス4μlの | |
| RNase阻害剤0.5μlの | |
| 10X RNAポリメラーゼ緩衝液2μl | |
| RNAポリメラーゼ2μlの |
表2：プローブ合成レシピ
| 試薬の名前 | おおよその巻 | デュレーション | 温度 |
| 100％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 75％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 50％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 25％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| TTW | 2ミリリットル | 10分間、ロッキング | 室温 |
| TTW | 2ミリリットル | 10分間、ロッキング | 室温 |
| TTW | 2ミリリットル | 10分間、ロッキング | 室温 |
| 65℃に前加温RNAハイブリダイゼーション緩衝液およびプローブ | |||
| TTW | 4ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| TTW | 4ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| RNAハイブリダイゼーションバッファー | 2ミリリットル | 10分間、ロッキング | ルームTemperatur電子 |
| 予め温めておいたRNAハイブリダイゼーションバッファー | 2ミリリットル | 1時間、ロッキング | 65°C |
| プローブソリューション | 1ミリリットル | 一晩、ロッキング | 65°C |
表3：初日のin situハイブリダイゼーションプロトコル（約3時間の合計）の手順
| 試薬の名前 | おおよその巻 | デュレーション | 温度 | ||||
| プリ暖かいRNAハイブリダイゼーションバッファー、37℃〜65℃、2×SSCに02.x SSC | |||||||
| 繰り返し使用するためにチューブにプローブ溶液を返す | |||||||
| RNAハイブリダイゼーションバッファー | 2ミリリットル | 10分間、ロッキング | 65°C | 2X SSC | 2ミリリットル | 20分間、ロッキング | 37°C |
| 2X SSC | 2ミリリットル | 20分間、ロッキング | 37°C | ||||
| 0.2×SSC | 4ミリリットル | 1時間、ロッキング | 65°C | ||||
| 0.2×SSC | 4ミリリットル | 1時間、ロッキング | 65°C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1.5ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 | ||||
| MAB + HTSS + BR +抗DIG抗体 | 1.5ミリリットル | 一晩、ロッキング | 4°C |
表4：二日目のin situハイブリダイゼーションプロトコル（約4時間の合計）の手順
| 試薬の名前 | おおよその巻 | デュレーション | 温度 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| MAB | 4ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| BMパープルAP基質 | 500〜750μL | 一晩、ロッキング（本文参照） | 室温/ 37℃（本文参照） |
表5：三日目のin situハイブリダイゼーションプロトコル（約7時間）の手順
| 試薬の名前 | おおよその巻 | デュレーション | 温度 |
| 25％メタノール | 2ミリリットル 5分間、ロッキング | 室温 | |
| 50％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 75％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 100％メタノール（コールド） | 2ミリリットル | 20分間、ロッキング | 室温 |
| 100％メタノール（コールド） | 2ミリリットル | 不定、ないロッキング | 室温 |
| 75％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 50％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 25％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| Mempfa | 2ミリリットル | 30分間、ロッキング | 室温 |
| 25％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 25％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 25％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 漂白液 | 4ミリリットル | 40分-3時間、ロッキング | 室温/ 37℃（本文参照） |
| 胚の保存 | |||
| 25％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 50％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 75％メタノール | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 100％メタノール | 4ミリリットル | -20°Cで保存 | |
| 1X PBS | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 1X PBS | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
| 1X PBS | 2ミリリットル | 5分間、ロッキング | 室温 |
表6：胚のin situハイブリダイゼーション 、漂白およびストレージに停止する手順
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Discussion
特定の遺伝子の発現パターンを可視化するために、in situハイブリダイゼーションを使用する能力は、 アフリカツメガエル胚の特定の器官または細胞型を同定するための最も一般的に使用される方法のままである。これは、この技術によって提供されるいくつかの利点がある。遺伝子の発現は、これらのセル18のいずれかの明確な境界の前に心臓前駆細胞におけるNkx2.5の発現のためのケースとしてだけでなく、分化のいずれかの組織学的な記号の前に特定の構造を識別することができます。すべての試薬が手に入ると、それはまた、非常にコスト効果的である。効果的に再利用することができる多くの個々のプローブの生成は、目的の遺伝子をコードするプラスミドを得た以外は少し余分な時間とコスト投資が可能である。我々の経験では、プローブは、それぞれの使用が付属して避けられない小さな希釈液にもかかわらず、活動の少ない損失で年に再利用することができる。最後に、少し最適化requiががあります別のプローブを利用する際に赤。
プローブ合成の品質は、プロトコルの成功に重要な要因である。そこにRNAプローブの品質をチェックするための多くの方法がありますが、単純にTAEゲルでRNAプローブを実行すると、非常に信頼性があり、迅速かつ容易な方法である。私たちは日常的に、RNAを染色するエチジウムブロマイドを使用し、それはほとんどの機関によるゲルの特別な取り扱いや処分が必要です。我々は、具体的なプローブを可視化するためのものと比較していないが、非毒性の代替案は、市販されている。それはTAEゲル上のDNAと比較して、ややあいまい表示されますが、プローブは、単一のバンドとして実行する必要があります。 RNAの量の推定値を得ることができる：良い反応は、RNAの約1μg/μLを持つことになります。容易に可視化バンドは、RNAの少なくとも0.5μgのを表します、明るいバンドが1μgの上で表します。明らかに完全に正確といくつかの経験を必要としないが、ゲルに基づく定量化は、RAPであるidとその場で手続き中の堅牢性は、それがうまく動作することができます。再現性についての懸念がある場合、我々は、これが主要な関心事であることがわかっていないが、人は簡単に、転写反応の小さな量を定量化するためにUV吸光度を使用することができる。最後に、ゲルは、鋳型DNAが除去された場合に一方が見ることを可能にする。ゲルにはRNAがないことを示す場合、2つの有力な説明は悪いDNA鋳型であるか、または転写バッファーは十分に機能していないこと。使用前に37℃で完全に混合する転写バッファーを加熱、または転写反応に新鮮な100mMのDTTの1μlに加え、時折、後者を支援することができます。転写反応緩衝液の重要な構成要素は、スペルミジンであり、それは重要なバッファの加温を行う低温でDNA鋳型を沈殿させることができる。バッファ内のDTTは、反応を阻害大幅に沈殿させることができます。沈殿物がバッファに見られている場合は、ソリューションを温めると渦精力的に。そのようなRNアーゼ活性を防止するために、DEPCまたはオートクレーブチップチューブに水を処理するなど異常な予防措置をとるための必要はありません。商業リボヌクレアーゼ阻害剤の存在は、環境からのRNアーゼに対してかなりの保護を提供します。我々の経験では、ジゴキシゲニン標識UTPおよび抗ジゴキシゲニン抗体の組み合わせが最も一貫した結果を提供するが、フルオレセインのような、他のUTP標識を用いることができる。
プローブ生成のための初期のプロトコルは、合成されたプローブのアルカリ性加水分解はより大きなプローブの浸透を可能にするために、4を行うべきであることを示唆している。プローブの加水分解は、in situハイブリダイゼーション工程において役立つようには見えない。 500を超えるBPのRNAプローブは、通常、長さは2キロバイトでもうまく動作よりも長く、優れた信号およびプローブを与える。標的RNAが豊富であれば、より短いプローブが動作することができますが、より長いプローブは、Bを与えるEtterの染色。長いプローブを分割するアルカリ性の消化を使用して明確な利点があるように表示されません。
胚の初期の取り扱いには十分注意することは非常に重要です。受精エンベロープの除去は、神経倍閉鎖前受精エンベロープのうち、自然孵化の後に胚のために特に便利です。受精エンベロープ内部の胚の伸長時には、胚はカールになり、その位置に固定した場合、胚は、in situハイブリダイゼーション後の画像に困難です。胚を固定する前に、受精膜から除去される場合は、それらは急速にまっすぐ。胚は、膜除去中に損傷している場合は、損傷を受けた組織は、創傷部位でのin situハイブリダイゼーションシグナルの偽になることができるので、それらを固定する前に、傷を癒すことができます。小さ な場合は、傷がしばしば分19以内に、非常に急速に治癒する。その後の手順はまた、胚デュを損傷する可能性がソリューションを変更する際にリング液体移送ので注意が必要です。初期段階でのダメージは通常、胚がひどく手順の終了によって損傷され、損傷領域が損傷を見て、その場信号で偽の原因となることを意味します。さらに、最大30胚は単一バイアルでプローブすることができるが、より多くの胚で比色反応の間に発展高いバックグラウンドの大きな可能性がある、しかし3日目または洗浄一晩での洗浄を増加させると、これを補うことができます。
このプロトコルでは、工程数が削減された、いくつかの一般的に使用される試薬の使用は排除されている。このプロトコルは、正に荷電した基をブロックするために無水酢酸のプロテイナーゼK消化および使用を含む多くの他のプロトコルで使用されているいくつかのステップを排除することに注意してください。哺乳類と鳥類の胚ではなく、 アフリカツメガエルを使用して見たときにそれらのステップは、まだそれらのステップを除外することが、Oはほとんど影響を与え、有用である可能性があるnはin situハイブリダイゼーションの最終的な結果。我々の研究室では、これらの同じ単純化は、他の種のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにも適用することができるか否かを判定していない。特にプロテイナーゼK消化は依然として、プローブの浸透が大きく制限を有することができるニワトリまたはマウスのような他の胚で必要とされ得る。
BMパープル基板の使用は、便利で信頼性がある。しかし、胚中の標的RNAをローカライズするために必要とされる沈殿、カラーアルカリ性基板に使用可能な他の多くのオプションがある。具体的には、NBT / BCIPの組み合わせは、一般的に4を使用し、うまく機能している。いくつかの色試薬は、染色した後、メタノールの使用は、汚れを排除する、避けなければならない場合には、メタノール中に可溶性である。 原位置での二重を行う際に他の色の組合せを使用することもできる。同様の組み合わせ（NBT / BCIPよりむしろBMパープル）の使用も示されているマウス胚20を使用する際に、非常に堅牢である。染色の青色及び胚の内因性顔料は、はっきりとした画像で区別することがしばしば困難である。アルビノ胚の使用はまた、顔料を排除しますが、漂白液は、ほぼ同じくらい効果的であり、それは繁殖のためにアルビノの大人のメンテナンスを必要としないようにはるかに便利です。染色が比較的弱い場合には、強力な漂白はその染色を強調することができます。染色が強い場合、いくつかの光色素のままにしておくと効果的なコントラストであること、また、胚を配向とステージングを支援することができます。
RNAプローブで一晩ハイブリダイゼーション後、プロトコルは、in situハイブリダイゼーションロボットの使用にここで概説厳密にマニュアルプロトコルから分岐することができます。ロボットが夜を徹して働くようにin situハイブリダイゼーションロボットでの使用は1日に減らすことができる二日目とマニュアルプロトコルの日三ほぼ丸一日が保存されますdは、適切な温度変化のすべてを行うことができる。ロボットはまた、その結果に非常に一致しており、同時効率的に多くのサンプルのプロービングが可能になります。それは、プローブの再利用及び試薬のより少量の使用を可能にするように、手で初日行うことが有利で残る。ロボットを使用することの唯一の重大な欠点は、機器の初期コストである。
このプロトコルは、in situハイブリダイゼーション効率的に画像ANにいくつかの方法について説明します。なお、画像が悪い場合に失われることができるので、情報の多くを行うことが重要である。多くの場合、実験のその場での結果の画像化は、最初の実験と同じ時間を必要とする。そのような漂白の程度として手続き変数のいくつかの要素は、個人の好みの要素を持っている。他の撮像効果は、着色ベースに皿を置くことによって達成することができる。多くの場合、寒天にわずかに青い色合いが座り込み中の深いブルー染色を強調することができますUハイブリダイゼーション。単純に望ましい効果を得るために青いプラスチックのシートの上に寒天を含むペトリ皿を置く。
しかし、ここで概説された方法は、画像化の可能性を探索するのに基礎を提供する。胚は（彼らは通常の照明条件の下に表示として表示）のいずれか見てクリア（より良いビュー内部構造への透明化）または未確認することができます。イメージに胚が発現部位に依存している方法に関しての判断の一部。式は胚の表面上またはその近くにある場合は、それはクリアせずに、胚の画像に最適です。未確認の胚を使用することにはいくつかの利点がある。胚をクリアするプロセスは、多くのステップと胚をクリアするために使用される化学物質は、取り扱いが困難である必要があります。また、胚のいくつかの空洞は偽空洞染色をもたらすことができるアルカリホスファターゼ基質の沈殿を可能にする。具体的には、初期胚の胞胚腔とpharyngeal空洞は、多くの場合、染色（ 図4）を示す。この偽の染色はクリアされない胚では表示されません。ほとんどの部分についても、適度に深い発現は、心臓、腎臓、および体節中胚葉組織、甲状腺および肝臓などの内胚葉stuctures含む、未確認胚で可視化することができる。保存のために閲覧したり、100％メタノールに入れ、PBS中の水和物のいずれかにメタノールシリーズを通して胚を移動すると、ストレージおよびイメージングの複数のラウンドを可能にします。メタノール貯蔵は1つが長時間にわたってイメージングに異なる変更を試みることができます。
遺伝子発現を見るために、in situハイブリダイゼーション技術を使用することにはいくつかの欠点がある。胚内で比較し、発現ドメインサイズにおける発現の変化で総変化は、通常は明白ですが、表現のレベルは厳密に定量化ではありません。他のRNAベースの技術と同様に、トンなどの任意の情報を提供しない結果の解釈を制限することができ、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質、oを最後に、真の発現ドメインと比較してバックグラウンド染色が何であるかを決定することは、しばしば困難である。これは特に広く普及することができ、未知の発現パターンと遺伝子の問題です。多くの場合、同じ遺伝子のセンス鎖から生成されたプローブは、非特異的な染色のための対照として使用する。センス鎖コントロールを使用すると、試薬と問題に関するいくつかの情報を提供することができますが、それはアンチセンスプローブに基づいて、染色が完全に正確であることの決定的な証拠を提供していません。複数の胚を使用する場合、その場での結果は、著しく通常胚全体で一貫性があり、これは、染色パターンの信頼度の尺度として使用することができる。また、遺伝子の異なる部分、特に非翻訳領域から生成された異なるアンチセンスプローブは、それらは同一の染色パターンを与えるかどうかを確認するために使用することができる。彼らがそうする場合、それが同じであれば、それはまた、観察された染色パターンの信頼性を提供します。希釈されたプローブは、同じ染色パターンが現れるかどうかを確認するために染色溶液への長時間暴露で使用することができる。通常染色パターンに自信を鼓舞一つの要因は、そのパターンが特定胚の構造に対応するかどうかである。 原位置での十分な次に新規の発現パターンは、比較的まれな事象の可能性がある遺伝子の多種多様に行われている。 その場で画像内の大規模なデータベースは、画像の結果を比較するために使用され得る種々の生物のために確立されている。 アフリカツメガエル胚の場合は、Xenbase（www.xenbase.org）が発現パターンを理解するために使用できるリソースの優れた例である。他のモデル生物はまた、画像の類似した、大規模なデータベースがある。
これらの潜在的な注意事項にもかかわらず、in situハイブリダイゼーションのために極めて有用である、強力で信頼性の高いツールのまま器官形成の研究。これは、細胞型を同定し、当面の遺伝子発現ドメインの変化を調べるための選択方法で残る可能性が高い。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
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