Protocol
1. Embryo Preparazione
- Se non è fatto di routine come parte della cultura dell'embrione, de-gelatina embrioni utilizzando 2,5% cisteina, pH 8.0 prima della fissazione 8. Anche se non è assolutamente necessario, è utile rimuovere manualmente la busta concimazione prima del fissaggio utilizzando una pinza sottile.
- Utilizzare pipette Pasteur di vetro per il trasferimento degli embrioni. La pipetta non è sufficientemente larga per trasferire gli embrioni in modo da utilizzare una penna di diamante per tagliare la pipetta di vetro in un punto sufficientemente largo per raccogliere un embrione. Eliminare i bordi taglienti delle pipette dopo il taglio passando rapidamente la punta di taglio attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen per fondere i bordi taglienti.
NOTA: La cura deve essere presa, come il vetro può essere ancora sufficientemente calda da causare ustioni anche se sembra aver raffreddato mediante ispezione visiva.
- Utilizzare pipette Pasteur di vetro per il trasferimento degli embrioni. La pipetta non è sufficientemente larga per trasferire gli embrioni in modo da utilizzare una penna di diamante per tagliare la pipetta di vetro in un punto sufficientemente largo per raccogliere un embrione. Eliminare i bordi taglienti delle pipette dopo il taglio passando rapidamente la punta di taglio attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen per fondere i bordi taglienti.
- Eseguire la fissazione embrione nelle fasi. In primo luogo, preparare fiale di vetro per l'utilizzo in fissaggio embrione. Utilizzare questi flaconi per tutte le fasi, tra cui finalestoccaggio. Utilizzare fiale che sono chiare con una buona tenuta Teflon nel coperchio, consentendo per monitorare gli embrioni durante tutte le fasi del processo. Etichettare le fiale con un'adeguata informazione sperimentale utilizzando pennarello indelebile e poi coprire l'etichetta con nastro adesivo trasparente, come anche pennarello indelebile sarà persa nel corso del procedimento a causa dell'uso di alcoli e altri solventi.
- Utilizzare Mempfa per fissare gli embrioni. Effettuare una scorta di 8% paraformaldeide in lotti di 50-100 ml alla volta. Utilizzare circa il 75% della richiesta H 2 O e si riscalda a 50-60 ° C, che è necessario per ottenere la paraformaldeide in soluzione.
NOTA: Questa soluzione è leggermente diversa da quella utilizzata nelle versioni Memfa protocollo pubblicato più vecchie in quanto utilizza paraformaldeide piuttosto che di formaldeide. - Aggiungere 2-3 gocce di NaOH 10N o fino a quando il pH è pari a circa 7,5 (uso della carta pH per controllare il pH). Paraformaldeide è molto tossico, quindi generare la soluzione di riserva in una cappa aspirante. Una volta che il parala formaldeide è in soluzione, filtrare la soluzione attraverso carta Whatman in un contenitore fresco e inserirlo H 2 O al volume finale. Se necessario, conservare la soluzione paraformaldeide a 4 ° C per 1-2 settimane.
- Assemblare i restanti componenti della soluzione di fissaggio Mempfa (Tabella 1). Assicurarsi che la concentrazione finale di lavoro di paraformaldeide 4%. Conservare tutti i componenti della soluzione di fissaggio a 4 ° C come scorte.
- Usando una pipetta di vetro taglio, fissare gli embrioni aggiungendo gli embrioni alle fiale di vetro etichettati che sono stati riempiti con i circa 3-4 ml di soluzione Mempfa (Tabella 1). Evitare di fissare più di 20-30 embrioni per flacone. Aggiungere gli embrioni con un minimo di trasferimento di liquido dal mezzo embrione. Fissare embrioni in soluzione Mempfa per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
- Per le strutture in ritardo endoderma eseguire l'in situs su isolate manualmente intestinale e endoderma derivati 9,10, Che consente una buona penetrazione della sonda ed evita anche cavità colorazione.
- Conservare una soluzione di metanolo 100% a -20 ° C. Dopo la fissazione paraformaldeide, sostituire la soluzione Mempfa con circa 4 ml di -20 ° C, 100% di metanolo per la conservazione degli embrioni.
- Agitare i flaconi dopo l'aggiunta del metanolo per evitare gli embrioni di attaccarsi al vetro o altri embrioni. Inoltre, assicurarsi che i flaconi sono ermeticamente chiusi perché il metanolo può evaporare in freezer nel tempo se sciolto.
NOTA: embrioni può essere conservato per almeno un anno, e probabilmente più, nel metanolo prima della colorazione senza perdita di qualità in situ ibridazione.
- Utilizzare Mempfa per fissare gli embrioni. Effettuare una scorta di 8% paraformaldeide in lotti di 50-100 ml alla volta. Utilizzare circa il 75% della richiesta H 2 O e si riscalda a 50-60 ° C, che è necessario per ottenere la paraformaldeide in soluzione.
2. Sonda Preparazione
- Utilizzare 1-2 mg di DNA stampo per rendere le sonde digossigenina marcato. Cut plasmide contenente la sequenza di DNA appropriata all'estremità 5 'del gene di interesse con un enzima di restrizione adeguato that vettoriale per generare sonde antisenso.
NOTA: Il plasmide dovrebbe avere un sito di legame appropriata polimerasi RNA (es T7, T3, o SP6). - Lasciare il DNA, acqua, NTP mescolare e tampone polimerasi riscaldare a temperatura ambiente prima di assemblare la reazione di sintesi della sonda. Aggiungere i componenti della reazione di sintesi di RNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml nell'ordine indicato nella tabella 2. Regolare il volume di acqua aggiunta per portare il volume totale della reazione di sintesi della sonda a 20 microlitri. Montare la reazione a temperatura ambiente perché i componenti del buffer polimerasi può precipitare il DNA modello quando in concentrazioni elevate e freddo.
- Incubare la reazione di trascrizione per 2 ore a 37 ° C.
NOTA: Incubazioni di poco più di due ore porta ad effetti negativi, ma anche mostrano poco aumentato la resa. Se incubati per un'ora, il rendimento sarà ridotto, ma comunque sufficiente per effettuare una buona sonda.- In attesa per la reazione di trascrizione alla fine, fare un gel di agarosio che verrà utilizzato per verificare la qualità della sonda. Sciogliere 1 mg di agarosio in 100 ml di tampone TAE 1x (vedi Tabella 1) riscaldando la soluzione al punto di ebollizione. Rimuovere la soluzione dal calore quando la polvere agarosio si è completamente dissolto.
- Aggiungere 2 microlitri etidio bromuro soluzione madre (10 mg / ml) a circa 100 ml di gel di agarosio durante l'agarosio si è raffreddata a circa 60 ° C per permettere la visualizzazione di RNA sotto ultravioletta (UV).
NOTA: Questa soluzione gel di agarosio può essere conservato in un incubatore a 60 ° C in modo che future gel possono essere versati senza sciogliersi ripetuto. Prestare attenzione nel maneggiare bromuro di etidio causa di potenziale tossicità.
- Aggiungere 1 ml DNAseI (RNAse grado libero) per la reazione di trascrizione dopo l'incubazione 2 ore e incubare per altri 10 min a 37 ° C per eliminare DNA stampo.
- Rimuovere 1 ml di miscela di reazioneverificare l'1% gel di agarosio-TAE e il resto (20 microlitri) aggiungere 80 ml di 1% SDS in tampone TE (10 mM Tris pH 8,0, EDTA 1 mM), 10 ml di 5M NH 4 acetato, e 220 microlitri etanolo freddo. Vortex la miscela vigorosamente e mettere da parte in ghiaccio in attesa dei risultati del controllo di qualità RNA.
- Eseguire le 1 ml di RNA rimossi prima della precipitazione sul 1% gel-TAE. Per facilitare il carico sul gel, aggiungere 4-5 ml di acqua e 1 ml di colorante carico standard per l'RNA. Mostra la RNA sul gel utilizzando un transilluminatore luce UV per verificare la qualità della sonda (vedi la discussione).
- Precipitare il RNA residuo che è stato allocato su ghiaccio nel passo 2.5 facendo girare in una microcentrifuga a piena velocità per 10 a 15 min. Aspirare il surnatante con una pipetta di vetro attirato e lasciare asciugare brevemente.
- Risospendere la sonda con 1 ml di tampone di ibridazione RNA (Tabella 1) nella provetta eppendorf. Vortex e briefly riscaldare il tubo a 37 ° C e agitare nuovamente. Trasferire la soluzione della sonda ad una vite da 15 ml tappo della provetta di polistirene e riempire di 7-10 ml con tampone di RNA ibridazione. Nota: La sonda può essere diluito ulteriormente (a 10 volte l'ulteriore diluizione può ancora funzionare), spesso con conseguente basso fondo, ma le reazioni di colorazione anche richiedere più tempo.
3. In ibridazione in situ
- Prendere gli embrioni che sono stati memorizzati in -20 ° C metanolo e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente. Eseguire l'intera procedura in fiale di vetro. Se gli embrioni diversi da un gruppo stanno per essere guardato da diverse sonde, tenerli in un singolo flaconcino fino a poco prima che le sonde sono aggiunti per ridurre la variabilità e del lavoro il primo giorno.
- Reidratare gli embrioni attraverso una serie di metanolo come indicato nella Tabella 3 (vedi Tabella 1 per ricette lavaggio) in preparazione per l'aggiunta della sonda. Agitare delicatamente la Embryos dopo ogni modifica al fine di garantire che non si attengono ai lati o l'altro, e roccia gli embrioni montando i flaconi su una nutator. Durante il trasferimento dei liquidi, controllare l'interno dei tappi per garantire che gli embrioni sono stati intrappolati lì.
- Una volta nella soluzione della sonda, gli embrioni ibridare overnight come descritto nella Tabella 3.
- Rimuovere la soluzione della sonda. Salvare la sonda utilizzata per la memorizzazione in un 15 ml con tappo a vite tubo di polistirene, contrassegnato con la data e il numero di volte in cui la sonda è stato utilizzato, a -20 ° C.
NOTA: La stessa sonda può essere riutilizzato più volte per la successiva ibridazioni in situ fino a quando le reazioni colorimetriche iniziano a prendere un tempo eccessivamente lungo per raggiungere l'intensità desiderata.- Una volta che la sonda è rimosso, preparare gli embrioni per la colorazione di anticorpi contro la sonda attraverso la serie di lavaggi descritti nella Tabella 4. Modificare la temperatura come richiesto (Tabella 4) t spostandoegli nutator, con fiale di embrioni allegati, direttamente nel forno di ibridazione che sono impostati alla temperatura adeguata.
- Portare il volume appropriato del MAB + HTSS + BR + anti-Dig anticorpi (Tabella 4) nel momento in cui gli embrioni vengono incubati nel MAB + HTSS + BR soluzione bloccante in modo che l'anticorpo è bloccato prima di aggiungere al embrioni. Fare le soluzioni bloccano fresco il giorno di utilizzo.
- Rimuovere la soluzione di anticorpi e iniziare lavaggi come indicato nella Tabella 5 seguente notte di incubazione con l'anticorpo. Eseguire almeno dodici 30 min lavaggi per preparare per la colorazione con il substrato della fosfatasi alcalina e ridurre lo sfondo, per quanto possibile. Utilizzare tampone MAB o soluzione OTC (Tabella 1) per le fasi di lavaggio.
NOTA: soluzione TBT è ttw che ha 2 mg / ml di BSA aggiunto.- Sostituire l'ultima soluzione di lavaggio con la BM substrato fosfatasi alcalina viola. Eseguire le REAC colorazionezione sia a temperatura ambiente oa 37 ° C.
NOTA: La colorazione è più rapida a 37 ° C, ma se lasciato overnight, sfondo inaccettabile colorazione spesso può essere un risultato. Le reazioni di colorazione spesso richiedono colorazione durante la notte e la temperatura ambiente è più sicuro per questo. - Se è necessaria un'ulteriore colorazione e la soluzione viola BM sta assumendo un colore blu, sostituire la soluzione colorante con fresco BM Viola e mettere i tubi in 37 ° C. Se l'mRNA bersaglio è molto abbondante, mettere gli embrioni nella soluzione colorante a 4 ° C durante la notte e quindi spostare gli embrioni a temperatura ambiente oa 37 ° C per consentire un migliore monitoraggio della reazione di colorazione.
- Monitorare con attenzione nuove reazioni, come il tempo di risultato finale varia considerevolmente tra i diversi RNA bersaglio. Per coerenza, arrestare la reazione di colorazione (vedi 3.4) quando non ci sono nuovi siti di espressione derivanti con più di incubazione. È importante sottolineare che, se in situ ibridazione viene utilizzato come dosaggioper esperimenti in cerca di diversi gruppi di trattamento, utilizzare lo stesso tempo per le reazioni di colore tra trattamento e di controllo embrioni.
- Sostituire l'ultima soluzione di lavaggio con la BM substrato fosfatasi alcalina viola. Eseguire le REAC colorazionezione sia a temperatura ambiente oa 37 ° C.
- Arrestare la reazione di colorazione e preparare gli embrioni per la conservazione e la registrazione di immagini cambiando i liquidi come indicato nella Tabella 6. Non oscillare gli embrioni in questa fase, perché la rimozione di macchie può essere visualizzato come colorazione viola del metanolo intorno gli embrioni.
NOTA: Spesso embrioni hanno una colorazione blu chiaro dalla soluzione colorante e il metanolo freddo può almeno parzialmente rimuovere che, anche se questo non è sufficiente a rimuovere lo sfondo pesante o cavità colorazione. Metanolo freddo si riferisce a metanolo che viene mantenuto in un freezer a -20 ° C.- Reidratare gli embrioni e fissare la macchia con Mempfa (Tabella 6). Una volta fissato, rimuovere il Mempfa e lavare gli embrioni con il 25% di metanolo.
- Rimuovere il metanolo 25% e aggiungere la soluzione di sbianca se la rimozione di pigmento endogenoè obbligatorio. Fare attenzione nel maneggiare la soluzione sbiancante in quanto può causare ustioni. Osservare la sbianca strettamente come avviene in tempi relativamente brevi e il grado di candeggio può essere variata per i diversi effetti (Figura 2).
- Disidrata embrioni attraverso una serie di metanolo al 100% di metanolo per la conservazione a lungo termine dopo il candeggio, o trasferire a PBS per la conservazione a breve termine e di imaging successiva (vedi Tabella 6).
4. Imaging embrioni
- Una volta che un embrione ha completato il processo di colorazione, l'embrione immagine in modo che le informazioni di cui viene espresso il gene di interesse viene catturato per un pubblico più vasto. Utilizzare 1% agarosio come sfondo per visualizzare gli embrioni non liquidati.
NOTA: Il agarosio dà uno sfondo blu / grigio che contrasta bene con l'embrione e il colore blu della reazione di colorazione. Aiuta anche diffondere ombre e riflessi che deviano l'attenzione dall'embrione distrazione.- Aggiungi agarosio all'acqua e quindi portare ad ebollizione fino a quando l'agarosio è in soluzione e poi lasciare raffreddare a 50 prima di versare nella capsula di Petri. Come con la soluzione di gel TAE, conservare la soluzione di agarosio a 55 ° C incubatore per molteplici usi. Versare il agarosio ad una profondità di circa 2 mm nella capsula di Petri. Se necessario, regolare la profondità di agarosio per produrre un leggermente diverso tonalità di sfondo.
- Dopo reidratazione dal magazzino in metanolo ad una soluzione acquosa (PBS o TTW), utilizzando una serie metanolo, posizionare gli embrioni in una capsula di Petri con la base agarosio (vedi tabella 6). Mantenere la soluzione pulita e, se necessario, utilizzare semplice filtraggio per eliminare piccolo particolato che può compromettere lo sfondo pulito di buone immagini.
- Per l'immagine gli embrioni di visualizzazioni alternative, come ad esempio dal lato ventrale, tagliare i canali sottili in agarosio per adattare l'embrione utilizzando una pinza sottile e posizionare gli embrioni in quei canali per l'orientamento (Figura 3 NOTA: La maggior parte degli stadi hanno una posizione caratteristica che assumono quando sono immessi in soluzione. Ad esempio, gli embrioni blastula stadi tendono a sedersi animale verso l'alto. Una volta che gli embrioni cominciano ad allungarsi, depongono dalla loro parte.
- Utilizzare la sorgente di luce in fibra ottica per illuminare l'embrione da un angolo basso, creando ombre sull'embrione che forniscono profondità all'immagine e contribuire a discernere strutture superficiali. Perché sbiancamento può eliminare pigmento che fornisce punti di riferimento utili, utilizzare shadowing per gli embrioni fortemente sbiancati.
- Cancellare gli embrioni di immagine colorazione che è profondo all'interno dell'embrione, come nelle notocorda, polmone, o regioni del cervello, (Figura 4). Per fare questo, mettere gli embrioni attraverso una serie metanolo fino a 100% metanolo.
- Dopo immersione completa in metanolo, trasferire gli embrioni ad una soluzione di una parte di alcool benzilico e due parti benzile esserenzoate (BABB). Gli embrioni inizialmente galleggiare sulla superficie ma come il metanolo mescola con il BABB, che affondano nel BABB. Eseguire ogni passo che fare con BABB in fiale di vetro o piatti; BABB si scioglierà qualsiasi plastica o vernice.
- Una volta eliminato, visualizzare gli embrioni con luce trasmessa proveniente da sotto l'embrione. Regolare l'intensità della luce così come l'angolo dal basso per migliorare il contrasto e fornire il colore migliore.
- Durante la visualizzazione embrioni eliminato sollevano la capsula di Petri di vetro dalla base. Per fare ciò, semplicemente utilizzando altri due coperchi capsula di Petri a sollevare in modo che la regione del recipiente con embrioni è elevata.
NOTA: Questo ha il vantaggio di prendere la base fuori fuoco e di eliminare gli effetti di disturbo da imperfezioni o macchie sulla base del microscopio che può interferire con l'immagine.
5. Fare doppio ibridazione in situ
- Per visualizzare contemporaneamente il pattern di espressione di two diversi geni in un singolo embrione, sintetizzare due sonde, una per ciascuno dei diversi geni. Sintetizzare una sonda con DIG-11-UTP come etichetta come descritto sopra. Diluire il prodotto della reazione di trascrizione in tampone RNA ibridazione per produrre una sonda più concentrato rispetto 3x utilizzati per singolo ibridazioni in situ.
- Sintetizzare l'altra sonda di interesse utilizzando lo stesso protocollo per DIG etichettato sondato salvo che fluoresceina-12-UTP deve essere sostituito DIG-11-UTP. Diluire il prodotto della reazione di trascrizione in tampone RNA ibridazione per produrre una sonda più concentrato rispetto 3x utilizzati per singolo ibridazioni in situ.
- Mescolare le due sonde concentrati in un rapporto 1: 1. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare la sonda con fluoresceina per il gene che mostra la più forte espressione nel singolo in protocollo situ.
- Utilizzare lo stesso in protocollo situ descritta per singolo in situ </ Em> ibridazioni, tranne utilizzare la doppia sonda (probe contenente la miscela 1.5x concentrato di sonde digossigenina e marcato con fluoresceina) alla fine del primo giorno in luogo di un'unica sonda situ ibridazione.
- Seguire il protocollo di ibridazione singolo il secondo giorno del doppio in protocollo situ, tranne frammenti uso anti-fluoresceina AP Fab in una diluizione 1: 4000 in luogo di frammenti anti-DIG-AP Fab. Lavare l'anticorpo in eccesso dal embrione come nel singolo in protocollo situ ed effettuare la prima reazione del colore utilizzando il substrato BM-Viola AP.
- Dopo la prima reazione del colore, disattivare l'anticorpo fluoresceina in 0,1 M glicina a pH 2.0 per 40 minuti, seguiti da cinque dieci minimo di lavaggi in MAB. Bloccare gli embrioni in MAB + HTSS + BR per 90 min. Aggiungere l'anticorpo anti-DIG ad una diluizione 1: 2.000 in MAB + HTSS + BR e incubare a 4 ° C durante la notte.
- Il giorno seguente, lavare gli embrioni °oroughly in MAB (12 lavaggi di 30 minuti) per rimuovere l'anticorpo in eccesso.
- Lavare gli embrioni per 10 min a AP Buffer (Tabella 1) e quindi macchiare con BCIP (0.5mg / ml in tampone AP).
NOTA: La combinazione in situ dovrebbe dare una colorazione blu-viola scuro per la prima reazione di colore e una reazione di colore azzurro per il secondo (Figura 5). - Arrestare la reazione finale del colore rimuovendo il tampone AP e lavare tre volte con MAB. Fissare gli embrioni con Mempfa per 10 min. Lavare gli embrioni con 5 lavaggi rapidi in MAB o TBT.
- Con questa combinazione di colori, l'uso di metanolo nei trattamenti post colorazione è più possibile, in quanto elimina il solo colore BCIP. Conservare gli embrioni dopo colorazione e la fissazione in PBS con il 0,02% di sodio azide. Intensità di colorazione può essere debole con letto in situs. Se questo è un problema, ridurre i lavaggi a quattro, ciascuna di durata 2 ore.
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Representative Results
L'uso di sonde specifiche del tessuto può fornire informazioni eccellente per quanto riguarda lo stato di sviluppo per organi specifici. Nei seguenti esempi, la fase dell'embrione si basa sulla tabella di gestione temporanea Nieuwkoop e Faber 11. Se uno usa geni forma sonde espressi dopo la differenziazione, troponina I cardiaca in fase di 28-30, per esempio (Figura 1C), la presenza o la dimensione di un organo differenziata può essere valutata in ogni differenziazione fase di post. Anni fa, embriologi sono stati in grado di fare questa analisi sulla base di notevole conoscenza del istologia del primo embrione 12,13 ma che l'esperienza è stata in gran parte perso l'attuale generazione di embriologi. Sebbene, la perdita di questa esperienza può essere considerato spiacevole, l'affidabilità e la facilità di utilizzo di tecniche di ibridazione in situ rende identificazione dei tessuti specifici disponibili a qualsiasi ricercatore. I tessuti che sono relativamente poco appariscente, tegli cova ghiandola alla fase embrionale 25 ad esempio (Figura 1A), può essere marcato utilizzando vividamente in situs senza la necessità di anticorpi specifici o tecniche istologiche (Figura 1C). Inoltre, l'uso di tutto il monte in situs permette di vedere l'intero organo nel contesto dell'intero dell'embrione piuttosto che basarsi su inferenza da sezioni istologiche (Figura 2). Anche tessuti che sono in profondità all'interno dell'embrione compreso il gambo ottica (Figura 4) possono essere visualizzati facilmente e l'utilizzo di embrioni di compensazione possono fornire tagliente delineazione dei confini organo.
Sbiancamento di embrioni per rimuovere il pigmento endogeno utilizzando soluzioni di perossido è in gran parte eliminato il requisito per l'utilizzo di embrioni albini privi di pigmento. Sbiancamento per tempi diversi può essere utile. Ad esempio, se la macchia è forte, un accendino sbianca che consente una certa pigmentazione essere visto può essere utile perché tuttoflussi per una migliore stadiazione e l'orientamento dell'embrione (Figura 2A). Tuttavia, se la macchia è una zona dove ci sono alti livelli di pigmentazione, come il rene (Figura 2B), vicino eliminazione completa del pigmento di più incubazione nella soluzione sbiancante dà un risultato migliore.
Gli embrioni tendono ad assumere posizioni particolari quando in soluzione. Dopo neurulazione, tendono a distesi su un fianco. Questo va bene per le immagini di fianco (Figura 2B), ma può essere un problema con le altre aree. L'uso di una base agarosio permette di tagliare i canali in agarosio che possono essere utilizzare per orientare gli embrioni. Ad esempio, precursori del sangue sono localizzati al lato ventrale dell'embrione (Figura 2A) e la piena portata della colorazione è difficile da osservare. Posizionamento dell'embrione in un canale con il lato ventrale, quindi consente la piena visione di tale pattern di espressione genica (Figura 3A). L'uso della doppia ibridazione in situ può mostrare la relazione tra due modelli di espressione genica in un unico organismo (Figura 5), eliminando la necessità di confronto tra i diversi embrioni che possono avere piccole differenze nella morfologia. Forse più importante, l'uso di ibridazione in situ dà la possibilità di contrassegnare chiaramente cellule prima di cancellare differenziazione istologica basata sull'espressione di geni che sono espressi in primi progenitori di linea, come PAX2 che è espresso in molti tessuti del embrione precoce, prima della differenziazione (Figura 4A). La capacità di identificare progenitori e tessuti che non sono chiaramente distinti basati su istologia, come precursori delle cellule mieloidi (Figura 1B), ha permesso ai ricercatori di porre domande più dettagliate sullo stato di sviluppo di un organo e anche per valutare i risultati della sperimentazione manipulation progettato per causare differenziazione ectopica di un tessuto.
Figura 1:. Esempi di tutto il monte ibridazione in situ su embrioni di Xenopus La colorazione blu da un esperimento in situ può chiaramente delineare lo sviluppo di strutture del primo embrione di Xenopus (A) Una vista anteriore di una fase embrionale 26 evidenziando la ghiandola cova. come delimitata dalla espressione di uvs.2 14 (B) Una vista ventrale di un embrioni che illustrano la posizione delle cellule mieloidi primi nella fase 20 utilizzando l'espressione della mieloperossidasi 15 come marcatore (C) Il cuore presto nella fase 28.. - 30 viene visualizzato mediante l'espressione di troponina cardiaca I 16. Un chiaro vantaggio di questo metodo è che tuttiquesti modelli di espressione genica sono stati visualizzati utilizzando diverse sonde, ma il protocollo utilizzato è identico in tutti i casi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Differenti livelli di candeggio può essere utilizzato per visualizzare colorazione nell'embrione (A) Questa colorazione blu lungo la parte inferiore di questo dell'embrione mostra l'espressione di emoglobina nel sangue isole ventrali a circa 36. Questa fase è una regione della. embrione che è solo leggermente pigmentato e quindi l'embrione non sbiancata per lungo tempo come si può vedere dal pigmento di colore marrone chiaro negli occhi e lungo il fianco dell'embrione. Essendo in grado di vedere la pigmentazione consente una migliore visualizzazione della fase dell'embrione. Se la colorazione è in una regione con maggiore pigmentazione naturali, come il sistema nervoso ed il fianco dell'embrione, maggiore sbianca aiuterà visualizzare in situ come visto in B. (B) Qui l'espressione di Pax8 17 nel rene formatura , condotto pronephric e hindbrain è meglio visualizzati dopo lo sbiancamento ha rimosso quasi tutto il pigmento endogeno. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Manipolazione della base agarosio può aiutare con l'orientamento degli embrioni Imaging regioni specifiche dell'embrione può essere difficile, perché tendono ad assumere particolari posizioni nel piatto (A) Al girino mette in scena l'embrione si trovano su un lato.. . Di taglioting un bel canale nella agarosio (frecce nere) l'embrione può essere visto dal lato ventrale, qui mostrando espressione di emoglobina in fase di 36, con sufficiente stabilità per catturare una buona immagine. (B) Questo punto di vista ventrale dell'espressione hand1 allo stadio 20 delinea la piastra mesoderma laterale 6. L'embrione è collocato in un piccolo foro che stabilizzato la propria posizione con il lato ventrale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Gli organi interni possono essere visualizzati in entrambe le opache, gli embrioni non liquidati e in eliminato in un embrione non liquidati colorate per PAX2 allo stadio 34 (A), la leva ottica (freccia gialla) possono essere visualizzati con relativa facilitàcosì come la colorazione nel tubo neurale. Tuttavia, i dettagli non sono taglienti. Deselezionando l'embrione (B) i confini dei siti di espressione, compresa la leva ottica (freccia gialla) sono più nitide. L'entità della compensazione è dimostrato dalla capacità di vedere entrambi gli occhi in questo embrione eliminato. Si noti inoltre che alcuni colorazione ha accumulato nelle cavità interne (frecce viola), un problema comune durante la visualizzazione di embrioni eliminato.
Figura 5:. Una doppia rappresentante ibridazione in situ su un embrione Xenopus espressione del marcatore piastra laterale hand1, viene visualizzato dalla luce colorazione blu allo stadio 26. Espressione ETV2 all'interno del sistema vascolare in via di sviluppo è visualizzato dal blu scuro viola macchia. Espressione dei hand1 è solitamente molto intenso e quindi è stato utilizzato per tegli debole probe marcato con fluoresceina e la combinazione BCIP. L'utilizzata la sonda digossigenina-marcata e la combinazione BM-viola per l'espressione ETV2 più debole.
| Nome | Concentrazione finale | Importo / 100 ml |
| Mempfa | 1 mM MgSO 4 | 100 ml di 1 M MgSO4 |
| (Conservare a 4 ° C) | 2 EGTA mM, pH 8,0 | 10 ml di EGTA 20 mM, pH 8,0 |
| 0,1 M MOPS, pH 7.5 | 10 ml di 1 M MOPS, pH 7.5 | |
| 4% paraformaldeide, pH 7,5 | 50 ml di 8% paraformaldeide, pH 7,5 | |
| TTW | 50 mM Tris, pH 7,4 | 5 ml di 1 M Tris, pH 7,4 |
| NaCl 200 mm | 4 ml di NaCl 5 M | |
| 0,1% Tween 20 | 100 ml di Tween 20 | |
| Soluzione di 100X Denhardt | 2% BSA | 2 g BSA |
| (Filtrare 0,2 micron filtro, | 2% PVP-40 | 2 g PVP-40 |
| conservare a -20 ° C) | 2% Ficoll 400 | 2 g Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M NaCl | 17,5 g NaCl |
| 300 mm trisodico Citrato | 8,8 g trisodico Citrato | |
| RNA Tampone di Ibridazione | 50% formammide | 50 ml del 100% formammide |
| (Conservare a 4 ° C) | 5x SSC | 25 ml di 20x SSC |
| 1 mg / ml di lievito RNA | 4 ml di 1 mg / ml di lievito RNA disciolti in 50% formammide | |
| Soluzione di 1X Denhardt | 1 ml di soluzione di 100x Denhardt | |
| 0,1% Tween 20 | 100 ml di Tween 20 | |
| 5 mM EDTA, pH 8,0 | 1 ml di 0,5 M EDTA, pH 8,0 | |
| MAB | 100 mM acido maleico | 1,16 g di acido maleico |
| (PH 7.5, conservare a 4 ° C) | 150 mM NaCl | 0,88 g di NaCl |
| MAB + HTSS + BR | 100 mM acido maleico | 96 ml di MAB |
| 4% di calore trattata Sheep Serum | 4 ml di calore trattata Sheep Serum (trattato termicamente a 55 ° C per 30 min e aliquotati) | |
| 2% reagente Blocco | 2 g di Roche reagente di blocco | |
| MAB + HTSS + BR + anticorpo anti-Dig | 100 mM acido maleico | 96 ml di MAB |
| 4% Tr Caloreeated Serum Sheep | 4 ml di calore trattata Sheep Serum | |
| 2% reagente Blocco | 2 g di Roche reagente di blocco | |
| 1: 10.000 Anti-Dig-AP, i frammenti di anticorpi Fab | 1,5 ml di anti-digossigenina-AP, i frammenti di anticorpi Fab | |
| Fosfatasi alcalina (AP) Buffer | Tris 100 mM, pH 9,5 | 10 ml di 1 M Tris, pH 9,5 |
| 50 mM MgCl 2 | 5 ml di 1 M MgCl 2 | |
| NaCl 100 mM | 2,5 ml di 4 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 ml di Tween 20 | |
| Sbiancamento Solution | 0,3% H 2 O 2 | 3,34 ml di 30% H 2 O 2 |
| 5% formammide | 5 ml di 100% formammide | |
| 0,5% SSC | 2,5 ml di 20x SSC | |
| Clearing Solution | 1/3 alcool benzilico | 33 ml |
| 2/3 benzilbenzoato | 67 ml |
Tabella 1: Soluzione Ricette
| Nome | Importo |
| Dig-NTP Mix | 5 ml di CTP 20 mM |
| (40 microlitri di reazione) | 5 ml di 20 mM GTP |
| 5 ml di 20 mM ATP | |
| 3,25 ml di 20 mm UTP | |
| 3,5 ml di 10mM Dig-11-UTP | |
| 18.25 ml distillata, acqua autoclave | |
| Probe Synthesis | x ml di DNA stampo(Dipende dalla concentrazione) |
| (20 microlitri di reazione) | x ml di acqua distillata, in autoclave |
| 4 ml di mix Dig-NTP | |
| 0,5 ml di inibitore RNAse | |
| 2 ml di tampone polimerasi RNA 10X | |
| 2 ml di RNA polimerasi |
Tabella 2: Sonda Sintesi Ricette
| Nome del reagente | Volume approssimativo | Durata | Temperatura |
| 100% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 75% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 50% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 25% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| TTW | 2 ml | 10 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| TTW | 2 ml | 10 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| TTW | 2 ml | 10 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| Pre-caldo RNA Hybridization Buffer e sonda a 65 ° C | |||
| TTW | 4 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| TTW | 4 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| RNA Tampone di Ibridazione | 2 ml | 10 min, a dondolo | Temperatura ambientee |
| Pre-riscaldato RNA Tampone di Ibridazione | 2 ml | 1 ora, a dondolo | 65 ° C |
| Probe Solution | 1 ml | Durante la notte, a dondolo | 65 ° C |
Tabella 3: Procedura per il primo giorno di ibridazione in situ (totale circa 3 ore) Protocol
| Nome del reagente | Volume approssimativo | Durata | Temperatura | ||||
| Pre-caldo RNA Hybridization Buffer e 02.x SSC a 65 ° C e 2x SSC a 37 ° C | |||||||
| Ritorna soluzione della sonda a tubo per l'uso di ripetizione | |||||||
| RNA Tampone di Ibridazione | 2 ml | 10 min, a dondolo | 65 ° C | 2X SSC | 2 ml | 20 min, a dondolo | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 ml | 20 min, a dondolo | 37 ° C | ||||
| 0.2x SSC | 4 ml | 1 ora, a dondolo | 65 ° C | ||||
| 0.2x SSC | 4 ml | 1 ora, a dondolo | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1,5 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente | ||||
| MAB + HTSS + BR + anticorpo anti-DIG | 1,5 ml | Durante la notte, a dondolo | 4 ° C |
Tabella 4: Passi per Secondo giorno di ibridazione in situ (totale circa 4 ore) Protocol
| Nome del reagente | Volume approssimativo | Durata | Temperatura |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| BM Viola AP substrato | 500-750 ml | Durante la notte, a dondolo (vedi testo) | Temperatura ambiente / 37 ° C (vedi testo) |
Tabella 5: Passi per Third Day di ibridazione in situ Protocol (circa 7 ore)
| Nome del reagente | Volume approssimativo | Durata | Temperatura |
| 25% Metanolo | 2 ml 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente | |
| 50% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 75% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 100% Metanolo (freddo) | 2 ml | 20 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 100% Metanolo (freddo) | 2 ml | Varia, no a dondolo | Temperatura ambiente |
| 75% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 50% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 25% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| Mempfa | 2 ml | 30 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 25% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 25% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 25% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| Sbiancamento Solution | 4 ml | 40 min-3 ore, a dondolo | Temperatura ambiente / 37 ° C (vedi testo) |
| Memorizzazione embrioni | |||
| 25% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 50% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 75% Metanolo | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 100% Metanolo | 4 ml | Conservare a -20 ° C | |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, a dondolo | Temperatura ambiente |
Tabella 6: Passi per arresto ibridazione in situ, sbianca e conservazione di embrioni
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Discussion
La possibilità di utilizzare l'ibridazione in situ per visualizzare il pattern di espressione di geni specifici rimane il metodo più comunemente utilizzato per identificare organi specifici o tipi cellulari nell'embrione Xenopus. Questo è causa di numerosi vantaggi offerti da questa tecnica. L'espressione di un gene in grado di identificare le strutture specifiche ben prima di qualsiasi segno istologico di differenziazione, come nel caso di espressione Nkx2.5 nei progenitori cardiaci prima di una chiara delimitazione di tali cellule 18. Una volta che tutti i reagenti sono in parte, è anche molto conveniente. Generazione di molte sonde individuali, che possono essere efficacemente riutilizzati, è possibile con po 'di tempo e di investimenti di costo diverso da ottenere i plasmidi che codificano i geni di interesse. Nella nostra esperienza, le sonde possono essere riutilizzati per anni con poca perdita di attività, nonostante le inevitabili piccole diluizioni che vengono con ogni utilizzo. Infine, c'è poco ottimizzazione requirosso quando si utilizza diverse sonde.
La qualità della sintesi sonda è un fattore fondamentale per il successo del protocollo. Ci sono molti modi per verificare la qualità della sonda RNA ma semplicemente eseguendo la sonda RNA su gel TAE è un metodo rapido e facile che è abbastanza affidabile. Usiamo abitualmente bromuro di etidio per macchiare il RNA e che richiede un trattamento speciale e lo smaltimento dei gel dalla maggior parte delle istituzioni. Alternative non tossici sono disponibili in commercio anche se non abbiamo specificamente rispetto quelli per sonde visualizzando. La sonda dovrebbe funzionare come una singola banda, anche se appare un po 'confusa, rispetto al DNA su un gel TAE. Una stima della quantità di RNA può essere ottenuto: una buona reazione avrà circa 1 mg / ml di RNA. Una banda facilmente visualizzati rappresenterà almeno 0,5 mg di RNA e una banda luminosa rappresenterà più di 1 mg. Anche se chiaramente non completamente accurata e che richiedono una certa esperienza, la quantificazione basata sul gel è rapid e la robustezza del procedimento in situ permette di lavorare bene. Se non vi è preoccupazione per la ripetibilità, si può facilmente utilizzare assorbanza UV per quantificare una piccola quantità della reazione di trascrizione, anche se non abbiamo trovato questo per essere una delle principali preoccupazioni. Infine, il gel permette di vedere se il DNA del modello è stato eliminato. Se il gel indica che non vi è RNA, i due spiegazioni probabili sono uno stampo di DNA cattivo o che il buffer di trascrizione non funziona bene. Riscaldamento buffer di trascrizione a 37 ° C e miscelazione prima dell'uso, o l'aggiunta di 1 ml di 100 mM DTT fresca alla reazione di trascrizione può talvolta aiutare con quest'ultimo. Una componente importante del tampone di reazione di trascrizione è spermidina e può precipitare il DNA stampo a basse temperature rendendo riscaldamento del buffer importanti. DTT nel buffer può precipitare significativamente inibendo la reazione. Se un precipitato è visto nel buffer, riscaldare la soluzione evortice vigorosamente. Non vi è alcuna necessità di prendere precauzioni insoliti, come trattare l'acqua con DEPC o autoclave punte e tubi, per prevenire attività RNAse. La presenza dell'inibitore ribonucleasi commerciale fornisce una notevole protezione contro RNasi dall'ambiente. Si noti che altre etichette UTP possono essere utilizzati, come fluoresceina, anche se nella nostra esperienza, l'UTP marcata con digossigenina e combinazione di anticorpi anti-digossigenina fornisce i risultati più coerenti.
Primi protocolli per la generazione di sonde suggeriscono che l'idrolisi alcalina delle sonde sintetizzati dovrebbe essere fatto 4 al fine di consentire una maggiore penetrazione della sonda. Idrolisi della sonda non sembra aiutare con il processo di ibridazione in situ; Sonde RNA superiore a 500 bp di solito danno un segnale e le sonde che sono più di 2 kb di lunghezza anche funzionare bene eccellente. Le sonde più brevi possono funzionare se l'RNA bersaglio è abbondante ma sonde più lunghe daranno bcolorazione Etter. Non sembra essere una chiara vantaggio nell'utilizzo digestione alcalina per rompere sonde più lunghe.
Cura nella manipolazione iniziale di embrioni è molto importante. La rimozione della busta fecondazione è particolarmente utile per gli embrioni dopo la chiusura pieghevole neurale e prima schiusa naturale dalla busta fecondazione. Durante l'allungamento dell'embrione all'interno della busta fecondazione, l'embrione viene arricciato e se fissato in quella posizione, gli embrioni sono più difficili da immagine dopo l'ibridazione in situ. Tuttavia, se gli embrioni vengono rimossi dalla busta concimazione prima del fissaggio, che rapidamente si raddrizzano. Se gli embrioni sono danneggiati durante la rimozione della membrana, permettere loro di guarire la ferita prima di fissaggio perché il tessuto danneggiato può provocare un falso segnale di ibridazione in situ presso il sito della ferita. Se piccolo, le ferite guariscono molto rapidamente, spesso in pochi minuti 19. Fasi successive può anche danneggiare gli embrioni dutrasferimento e così la cura anello liquido è necessaria quando si cambia soluzioni. Danni in primi passi di solito significa che l'embrione sarà gravemente danneggiato dal termine della procedura e delle regioni danneggiate causerà falso in segnali situ alla vista del danno. Inoltre, fino a 30 embrioni possono essere sondati in un singolo flaconcino ma con più embrioni ci sono maggiori probabilità di fondo elevato sviluppo durante la reazione colorimetrica, ma aumentando i lavaggi al giorno 3 o il lavaggio durante la notte può compensare questo.
In questo protocollo, il numero di passi è stato ridotto e l'uso di diversi reagenti comunemente usati è stata eliminata. Si noti che questo protocollo elimina diversi passaggi che vengono utilizzati in molti altri protocolli tra cui una proteinasi K digestione e l'uso di anidride acetica per bloccare gruppi carichi positivamente. Queste operazioni possono essere ancora utile quando guardando embrioni di mammiferi e di uccelli, ma nell'uso Xenopus, eliminando quei passi ha uno scarso impatto on i risultati finali della ibridazione in situ. Il nostro laboratorio non ha stabilito se queste stesse semplificazioni possono essere applicati a protocolli di ibridazione in situ per altre specie. Proteinase K digestione, in particolare, potrebbe essere necessario in altri embrioni, come pulcino o il mouse dove la penetrazione della sonda può avere maggiori limitazioni.
L'uso di BM substrato viola è conveniente e affidabile. Tuttavia, ci sono una serie di altre opzioni disponibili per i precipitanti, supporti alcalini colori necessari per localizzare RNA bersaglio nell'embrione. In particolare, una combinazione di NBT / BCIP è comunemente usato 4 e funziona bene. Alcuni reagenti colore sono solubili in metanolo, in tal caso, l'uso di metanolo dopo colorazione eliminerà la macchia e deve essere evitato. Altre combinazioni di colori possono essere utilizzati anche durante l'esecuzione di doppio in situs. L'uso di una combinazione simile (NBT / BCIP anziché BM viola) è stato anche dimostratodi essere molto robusta utilizzando embrioni di topo 20. Il colore blu della colorazione e il pigmento endogena dell'embrione sono spesso difficili da distinguere chiaramente in immagini. L'uso di embrioni albini anche eliminare pigmento ma la soluzione sbiancante è quasi altrettanto efficace ed è molto più conveniente in quanto non richiede il mantenimento di adulti albini da allevamento. Se la colorazione è relativamente debole, forte sbiancamento può sottolineare che la colorazione. Se la colorazione è forte, lasciando alcuni pigmenti di luce può essere un efficace contrasto e anche aiutare con l'orientamento e messa in scena l'embrione.
Dopo l'ibridazione overnight sonda RNA, il protocollo può divergere dal protocollo rigorosamente manuale descritto qui per l'impiego di un robot ibridazione in situ. L'uso del ibridazione in situ robot salva quasi un giorno intero come Giorno Due e terza giornata del protocollo manuale può essere ridotto ad un giorno come robot lavora tutta la notte und può fare tutte le opportune variazioni di temperatura. Il robot è anche molto consistente nei suoi risultati e consente la simultanea tastatura di molti campioni efficiente. Resta vantaggioso fare il primo giorno a mano come che permette il riutilizzo di sonde e di uso di piccoli volumi di reagente. L'unico svantaggio significativo di utilizzare un robot è il costo iniziale dello strumento.
Questo protocollo illustra alcuni dei modi in modo efficace immagine un ibridazione in situ. E 'importante fare in modo gran parte delle informazioni può essere perso se l'immagine è scarsa. In molti casi, l'imaging in situ dei risultati di un esperimento richiede contemporaneamente l'esperimento iniziale. Alcuni elementi delle variabili di procedura come il grado di sbiancamento hanno un elemento di preferenze personali. Altri effetti imaging possono essere realizzati posizionando il piatto su una base colorata. Spesso una leggera tonalità blu per l'agar può sottolineare il profondo colorazione blu del sit inibridazione u. In poche parole la capsula di Petri contenente l'agar su un foglio di plastica blu per ottenere l'effetto desiderato.
Tuttavia, i metodi descritti qui forniscono una base con cui esplorare le possibilità di imaging. Gli embrioni possono essere visualizzati sia cancellati (fatta trasparente per strutture interne meglio vista) o non liquidati (visto come appaiono in condizioni di luce normali). Alcuni di decisione con riferimento a come l'immagine dell'embrione dipende dal sito di espressione. Se l'espressione è sopra o vicino alla superficie dell'embrione, è meglio immagine dell'embrione senza compensazione. Ci sono molti vantaggi di utilizzare gli embrioni non liquidati. Il processo di compensazione degli embrioni richiede molti passaggi e le sostanze chimiche utilizzate per eliminare gli embrioni sono difficili da gestire. Inoltre, diverse cavità nell'embrione permettono precipitazione di supporti alcalini fosfato che possono causare falsi colorazione cavità. In particolare, la blastocele dei primi embrioni e la pharyncavità GEAL spesso mostrano colorazione (Figura 4). Questa falsa colorazione non è visibile in embrioni che non sono stati cancellati. Per la maggior parte, anche moderatamente espressione profonda può essere visualizzato in embrioni non liquidati, compresi i tessuti mesodermiche come il cuore, i reni, e somiti e Costruzioni endodermici quali tiroide e del fegato. Spostando gli embrioni attraverso una serie di metanolo a uno idrato in PBS per la visualizzazione o mettere in 100% di metanolo per l'archiviazione consente più cicli di stoccaggio e di imaging. Lo stoccaggio metanolo permette di provare diverse modifiche alle immagini nel tempo prolungato.
Ci sono alcuni svantaggi di usare la tecnica di ibridazione in situ a guardare l'espressione genica. I livelli di espressione non sono strettamente quantificabili, anche se il confronto all'interno di un embrione e cambiamenti lordi in espressione e cambiamenti nell'espressione dimensione del dominio di solito sono evidenti. Come con altre tecniche di RNA, ma non fornisce alcuna informazione come to le proteine codificate dal gene di interesse, che può limitare l'interpretazione dei risultati. Infine, è spesso difficile determinare quale possa essere la colorazione di fondo rispetto al dominio espressione vera. Ciò è particolarmente un problema con geni con un pattern di espressione sconosciuta che può essere diffusa. Spesso, una sonda generato dal filamento senso dello stesso gene viene usato come controllo per la colorazione non specifica. L'uso di un controllo filamento senso può fornire alcune informazioni riguardanti un problema con reagenti ma non fornire la prova definitiva che la colorazione basata sulla sonda antisenso è completamente accurato. I risultati di un in situ sono solitamente notevolmente costante di tutti gli embrioni quando si utilizzano più embrioni e questo può essere usato come misura di sicurezza in un pattern di colorazione. Inoltre, diverse sonde antisenso, generati da diverse parti del gene, in particolare le regioni non tradotte, possono essere utilizzati per vedere se danno lo stesso pattern di colorazione. Se lo fanno,ma fornisce anche la fiducia nel pattern di colorazione osservata quando è identico. Sonde diluiti possono essere utilizzati anche con prolungata esposizione alla soluzione colorante per vedere se lo stesso pattern di colorazione emerge. Un fattore che ispira di solito la fiducia in un modello di colorazione è se quel modello corrisponde ad una struttura embrionale specifica. Abbastanza in situs sono ora fatto con una grande varietà di geni che nuovi modelli di espressione potrebbero eventi relativamente rari. Sono state stabilite grandi database di immagini in situ per diversi organismi che possono essere utilizzati per confrontare i risultati di immagine. Per embrioni di Xenopus, Xenbase (www.xenbase.org) è un eccellente esempio di una risorsa che può essere utilizzata per comprendere i modelli di espressione. Altri organismi modello hanno anche simili, ampi database di immagini.
Nonostante questi potenziali avvertimenti, ibridazione in situ rimane uno strumento potente ed affidabile che è estremamente utile perlo studio di organogenesi. E 'probabile che rimanga il metodo di scelta per identificare i tipi di cellule e di esaminare il cambiamento in domini di espressione genica per il prossimo futuro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
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