Protocol
1. Préparation d'embryons
- Si pas fait régulièrement dans le cadre de la culture de l'embryon, de-gelée les embryons en utilisant 2,5% cystéine, pH 8,0 avant la fixation 8. Même se il ne est pas absolument nécessaire, il est utile de puis supprimer manuellement l'enveloppe de fertilisation avant la fixation à l'aide de pinces fines.
- Utilisez pipettes Pasteur en verre pour transférer les embryons. La pipette ne est pas assez large pour transférer les embryons afin d'utiliser un stylo de diamant pour couper la pipette en verre à un point assez large pour ramasser un embryon. Éliminer les bords tranchants des pipettes après la coupe en passant rapidement la pointe de coupe à travers la flamme d'un brûleur Bunsen pour faire fondre les bords tranchants.
NOTE: Des précautions doivent être prises, que le verre peut encore être assez chaud pour causer des brûlures, même si elle semble avoir refroidi par inspection visuelle.
- Utilisez pipettes Pasteur en verre pour transférer les embryons. La pipette ne est pas assez large pour transférer les embryons afin d'utiliser un stylo de diamant pour couper la pipette en verre à un point assez large pour ramasser un embryon. Éliminer les bords tranchants des pipettes après la coupe en passant rapidement la pointe de coupe à travers la flamme d'un brûleur Bunsen pour faire fondre les bords tranchants.
- Effectuer la fixation de l'embryon par étapes. Tout d'abord, préparer des flacons en verre pour une utilisation dans l'embryon fixation. Utilisez ces flacons pour toutes les étapes, y compris finalele stockage. Utilisez des flacons qui sont claires avec un bon joint en téflon dans le couvercle, permettant de surveiller les embryons durant toutes les étapes du processus. Étiqueter les flacons avec des informations expérimental approprié en utilisant un marqueur permanent, puis couvrir l'étiquette de ruban adhésif transparent, comme marqueur même permanente sera perdu au cours de la procédure en raison de l'utilisation d'alcools et d'autres solvants.
- Utilisez Mempfa de fixer les embryons. Faites un stock de 8% de paraformaldehyde dans des lots de 50 à 100 ml à la fois. Utiliser environ 75% de la H 2 O requis et de la chaleur à 50-60 ° C, qui est nécessaire pour obtenir le paraformaldéhyde en solution.
NOTE: Cette solution est légèrement différente de la Memfa utilisé dans les anciennes versions de protocole publié en ce qu'il utilise paraformaldéhyde plutôt que le formaldéhyde. - Ajouter 2-3 gouttes de NaOH 10N ou jusqu'à ce que le pH est d'environ 7,5 (l'utilisation du papier pH pour vérifier pH). Paraformaldéhyde est très toxique, donc générer la solution mère dans une hotte. Une fois que le parale formaldéhyde est en solution, filtrer la solution à travers un papier Whatman dans un récipient frais et ajouter de H 2 O au volume final. Si nécessaire, stocker la solution de paraformaldehyde à 4 ° C pendant 1-2 semaines.
- Assembler les composants restants de la solution de fixation Mempfa (tableau 1). Assurez-vous que la concentration de travail finale de paraformaldéhyde est de 4%. Conservez tous les composants de la solution de fixation à 4 ° C que les stocks.
- En utilisant une pipette en verre taillé, fixer les embryons en ajoutant les embryons aux flacons en verre marquées qui ont été remplis avec les environ 3-4 ml de solution Mempfa (tableau 1). Évitez de fixer plus de 20 à 30 embryons par flacon. Ajouter les embryons avec un minimum de transfert de liquide à partir du milieu de l'embryon. Fixer embryons en solution Mempfa pendant 2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Pour les structures de l'endoderme effectuer la fin de situs sur isolées manuellement intestinale et endoderme dérivés 9,10, Ce qui permet une bonne pénétration de la sonde et évite aussi cavité coloration.
- Stocker une solution de 100% méthanol à -20 ° C. Après la fixation de paraformaldehyde, remplacer la solution Mempfa avec environ 4 ml de -20 ° C, 100% de méthanol pour le stockage des embryons.
- Agiter le flacon après l'addition du methanol pour empêcher les embryons de coller au verre ou à d'autres embryons. Aussi, assurez-vous que les flacons sont hermétiquement fermés parce que le méthanol peut se évaporer dans le congélateur le temps si lâche.
REMARQUE: Les embryons peut être stocké pendant au moins un an, et plus probablement, dans le methanol avant la coloration, sans perte de la qualité de l'hybridation in situ.
- Utilisez Mempfa de fixer les embryons. Faites un stock de 8% de paraformaldehyde dans des lots de 50 à 100 ml à la fois. Utiliser environ 75% de la H 2 O requis et de la chaleur à 50-60 ° C, qui est nécessaire pour obtenir le paraformaldéhyde en solution.
2. Préparation de la sonde
- Utilisation 1-2 ug d'ADN matrice pour rendre les sondes marquées à la digoxigénine. Couper le plasmide contenant la séquence d'ADN appropriée à l'extrémité 5 'du gène d'intérêt avec une enzyme de restriction appropriée pour that vecteur pour générer des sondes antisens.
NOTE: Le plasmide devrait avoir un site de liaison d'ARN polymerase approprié (par exemple T7, T3 ou SP6). - Permettre à l'ADN, de l'eau, mélanger et NTP tampon de polymerase se réchauffer à température ambiante avant l'assemblage de la réaction de synthèse de la sonde. Ajouter les composants de la réaction de synthèse d'ARN dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml dans l'ordre indiqué dans le Tableau 2. Ajuster le volume de l'eau ajoutée pour amener le volume total de la réaction de synthèse de la sonde de 20 ul. Monter la réaction à la température ambiante car les composants du tampon de polymerase peuvent précipiter l'ADN de matrice lorsque des concentrations élevées et froid.
- Incuber la réaction de transcription pendant 2 heures à 37 ° C.
REMARQUE: Les incubations d'un peu plus de deux heures conduit à aucun effet indésirable, mais aussi montrent peu de rendement accru. Si incubé pendant une heure, le rendement sera réduit mais toujours suffisant pour faire une bonne sonde.- Dans l'attente de la réaction de transcription à la fin, faire un gel d'agarose qui sera utilisé pour tester la qualité de la sonde. Faire fondre 1 pg d'agarose dans 100 ml de tampon TAE 1X (voir tableau 1) en chauffant la solution au point d'ébullition. Retirer la solution de la chaleur lorsque la poudre d'agarose est complètement dissous.
- Ajouter 2 ul de bromure d'éthidium solution de réserve (10 mg / ml) à environ 100 ml de gel d'agarose où l'agarose a refroidi à environ 60 ° C pour permettre la visualisation de l'ARN sous rayonnement ultraviolet (UV).
NOTE: Cette solution de gel d'agarose peut être conservé dans un incubateur à 60 °, de sorte que les gels futurs peuvent être versés sans fusion répétée. Prenez soin de manipuler le bromure d'éthidium en raison de la toxicité potentielle.
- Ajouter 1 pi ADNase I (RNAse à niveau libre) à la réaction de transcription après l'incubation de 2 heures et incuber pendant 10 minutes supplémentaires à 37 ° C pour éliminer la matrice d'ADN.
- Retirer 1 ul du mélange réactionnel devérifier sur le gel d'agarose-TAE à 1% et le reste (20 ul) ajouter 80 ul de SDS à 1% dans du tampon TE (10 mM Tris pH 8,0, EDTA 1 mM), 10 pi de 5 M d'acétate de NH 4 et 220 ul de l'éthanol froid. Vortex vigoureusement le mélange et mettre de côté sur la glace jusqu'à ce que les résultats de la vérification de la qualité de l'ARN sont connus.
- Exécutez les 1 ul d'ARN retirés avant la précipitation sur le gel d'agarose-TAE 1%. Pour faciliter le chargement sur le gel, ajouter 5.4 ul d'eau et 1 pl de colorant de charge standard pour l'ARN. Voir l'ARN sur le gel en utilisant un transilluminateur lumière UV afin de vérifier la qualité de la sonde (voir la discussion).
- Précipiter l'ARN restant qui a été mis de côté sur la glace à l'étape 2.5 en faisant tourner dans une microcentrifugeuse à pleine vitesse pendant 10 à 15 min. Prélever le surnageant avec une pipette en verre étiré et laisser sécher brièvement.
- Remettre en suspension le sonde avec 1 ml de tampon d'hybridation d'ARN (tableau 1) dans le tube Eppendorf. Vortex et briefly chauffer de nouveau le tube à 37 ° C et vortex. Transférer la solution de sonde à un 15 ml vis tube en polystyrène de bouchon et remplir 7-10 ml avec un tampon d'hybridation d'ARN. Remarque: La sonde peut être diluée (à 10 fois dilution supplémentaire peut encore fonctionner) ce qui entraîne souvent faible bruit de fond mais les réactions de coloration seront également prendre plus de temps.
3. hybridation in situ
- Prendre les embryons qui ont été stockées à -20 ° C dans du méthanol et on laisse réchauffer à température ambiante. Effectuez toute la procédure dans les flacons de verre. Si les embryons différents d'un groupe vont être regardé par différentes sondes, gardez-les dans un seul flacon juste avant les sondes sont ajoutés pour réduire la variabilité et du travail le premier jour.
- Réhydrater les embryons à travers une série de méthanol comme indiqué dans le tableau 3 (voir le tableau 1 pour les recettes de lavage) en préparation pour l'addition de la sonde. Agitez doucement le embryos après chaque changement pour se assurer qu'ils ne sont pas collées sur les côtés ou l'autre, et le rock les embryons en montant les flacons sur une nutator. Lors du transfert des liquides, vérifier l'intérieur des bouchons pour assurer que les embryons ne ont pas été piégée.
- Une fois dans la solution de la sonde, les embryons se hybrider pendant une nuit comme décrit dans le tableau 3.
- Retirer la solution de la sonde. Enregistrer la sonde utilisée par le stockage dans un 15 ml vis tube en polystyrène de bouchon, marqué avec la date et le nombre de fois que la sonde a été utilisé, à -20 ° C.
REMARQUE: La même sonde peut être réutilisé plusieurs fois pour la suite des hybridations in situ jusqu'à ce que les réactions colorimétriques commencent à prendre un temps anormalement long pour atteindre l'intensité désirée.- Une fois la sonde est enlevée, préparer les embryons pour la coloration des anticorps contre la sonde à travers la série de lavages décrites dans le tableau 4. Changer la température selon les besoins (tableau 4) en déplaçant til nutator, avec des flacons d'embryons attachés, directement dans les fours d'hybridation qui sont mis à la température appropriée.
- Compléter le volume approprié de la MAB + HTSS + BR + anticorps anti-DIG (tableau 4) au moment où les embryons sont incubés dans le MAB + HTSS + BR solution de blocage de telle sorte que l'anticorps est bloqué avant d'ajouter à la embryons. Faire les solutions de blocage frais sur la journée d'utilisation.
- Retirer la solution d'anticorps et de commencer lavages comme indiqué dans le tableau 5 qui suit une nuit d'incubation avec l'anticorps. Effectuer au moins douze lavages 30 min afin de préparer pour la coloration avec le substrat de la phosphatase alcaline et réduire l'arrière-plan le plus possible. Utilisez soit MAB tampon ou une solution OTC (tableau 1) pour les étapes de lavage.
REMARQUE: solution de TBT est TTW qui a 2 mg / ml de BSA ajouté.- Remplacer la dernière solution de lavage avec le substrat Violet de phosphatase alcaline BM. Effectuez les réac de colorationtion, soit à température ambiante ou à 37 ° C.
NOTE: La coloration est plus rapide à 37 ° C, mais si on les laisse pendant la nuit, fond inacceptable coloration peut souvent être le résultat. Les réactions de coloration souvent exigent coloration pendant la nuit et la température ambiante est plus sûr pour cela. - Si de plus amples coloration est nécessaire et la solution de pourpre BM prend une couleur bleue, remplacer la solution de coloration avec des produits frais BM Violet et mettre les tubes dans 37 ° C. Si l'ARNm cible est très abondante, mettre les embryons dans la solution de coloration à 4 ° C pendant une nuit, puis déplacer les embryons à température ambiante ou à 37 ° C pour permettre un meilleur contrôle de la réaction de coloration.
- Surveiller les nouvelles réactions attentivement, car le temps de résultat final varie considérablement entre les différents ARN cibles. Par souci de cohérence, arrêter la réaction de coloration (voir 3.4) quand il n'y a pas de nouveaux sites d'expression résultant d'incubation plus longue. Surtout, si l'hybridation in situ est utilisée comme un testpour des expériences qui cherchent à différents groupes de traitement, utiliser en même temps pour les réactions de couleur entre traitement et de contrôle des embryons.
- Remplacer la dernière solution de lavage avec le substrat Violet de phosphatase alcaline BM. Effectuez les réac de colorationtion, soit à température ambiante ou à 37 ° C.
- Arrêter la réaction de coloration et de préparer les embryons pour le stockage et l'enregistrement de l'image en changeant les liquides comme indiqué dans le tableau 6. Ne pas secouer les embryons à ce stade car la suppression de la tache peut être visualisé comme coloration pourpre du méthanol autour des embryons.
NOTE: Souvent embryons ont une coloration bleu clair de la solution de coloration et le méthanol froid peut éliminer au moins partiellement que, bien que ce ne est pas suffisante pour éliminer fond lourde ou de la cavité coloration. Methanol froid se réfère à du methanol qui est maintenu dans un congélateur à -20 ° C.- Réhydrater les embryons et fixer la tache avec Mempfa (tableau 6). Une fois fixé, retirez le Mempfa et laver les embryons avec 25% de méthanol.
- Enlever le 25% de methanol et ajouter la solution de blanchiment si la suppression de pigment endogèneest requis. Prenez soin dans le traitement de la solution de blanchiment car il peut causer des brûlures. Observer le blanchiment de près comme cela se produit relativement rapidement et le degré de blanchiment peut être modifiée pour des effets différents (figure 2).
- Déshydrater embryons à travers une série de méthanol à 100% de méthanol pour le stockage à long terme après blanchiment, ou à transférer à PBS pour le stockage à court terme et ensuite imagerie (voir tableau 6).
4. imagerie embryons
- Une fois un embryon a terminé le processus de coloration, l'image de l'embryon afin que les informations sur l'endroit où le gène d'intérêt est exprimé est capturé pour un public plus large. Utilisez 1% agarose comme un fond pour voir embryons non dégagées.
NOTE: L'agarose donne un fond bleu / gris qui contraste bien avec l'embryon et la couleur bleue de la réaction de coloration. Il contribue également à diffuser les ombres et les réflexions qui détournent l'attention de l'embryon de distraction.- Ajouter agarose à l'eau, puis porter à ébullition jusqu'à ce que l'agarose est en solution, puis laisser refroidir à 50 avant de verser dans la boîte de Pétri. Comme avec la solution de gel TAE, stocker la solution d'agarose à 55 ° C incubateur pour des usages multiples. Verser de l'agarose à une profondeur d'environ 2 mm dans la boîte de Pétri. Si nécessaire, ajuster la profondeur d'agarose pour donner une teinte légèrement différente du fond.
- À la suite de la réhydratation de stockage dans du methanol à une solution aqueuse (PBS ou TTW), en utilisant une série de methanol, placer les embryons dans une boîte de Pétri avec la base d'agarose (voir tableau 6). Conserver la solution propre et si nécessaire, utiliser un simple filtrage pour éliminer les matières particulaires petite qui peut perturber le fond propre de bonnes images.
- À l'image des embryons de vue alternatifs, tels que de la face ventrale, coupés canaux minces dans le agarose pour se adapter à l'embryon en utilisant une pince fine et placer les embryons dans ces canaux pour l'orientation (Figure 3 REMARQUE: La plupart des stades ont une position caractéristique qu'ils assument lorsqu'il est placé dans une solution. Par exemple, les embryons au stade blastula tendance à se asseoir animale vers le haut. Une fois les embryons commencent à se allonger, ils pondent de leur côté.
- Utiliser la source de lumière à fibre optique pour éclairer l'embryon à partir d'un angle faible, en créant des ombres sur l'embryon qui fournissent profondeur à l'image et aider discerner des structures de surface. Parce que le blanchiment peut éliminer pigment qui fournit des repères utiles, recourir à l'observation pour les embryons fortement blanchis.
- Effacer les embryons à l'image coloration qui est au plus profond de l'embryon, comme dans les notochorde, des poumons ou des régions du cerveau, (Figure 4). Pour ce faire, mettre les embryons à travers une série de methanol jusqu'à ce que dans 100% de methanol.
- Après une immersion complète dans du methanol, transférer les embryons à une solution d'une partie de l'alcool benzylique et benzylique deux parties soitnzoate (BABB). Les embryons seront initialement flotter à la surface, mais comme le méthanol se mélange avec le BABB, ils vont se enfoncer dans le BABB. Effectuez chaque étape traiter avec BABB dans des flacons de verre ou de plats; BABB va fondre toute matière plastique ou de la peinture.
- Une fois autorisé, voir les embryons avec la lumière transmise venant d'en bas l'embryon. Ajuster l'intensité de la lumière ainsi que l'angle de dessous pour améliorer le contraste et fournir la meilleure couleur.
- Lors de l'affichage des embryons compensés soulèvent la boîte de Pétri en verre hors de la base. Pour ce faire, en utilisant simplement deux autres couvercles de boîte de Pétri pour l'élever de telle sorte que la région de l'assiette avec des embryons est élevée.
NOTE: Ceci a l'avantage de prendre la base de mise au point et l'élimination des effets gênants de imperfections ou des taches sur la base de microscope qui peut interférer avec l'image.
5. Double hybridation in situ
- Afin de visualiser simultanément le profil d'expression des two différents gènes dans un seul embryon, synthétiser deux sondes, l'une pour chacun des différents gènes. Synthétiser une sonde en utilisant DIG-UTP-11 en tant que marqueur de la manière décrite ci-dessus. On dilue le produit de la réaction de transcription de l'ARN dans un tampon d'hybridation pour obtenir une sonde 3x plus concentrée que seul utilisé pour les hybridations in situ.
- Synthétiser l'autre sonde d'intérêt en utilisant le même protocole que pour étiqueté sondé DIG, sauf que la fluorescéine-12-UTP doit être substitué à DIG-11-UTP. On dilue le produit de la réaction de transcription de l'ARN dans un tampon d'hybridation pour obtenir une sonde 3x plus concentrée que seul utilisé pour les hybridations in situ.
- Mélanger les deux sondes concentrées dans un rapport de 1: 1. Pour de meilleurs résultats, utilisez la sonde marquée à la fluorescéine pour le gène qui montre la plus forte expression dans le seul protocole d'hybridation in situ.
- Utiliser le même protocole d'hybridation in situ décrites pour unique in situ </ Em> hybridations, sauf utiliser la double sonde (sonde contenant l'1,5x mélange concentré de sondes marquées à la digoxigénine et marqués à la fluorescéine) à la fin de la première journée au lieu d'une seule sonde d'hybridation in situ.
- Suivez le protocole d'hybridation seule le deuxième jour de la double protocole d'hybridation in situ, à l'exception des fragments utilisation d'anti-fluorescéine AP Fab à une dilution de 1: 4000 à la place de fragments anti-DIG-AP Fab. Laver l'excès d'anticorps à partir de l'embryon comme dans le seul protocole in situ et effectuer la première réaction de couleur en utilisant le substrat BM-Violet AP.
- Après la première réaction de couleur, inactiver l'anticorps fluorescéine dans 0,1 M de glycine pH 2,0 pendant 40 minutes, suivi par cinq lavages de dix minutes dans du MAB. Bloquer les embryons dans MAB + HTSS + BR pendant 90 min. Ajouter l'anticorps anti-DIG à une dilution de 1: 2000 dans du MAB + BR + HTSS et incuber à 4 ° C pendant une nuit.
- Le lendemain, laver les embryons eoroughly dans MAB (12 lavages de 30 min) pour éliminer l'excès d'anticorps.
- Laver les embryons pendant 10 min dans du tampon AP (tableau 1), puis tache avec BCIP (0,5 mg / ml dans le tampon AP).
NOTE: La combinaison in situ devrait donner une coloration au bleu-violet foncé pour la première réaction de la couleur et une réaction de couleur bleu clair pour le second (figure 5). - Arrêter la réaction de couleur finale en enlevant le tampon AP et rincer trois fois avec MAB. Fixer les embryons avec Mempfa pendant 10 min. Laver les embryons avec 5 lavages rapides dans MAB ou OTC.
- Avec cette combinaison de couleurs, l'utilisation de méthanol dans les traitements post de coloration ne est plus possible, car il permettra d'éliminer la couleur seule BCIP. Stocker les embryons après coloration et la fixation dans PBS avec l'azoture de sodium à 0,02%. L'intensité de coloration peut être faible avec double dans situs. Si ce est un problème, de réduire les lavages à quatre, chacun des deux durée h.
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Representative Results
L'utilisation de sondes spécifiques de tissus peut fournir des informations en circulation en ce qui concerne l'état de développement des organes spécifiques. Dans les exemples suivants, l'étape de l'embryon est basée sur la table de transfert Nieuwkoop et Faber 11. Si l'on utilise des sondes de gènes exprimés forme après différenciation, la troponine I cardiaque au stade 28-30, par exemple (figure 1C), la présence ou la taille d'un organe différencié peut être évaluée à toute différenciation de poste de scène. Il ya des années, embryologistes ont pu faire une telle analyse fondée sur la connaissance remarquable de l'histologie de l'embryon précoce 12,13, mais que l'expertise a été largement perdu à la génération actuelle des embryologistes. Bien que, la perte de cette expertise peut être considéré comme regrettable, la fiabilité et la facilité d'utilisation de techniques d'hybridation in situ rend l'identification des tissus spécifiques disponibles à tout chercheur. Les tissus qui sont relativement discrets, til glande à l'éclosion embryonnaire 25 par exemple (figure 1A), peut être vivement marqué en utilisant situs sans la nécessité d'anticorps spécifiques ou des techniques histologiques (figure 1C). En outre, l'utilisation de la montagne tout dans situs permet de visualiser l'organe entier dans le cadre de l'embryon entier plutôt que de compter sur l'inférence à partir de coupes histologiques (figure 2). Même les tissus qui sont au plus profond de l'embryon y compris la tige optique (Figure 4) peuvent être consultés facilement et l'utilisation de l'embryon compensation peuvent fournir une définition précise des limites d'organes.
Blanchiment d'embryons pour éliminer pigment endogène à l'aide des solutions de peroxyde a largement éliminé l'exigence d'utiliser des embryons albinos qui manquent de pigment. Blanchiment pour différents temps peut être utile. Par exemple, si la tache est fort, un léger blanchiment qui permet une certaine pigmentation être considérée peut être utile parce que toutux pour une meilleure mise en scène et l'orientation de l'embryon (figure 2A). Cependant, si la tache est une zone où il existe un niveau élevé de pigmentation, tels que le rein (figure 2B), à proximité de l'élimination complète du pigment par une incubation plus longue dans la solution de blanchiment donne un meilleur résultat.
Les embryons ont tendance à prendre des positions particulières en solution. Après neurulation, ils ont tendance à poser à plat sur leurs côtés. Ce est très bien pour les images du flanc (figure 2B), mais peut être un problème avec d'autres domaines. Utilisation d'une base agarose permet de couper les canaux dans l'agarose qui peut être utiliser pour orienter les embryons. Par exemple, les précurseurs sanguins sont localisées à la face ventrale de l'embryon (figure 2A) et la pleine mesure de la coloration est difficile à observer. Positionnement de l'embryon dans un canal avec la face ventrale, puis permet l'affichage plein de ce profil d'expression génique (figure 3A). L'utilisation d'une double hybridation in situ peut montrer la relation entre les deux profils d'expression de gène dans un organisme unique (Figure 5) en éliminant la nécessité de la comparaison entre les différents embryons qui peuvent avoir de petites différences dans la morphologie. Peut-être le plus important, l'utilisation d'une hybridation in situ dans une donne la possibilité de marquer clairement cellules avant d'effacer la différenciation histologique sur la base de l'expression de gènes qui sont exprimés dans les progéniteurs précoces d'une lignée, comme pax2 qui est exprimé dans de nombreux tissus de la embryon précoce, avant la différenciation (figure 4A). La capacité à identifier les progéniteurs et les tissus qui ne sont pas clairement distingués basés sur l'histologie, comme précurseurs de cellules myéloïdes (figure 1B), a permis aux chercheurs de poser des questions beaucoup plus détaillées sur l'état de développement d'un organe et également à évaluer les résultats de expérimentale manipulation conçu pour provoquer la différenciation ectopique d'un tissu.
Figure 1:. Exemples de toute la montagne hybridation in situ sur des embryons de xénope dans La coloration au bleu d'une expérience d'hybridation in situ peut délimiter clairement le développement des structures de l'embryon précoce de Xenopus (A) Une vue antérieure d'un embryon étage 26 soulignant la glande éclosion. démarquée par l'expression de uvs.2 14 (B) Une vue ventrale une embryons montrant l'emplacement des cellules myéloïdes précoces au stade 20 en utilisant l'expression de la myéloperoxydase 15 comme marqueur (C) La cardiaque précoce au stade 28.. - 30 est visualisée par l'expression de la troponine I cardiaque 16. Un net avantage de cette méthode est que tousces profils d'expression de gènes ont été visualisées en utilisant différentes sondes mais le protocole utilisé est identique dans tous les cas. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Différents niveaux de blanchiment peut être utilisé pour visualiser coloration dans l'embryon (A) Cette coloration au bleu le long du bas de cet embryon montre l'expression de l'hémoglobine dans les îles de sang ventrales à environ étage 36. Ce est une région de la. embryon qui est seulement légèrement pigmentée et donc l'embryon n'a pas été blanchie pendant longtemps comme on peut le voir par le pigment de couleur tan dans les yeux et le long du flanc de l'embryon. Être capable de voir la pigmentation permet pour une meilleure visualisation de la scène de l'embryon. Si la coloration est dans une région avec une plus grande pigmentation naturelle, tels que le système nerveux et le flanc de l'embryon, une plus grande blanchiment va aider à visualiser la in situ comme on le voit dans B. (B) Ici, l'expression de PAX8 17 dans le rein formation , conduit pronephrique et cerveau postérieur est mieux visualisés après le blanchiment a supprimé presque tous pigment endogène. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Manipulation de la base agarose peut aider à l'orientation des embryons imagerie des régions spécifiques de l'embryon peut être difficile, car ils ont tendance à prendre des positions particulières dans le plat (A) À têtard stades de l'embryon va se coucher sur le côté.. . En coupeTing un canal fin dans la gélose (flèches noires) l'embryon peut être consulté à partir de la face ventrale, montrant ici l'expression de l'hémoglobine à l'étape 36, avec une stabilité suffisante pour capturer une bonne image. (B) Cette vue ventrale de l'expression de hand1 au stade 20 donne un aperçu du mésoderme latéral 6. L'embryon est placé dans un petit trou qui stabilisé sa position avec la face ventrale. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Les organes internes peuvent être consultés dans les deux opaques, embryons défrichées et non défrichées dans Dans un embryon non défrichée colorées pour pax2 au stade 34 (A), la tige optique (flèche jaune) peut être visualisé assez facilementtout comme la coloration dans le tube neural. Cependant, les détails ne sont pas nettes. En désactivant l'embryon (B) les limites des sites d'expression, y compris la tige optique (flèche jaune) sont plus nettes. L'ampleur de la compensation est représentée par la capacité de voir les deux yeux en ce embryon effacé. Notez également que certains coloration se est accumulée dans les cavités internes (flèche violette), un problème commun lors de la visualisation embryons défrichées.
Figure 5:. Un double représentant hybridation in situ sur un embryon de Xenopus expression du marqueur de plaque latérale, hand1, est visualisée par la coloration bleu clair à l'étape 26. Expression de ETV2 dans le système vasculaire de développement est visualisé par coloration pourpre bleu foncé. Expression de hand1 est habituellement très intense et il a donc été utilisée pour til plus faible sonde marquée à la fluorescéine et la combinaison BCIP. Le utilisée la sonde marquée à la digoxigénine et la combinaison BM-violet pour l'expression plus faible de ETV2.
| Nom | Concentration finale | Montant / 100 ml |
| Mempfa | 1 mM de MgSO 4 | 100 pl de 1 M MgSÛ4 |
| (Conserver à 4 ° C) | 2 mM d'EGTA, pH 8,0 | 10 ml de 20 mM d'EGTA, pH 8,0 |
| 0,1 M MOPS, pH 7,5 | 10 ml d'une M MOPS, pH 7,5 | |
| 4% paraformaldéhyde, pH 7,5 | 50 ml de 8% de paraformaldehyde, pH 7,5 | |
| TTW | Tris 50 mM, pH 7,4 | 5 ml de Tris 1 M, pH 7,4 |
| 200 mM de NaCl | 4 ml de NaCl 5 M | |
| 0,1% de Tween 20 | 100 pi de Tween 20 | |
| La solution de Denhardt 100X | 2% de BSA | 2 g de SAB |
| (Filtrer à travers filtre de 0,2 um, | 2% de PVP-40 | 2 g de PVP-40 |
| conserver à -20 ° C) | 2% de Ficoll 400 | 2 g de Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M de NaCl | 17,5 g de NaCl |
| 300 mM de citrate trisodique | 8,8 g citrate trisodique | |
| ARN tampon d'hybridation | 50% de formamide | 50 ml de formamide à 100% |
| (Conserver à 4 ° C) | 5x SSC | 25 ml de SSC 20x |
| / Ml d'ARN de levure de 1 mg | 4 ml de 1 mg / ml d'ARN de levure dissoute dans 50% de formamide | |
| La solution de Denhardt 1X | 1 ml de solution de Denhardt 100x | |
| 0,1% de Tween 20 | 100 pi de Tween 20 | |
| EDTA 5 mM, pH 8,0 | 1 ml d'EDTA 0,5 M, pH 8,0 | |
| MAB | 100 mM d'acide maléique | 1,16 g d'acide maléique |
| (PH 7,5, conserver à 4 ° C) | 150 mM de NaCl | 0,88 g de NaCl |
| MAB + HTSS + BR | 100 mM d'acide maléique | 96 ml d'MAB |
| 4% subi un traitement thermique Sheep Sérum | 4 ml d'un traitement thermique Sheep Sérum (traitement thermique à 55 ° C pendant 30 min et poolées) | |
| Réactif de blocage à 2% | 2 g de réactif de blocage Roche | |
| MAB + HTSS + BR + anticorps anti-Dig | 100 mM d'acide maléique | 96 ml d'MAB |
| 4% Chaleur Treated sérum de mouton | 4 ml d'un traitement thermique Sheep Sérum | |
| Réactif de blocage à 2% | 2 g de réactif de blocage Roche | |
| 1: 10,000 Anti-Dig-AP, des fragments d'anticorps Fab | 1,5 ul d'anti-digoxygénine-AP, des fragments d'anticorps Fab | |
| La phosphatase alcaline (AP) Tampon | 100 mM de Tris, pH 9,5 | 10 ml de 1 M Tris, pH 9,5 |
| 50 mM de MgCl2 | 5 ml de 1 M de MgCl2 | |
| 100 mM de NaCl | 2,5 ml de 4 M de NaCl | |
| 0,1% de Tween 20 | 100 pi de Tween 20 | |
| Solution de blanchiment | 0,3% de H 2 O 2 | 3,34 ml de 30% de H 2 O 2 |
| 5% Formamide | 5 ml de formamide à 100% | |
| 0,5% SSC | 2,5 ml de SSC 20x | |
| Solution de compensation | 1/3 alcool benzylique | 33 ml |
| 3.2 Benzyl Benzoate | 67 ml |
Tableau 1: Recettes Solution
| Nom | Montant |
| Dig-NTP Mix | 5 ul de 20 mM CTP |
| (40 ul de réaction) | 5 ul de 20 mM de GTP |
| 5 ul d'ATP 20 mM | |
| 3,25 ul de 20 mM UTP | |
| 3,5 pi de 10 mM Dig-11-UTP | |
| 18,25 pi distillée, eau autoclave | |
| Probe Synthèse | x pi d'ADN de matrice(En fonction de la concentration) |
| (20 ul de réaction) | x ul d'eau distillée autoclave |
| 4 pi de Dig-NTP Mix | |
| 0,5 ul d'inhibiteur d'ARNase | |
| 2 pl de tampon 10X de la polymerase d'ARN | |
| 2 ul d'ARN polymerase |
Tableau 2: Synthèse de sondes Recettes
| Nom du réactif | Volume approximatif | Durée | Température |
| 100% de methanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 75% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 50% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 25% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| TTW | 2 ml | 10 min, à bascule | Température de la pièce |
| TTW | 2 ml | 10 min, à bascule | Température de la pièce |
| TTW | 2 ml | 10 min, à bascule | Température de la pièce |
| Préchauffer ARN tampon d'hybridation et de sonde à 65 ° C | |||
| TTW | 4 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| TTW | 4 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| ARN tampon d'hybridation | 2 ml | 10 min, à bascule | À température ambiantee |
| Préchauffé ARN tampon d'hybridation | 2 ml | 1 h, à bascule | 65 ° C |
| Solution Probe | 1 ml | Pendant la nuit, à bascule | 65 ° C |
Tableau 3: Étapes pour premier jour de In Situ Protocole hybridation (environ 3 heures de total)
| Nom du réactif | Volume approximatif | Durée | Température | ||||
| Buffer hybridation d'ARN pré-chaud et 02.x SSC à 65 ° C et 2x SSC à 37 ° C | |||||||
| Retour solution de sonde sur le tube pour un usage répété | |||||||
| ARN tampon d'hybridation | 2 ml | 10 min, à bascule | 65 ° C | 2X SSC | 2 ml | 20 min, à bascule | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 ml | 20 min, à bascule | 37 ° C | ||||
| 0,2x SSC | 4 ml | 1 h, à bascule | 65 ° C | ||||
| 0,2x SSC | 4 ml | 1 h, à bascule | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1,5 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce | ||||
| MAB + HTSS + BR + anticorps anti-DIG | 1,5 ml | Pendant la nuit, à bascule | 4 ° C |
Tableau 4: Procédure de Deuxième jour de In Situ Protocole hybridation (environ 4 h du total)
| Nom du réactif | Volume approximatif | Durée | Température |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| MAB | 4 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| BM Violet AP Substrat | 500-750 pi | Pendant la nuit, à bascule (voir texte) | Température ambiante / 37 ° C (voir le texte) |
Tableau 5: Étapes pour le troisième jour de In Situ Protocole hybridation (environ 7 h)
| Nom du réactif | Volume approximatif | Durée | Température |
| 25% de méthanol | 2 ml 5 min, à bascule | Température de la pièce | |
| 50% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 75% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 100% de méthanol (froid) | 2 ml | 20 min, à bascule | Température de la pièce |
| 100% de méthanol (froid) | 2 ml | Varie, aucune oscillation | Température de la pièce |
| 75% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 50% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 25% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| Mempfa | 2 ml | 30 min, à bascule | Température de la pièce |
| 25% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 25% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 25% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| Solution de blanchiment | 4 ml | 40 min-3 h, à bascule | Température ambiante / 37 ° C (voir le texte) |
| Le stockage des embryons | |||
| 25% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 50% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 75% de méthanol | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| 100% de methanol | 4 ml | Conserver à -20 ° C | |
| PBS 1x | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| PBS 1x | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
| PBS 1x | 2 ml | 5 min, à bascule | Température de la pièce |
Tableau 6: Étapes pour arrêter hybridation in situ, blanchiment et le stockage d'embryons
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Discussion
La possibilité d'utiliser l'hybridation in situ de visualiser le profil d'expression de gènes spécifiques reste le procédé le plus couramment utilisé pour identifier des organes spécifiques ou des types de cellules dans l'embryon de Xenopus. Ce est en raison de plusieurs avantages offerts par cette technique. L'expression d'un gène peut identifier des structures spécifiques bien avant tout signe histologique de différenciation comme le cas pour l'expression de Nkx2.5 dans les progéniteurs cardiaques avant toute délimitation claire de ces cellules 18. Une fois que tous les réactifs sont dans la main, il est également très rentable. Génération de nombreuses sondes individuelles, qui peuvent être réutilisés efficacement, est possible avec peu de temps supplémentaire et de l'investissement des coûts autres que l'obtention des plasmides qui codent pour les gènes d'intérêt. Dans notre expérience, les sondes peuvent être réutilisés pendant des années avec peu de perte de l'activité malgré les petits dilutions inévitables qui viennent avec chaque utilisation. Enfin, il ya peu requi d'optimisationrouge lorsque l'on utilise des sondes différentes.
La qualité de la synthèse de la sonde est un facteur clé dans le succès du protocole. Il ya beaucoup de façons de vérifier la qualité de la sonde d'ARN, mais lançant tout simplement la sonde ARN sur un gel TAE est une méthode rapide et facile qui est assez fiable. Nous utilisons régulièrement le bromure d'éthidium pour colorer l'ARN et qui exige un traitement spécial et l'élimination des gels par la plupart des institutions. Alternatives non toxiques sont disponibles dans le commerce, bien que nous ne avons pas comparé spécifiquement ceux pour sondes de visualisation. La sonde doit fonctionner comme une seule bande même se il apparaît peu floue par rapport à l'ADN sur un gel TAE. Une estimation de la quantité d'ARN peut être obtenu: une bonne réaction aura environ 1 ug / ul d'ARN. Une bande facile à visualiser représentera au moins 0,5 ug d'ARN et une bande lumineuse représentera plus de 1 ug. Bien que manifestement pas tout à fait exact et nécessitant une certaine expérience, quantification basée sur le gel est le rapid et la robustesse de la procédure in situ lui permet de bien travailler. Si on se inquiète de la répétabilité, on peut facilement utiliser absorbance UV à quantifier une petite quantité de la réaction de transcription, même si nous ne avons pas trouvé que ce était une préoccupation majeure. Enfin, le gel permet de voir si l'ADN matrice a été éliminé. Si le gel indique qu'il n'y a pas d'ARN, les deux explications les plus probables sont une matrice d'ADN défectueux ou que le tampon de transcription ne fonctionne pas bien. Le chauffage du tampon de transcription à 37 ° C et mélange intime avant l'utilisation, ou l'ajout de 1 ul de DTT 100 mM fraîche à la réaction de transcription peut parfois aider avec ce dernier. Un élément important du tampon de réaction de transcription est de la spermidine et il peut précipiter la matrice d'ADN à basse température rend le réchauffement de la mémoire tampon importante. DTT dans le tampon peut aussi précipiter significativement inhiber la réaction. Si un précipité se est vu dans le tampon, la solution se réchauffer etvortex vigoureusement. Il ne est pas nécessaire de prendre des précautions inhabituelles, comme le traitement de l'eau avec DEPC ou autoclavage des conseils et des tubes, pour empêcher l'activité RNAse. La présence de l'inhibiteur de ribonucléase commercial fournit une protection considérable contre RNAses de l'environnement. A noter que d'autres étiquettes UTP peuvent être utilisés, tels que la fluorescéine, bien que, dans notre expérience, l'UTP marqué à la digoxigénine et la combinaison d'anticorps anti-digoxigénine fournit les résultats les plus cohérents.
Les premiers protocoles pour la génération de la sonde indiquent que l'hydrolyse alcaline des sondes synthétisées doit être effectuée 4 afin de permettre une plus grande pénétration de la sonde. L'hydrolyse de la sonde ne semble pas contribuer au processus d'hybridation in situ; des sondes d'ARN de plus de 500 pb donnent généralement un excellent signal et des sondes qui sont plus de 2 kb de longueur aussi bien travailler. Des sondes plus courtes peuvent fonctionner que si l'ARN cible est abondante, mais les sondes plus longues donneront bcoloration Etter. Il ne semble pas y avoir de net avantage dans l'utilisation de la digestion alcaline pour briser des sondes plus longues.
Entretien dans le traitement initial des embryons est très important. Retrait de l'enveloppe de fertilisation est particulièrement utile pour les embryons après pli fermeture de neurones et avant l'éclosion naturelle de l'enveloppe de fertilisation. Au cours de l'élongation de l'embryon à l'intérieur de l'enveloppe de la fécondation, l'embryon devient recourbé et se fixe dans cette position, les embryons sont plus difficiles à image après l'hybridation in situ. Cependant, si les embryons sont enlevés de l'enveloppe de fertilisation avant la fixation, ils se redressent en œuvre rapidement. Si les embryons sont endommagés pendant le retrait de la membrane, leur permettre de guérir la plaie avant la fixation parce que le tissu endommagé peut entraîner un faux signal d'hybridation in situ sur le site de la plaie. Si petite, les blessures guérissent très rapidement, souvent en quelques minutes 19. Les étapes ultérieures peuvent également endommager les embryons Duanneau liquide de transfert et si les soins est nécessaire lors du changement de solutions. Dommages dans les premières étapes signifie généralement que l'embryon sera gravement endommagé par la fin de la procédure et des régions endommagées fera faux signaux in situ à la vue des dommages. En outre, jusqu'à 30 embryons peuvent être sondés dans un seul flacon, mais avec plus d'embryons, il ya plus de chances de bruit de fond élevé en développement durant la réaction colorimétrique, toutefois augmenter les lavages le jour 3 ou le lavage nuit peut compenser pour cela.
Dans ce protocole, le nombre de pas a été réduite et l'utilisation de plusieurs réactifs couramment utilisés a été éliminé. A noter que ce protocole élimine plusieurs étapes qui sont utilisés dans de nombreux autres protocoles comprenant une protéinase K digestion et l'utilisation de l'anhydride acétique pour bloquer les groupes chargés positivement. Ces mesures peuvent encore être utile en regardant les embryons de mammifères et aviaires, mais dans l'utilisation de Xenopus, l'élimination de ces étapes a peu d'impact on les résultats définitifs de l'hybridation in situ. Notre laboratoire n'a pas déterminé si ces mêmes simplifications peuvent être appliquées à des protocoles d'hybridation in situ pour d'autres espèces. Protéinase K digestion en particulier peut encore être nécessaire dans d'autres tels que les embryons de poulet ou de la souris où la pénétration de la sonde peut avoir plus de limites.
L'utilisation de BM substrat pourpre est pratique et fiable. Cependant, il ya un certain nombre d'autres options disponibles pour les substrats précipitants, couleur alcalines qui sont nécessaires pour localiser l'ARN cible dans l'embryon. En particulier, une combinaison de NBT / BCIP 4 est couramment utilisé et fonctionne bien. Certains réactifs sont de couleur soluble dans le méthanol, et dans ce cas, l'utilisation de methanol après coloration permettra d'éliminer la tache et doit être évitée. Autres combinaisons de couleurs peuvent également être utilisés lors de l'exécution double dans situs. L'utilisation d'une combinaison similaire (NBT / BCIP plutôt que BM violet) a également été montréd'être très robuste lors de l'utilisation des embryons de souris 20. La couleur bleue de la coloration et le pigment endogène de l'embryon sont souvent difficiles à distinguer clairement en images. Utilisation d 'embryons albinos permettra également d'éliminer pigment mais la solution de blanchiment est presque aussi efficace et est beaucoup plus commode car il ne nécessite pas le maintien de la albinos adultes pour la reproduction. Si la coloration est relativement faible, forte blanchiment peut souligner que la coloration. Si la coloration est forte, laissant un peu de pigment de la lumière peut être un contraste efficace et aussi aider à orienter la mise en scène et de l'embryon.
Après l'hybridation pendant une nuit à sonde d'ARN, le protocole peut diverger de protocole strictement manuelle décrite ici pour l'utilisation d'un robot de l'hybridation in situ. L'utilisation du robot d'hybridation in situ permet d'économiser presque une journée entière que la deuxième journée et trois jours du protocole manuel peut être réduite à un jour que le robot fonctionne à travers la nuit, und peut faire tous les changements de température appropriées. Le robot est aussi très cohérent dans ses résultats et permet un palpage simultané de plusieurs échantillons de manière efficace. Il reste avantageux de le faire le premier jour à la main car qui permet de réutilisation des sondes et l'utilisation de plus petits volumes de réactif. Le seul inconvénient significatif de l'utilisation d'un robot est le coût initial de l'instrument.
Ce protocole traite de certains des moyens de l'image effectivement une hybridation in situ. Il est important de le faire autant de l'information peuvent être perdues si l'image est mauvaise. Dans de nombreux cas, les résultats de l'imagerie in situ d'une expérience exige en même temps que l'expérience initiale. Certains éléments des variables de procédure tels que le degré de blanchiment ont un élément de préférence personnelle. D'autres effets d'imagerie peuvent être obtenues en plaçant le plat sur une base colorée. Souvent une légère teinte bleue à l'agar peut souligner la coloration bleu profond de la SIThybridation u. Il suffit de mettre la boîte de Pétri contenant l'agar sur une feuille de plastique bleu pour obtenir l'effet désiré.
Cependant, les méthodes décrites ici fournissent une base avec laquelle pour explorer les possibilités d'imagerie. Les embryons peuvent être consultés soit effacés (rendue transparente pour mieux visualiser les structures internes) ou non défrichée (vu comme ils apparaissent dans des conditions d'éclairage normales). Une partie de la décision en ce qui concerne la manière de l'image de l'embryon dépend du site d'expression. Si l'expression est sur ou près de la surface de l'embryon, il est préférable de l'image de l'embryon sans compensation. Il ya plusieurs avantages à utiliser les embryons non dégagées. Le processus de compensation des embryons nécessite de nombreuses étapes et les produits chimiques utilisés pour effacer les embryons sont difficiles à manipuler. En outre, plusieurs cavités dans l'embryon permettre la précipitation de phosphate de substrats alcalins qui peuvent entraîner des faux coloration de la cavité. En particulier, le blastocèle d'embryons précoces et l'pharyncavité geal montrent souvent coloration (figure 4). Cette fausse coloration ne est pas visible dans les embryons qui ne sont pas effacées. Pour la plupart, même modérément expression profonde peut être visualisé dans les embryons non dégagées, y compris les tissus mésodermiques tels que le coeur, les reins et les somites, et endodermiques constructions telles que la thyroïde et le foie. Déplacer les embryons à travers une série de méthanol soit hydraté dans PBS pour le visionnement ou mis en méthanol à 100% pour le stockage permet de multiples tours de stockage et d'imagerie. Le stockage de méthanol permet d'essayer différentes modifications à l'imagerie au fil du temps prolongée.
Il existe certains inconvénients à l'utilisation dans la technique d'hybridation in situ pour examiner l'expression du gène. Niveaux d'expression ne sont pas strictement quantifiable même si la comparaison au sein d'un embryon et les variations brutes dans l'expression et les changements dans l'expression la taille de domaine sont généralement évidente. Comme pour les autres techniques basées sur l'ARN, il ne fournit aucune information en tant que to les protéines codées par le gène d'intérêt, ce qui peut limiter l'interprétation des résultats. Enfin, il est souvent difficile de déterminer ce qui pourrait être la coloration de fond par rapport à la véritable domaine de l'expression. Ce est particulièrement un problème avec des gènes avec un motif d'expression inconnue qui peut être généralisée. Souvent, une sonde générée à partir du brin sens du même gène est utilisé en tant que contrôle pour la coloration non spécifique. Utilisation d'un contrôle de brin sens peut fournir quelques informations concernant un problème avec des réactifs mais il ne fournit pas la preuve définitive que la coloration en fonction de la sonde antisens est tout à fait exact. Les résultats d'une in situ sont généralement remarquablement uniforme dans les embryons lorsque plusieurs embryons sont utilisés, ce qui peut être utilisé comme une mesure de confiance dans un profil de coloration. En outre, différentes sondes antisens, générés à partir de différentes parties du gène, en particulier les régions non traduites, peuvent être utilisés pour voir si elles donnent le même schéma de coloration. Se ils le font,il fournit également la confiance dans le motif de coloration observé si elle est identique. Dilué sondes peuvent également être utilisées avec une exposition prolongée à la solution de coloration pour voir si le même schéma de coloration émerge. Un facteur qui inspire confiance généralement dans un profil de coloration est de savoir si ce motif correspond à une structure embryonnaire spécifique. Assez en situs ont maintenant été fait avec une grande variété de gènes que les nouveaux profils d'expression sont susceptibles d'événements relativement rares. De grandes bases de données dans les images in situ ont été établis pour différents organismes qui peuvent être utilisées pour comparer les résultats d'image. Pour les embryons de xénope, Xenbase (www.xenbase.org) est un excellent exemple d'une ressource qui peut être utilisée pour comprendre les modes d'expression. Autres organismes modèles sont également dotés d'importantes bases de données d'images similaires.
Malgré ces réserves potentielles, l'hybridation in situ reste un outil puissant et fiable qui est extrêmement utile pourl'étude de l'organogenèse. Il est susceptible de rester la méthode de choix pour identifier les types de cellules et d'examiner changement dans le domaine de l'expression des gènes dans un avenir prévisible.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
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