Protocol
1. Embryo Voorbereiding
- Indien niet routinematig uitgevoerd worden bij embryokweek, de gelei het embryo met 2,5% cysteïne, pH 8,0 vóór fixatie 8. Hoewel het niet absoluut noodzakelijk, is het nuttig om dan handmatig bevruchting envelop te verwijderen voor fixatie met fijne pincet.
- Gebruik glas pasteurpipetten om de embryo's te dragen. De pipet is niet breed genoeg is om over te dragen embryo's dus gebruik een diamant pen om de glazen pipet op een punt dat breed genoeg is om pick-up een embryo te snijden. Elimineer de scherpe randen van de pipetten na het snijden door snel passeren de cut tip door de vlam van een bunsenbrander aan de scherpe randen smelten.
OPMERKING: Zorg moet worden genomen, zoals het glas nog heet genoeg is om brandwonden te veroorzaken kan zijn, ook al lijkt het door visuele inspectie te zijn afgekoeld.
- Gebruik glas pasteurpipetten om de embryo's te dragen. De pipet is niet breed genoeg is om over te dragen embryo's dus gebruik een diamant pen om de glazen pipet op een punt dat breed genoeg is om pick-up een embryo te snijden. Elimineer de scherpe randen van de pipetten na het snijden door snel passeren de cut tip door de vlam van een bunsenbrander aan de scherpe randen smelten.
- Voer de embryo fixatie in fasen. Ten eerste, voor te bereiden glazen flesjes voor gebruik in embryo fixatie. Gebruik deze flacons voor alle stappen inbegrip van de definitieveopslag. Gebruik injectieflacons die helder met een goede Teflon afdichting in het deksel zijn, waardoor de controle embryo's in alle fasen van het proces. Label de vaatjes met geschikte experimentele gegevens met stift en dek de label met doorzichtige tape, als ook permanente marker verloren in de loop van de procedure door het gebruik van alcohol en andere oplosmiddelen.
- Gebruik Mempfa om de embryo's te repareren. Voeg een voorraad van 8% paraformaldehyde in batches van 50-100 ml per keer. Gebruik ongeveer 75% van de benodigde H 2 O en warmte tot 50-60 ° C, die nodig is om de paraformaldehyde in oplossing te krijgen.
LET OP: Deze oplossing is iets anders dan de Memfa gebruikt bij oudere gepubliceerde protocol versies in dat het gebruik maakt van paraformaldehyde in plaats van formaldehyde. - Voeg 2-3 druppels 10N NaOH of totdat de pH is ongeveer 7,5 (gebruik pH-papier om de pH te controleren). Paraformaldehyde is zeer giftig, dus het genereren van de stockoplossing in een zuurkast. Zodra de paraformaldehyde in oplossing, filtreer de oplossing door Whatman papier in een verse kolf en voeg H2O tot het eindvolume. Desgewenst bewaar de paraformaldehyde oplossing bij 4 ° C gedurende 1-2 weken.
- Monteer de overige componenten van de Mempfa fixatie-oplossing (Tabel 1). Ervoor zorgen dat de uiteindelijke werking concentratie van paraformaldehyde is 4%. Bewaar alle onderdelen van het fixatie-oplossing bij 4 ° C als voorraad.
- Met behulp van een geslepen glazen pipet, bevestig de embryo's door toevoeging van de embryo met de gedeclareerde glazen flacons die zijn gevuld met ongeveer 3-4 ml Mempfa oplossing (Tabel 1). Vermijd de vaststelling van meer dan 20-30 embryo's per flacon. Voeg de embryo's met een minimum van vloeistofoverdracht van het embryo medium. Fix embryo Mempfa oplossing 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Voor late endoderm structuren voeren de in situs op handmatig geïsoleerde darm en endoderm derivaten 9,10, Die zorgt voor een goede penetratie van de sonde en vermijdt ook holte kleuring.
- Sla een oplossing van 100% methanol bij -20 ° C. Na paraformaldehyde fixatie, vervangen Mempfa oplossing ongeveer 4 ml van de -20 ° C, 100% methanol voor opslag van embryo's.
- Schud de flesjes na toevoeging van de methanol te voorkomen dat de embryo's kleven aan het glas of ander embryo. Ook, zorg ervoor dat de flesjes zijn goed afgesloten omdat de methanol kan verdampen in de vriezer na verloop van tijd als los.
OPMERKING: Embryo's worden gedurende ten minste één jaar, en waarschijnlijk langer in de methanol vóór kleuring zonder verlies van in situ hybridisatie kwaliteit.
- Gebruik Mempfa om de embryo's te repareren. Voeg een voorraad van 8% paraformaldehyde in batches van 50-100 ml per keer. Gebruik ongeveer 75% van de benodigde H 2 O en warmte tot 50-60 ° C, die nodig is om de paraformaldehyde in oplossing te krijgen.
2. Probe Voorbereiding
- Gebruik 1-2 ug matrijs DNA de digoxigenine gelabelde probes maken. Knip plasmide bevattende de geschikte DNA-sequentie aan het einde van het gen van belang met een beperking van de 5 'enzym geschikt voor that vector antisense probes genereren.
Opmerking: Het plasmide zou een geschikte RNA polymerase bindingsplaats (bijvoorbeeld T7, T3 of SP6) hebben. - Laat het DNA, water, NTP mix en polymerase buffer opwarmen tot kamertemperatuur vóór het monteren van de sonde synthesereactie. Voeg de componenten van de RNA-synthese reactie op een 1,5 ml microcentrifugebuis in de volgorde zoals vermeld in tabel 2. Stel het volume water toegevoegd om het totale volume van de sonde synthesereactie 20 ui te brengen. Monteer de reactie bij kamertemperatuur omdat componenten van de polymerasebuffer het matrijs-DNA als in hoge concentraties en koude precipiteren.
- Incubeer de transcriptie reactie gedurende 2 uur bij 37 ° C.
OPMERKING: Incubaties van iets langer dan twee uur leidt tot geen nadelige effecten, maar ook tonen weinig verhoogde opbrengst. Als gedurende één uur, wordt de opbrengst verminderd maar nog steeds voldoende om een goede probe te maken.- In afwachting van de transcriptie reactie tot einde, maken een agarosegel die wordt gebruikt om de kwaliteit van de probe testen. Smelt 1 ug agarose in 100 ml 1 x TAE buffer (zie tabel 1) van de oplossing te verwarmen tot het kookpunt. Verwijder de oplossing van het vuur wanneer de agar poeder volledig is opgelost.
- Voeg 2 pi ethidiumbromide voorraadoplossing (10 mg / ml) tot ongeveer 100 ml agarose gel als de agarose afgekoeld tot ongeveer 60 ° C tot visualisatie van RNA onder ultraviolet (UV) licht binnen te laten.
OPMERKING: Deze agarosegel oplossing kan in een 60 ° C incubator worden gehouden, zodat toekomstige gels kunnen worden gegoten zonder herhaald smelten. Wees voorzichtig bij het gebruik van ethidiumbromide vanwege mogelijke toxiciteit.
- Voeg 1 ul DNAsel (RNAse vrij kwaliteit) om de transcriptie reactie na 2 uur incubatie en incubeer nogmaals 10 min bij 37 ° C om matrijs-DNA te elimineren.
- Verwijder 1 pl van het reactiemengsel teControleer op 1% agarose TAE-gel en de rest (20 ul) voeg 80 ul van 1% SDS in TE buffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), 10 pl 5 M NH4-acetaat en 220 gl koude ethanol. Vortex de mix krachtig en zet apart op ijs totdat de resultaten van het RNA kwaliteitscontrole zijn bekend.
- Run 1 pl RNA verwijderd voordat neerslaan op 1% agarose TAE-gel. Het laden op de gel te verlichten, voeg 4-5 ul water en 1 pl standaard laadkleurstof het RNA. Bekijk het RNA op de gel met UV licht transilluminator teneinde de kwaliteit van de probe controleren (zie bespreking).
- Neerslaan van de resterende RNA dat was gereserveerd op ijs in stap 2.5 door het draaien in een microcentrifuge op volle snelheid gedurende 10 tot 15 minuten. Trekken uit de bovenstaande vloeistof met een uitgesponnen glazen pipet en laat het even drogen.
- Resuspendeer de sonde met 1 ml van RNA hybridisatie buffer (tabel 1) in eppendorf buis. Vortex en briefly verwarming weer de buis tot 37 ° C en vortex. Breng de probe-oplossing om een 15 ml schroefdop polystyreen buis en vul tot 7-10 ml met RNA hybridisatie buffer. Opmerking: De sonde kan verder worden verdund (een 10-voudige verdere verdunning kan nog steeds werken), wat vaak resulteert in lage achtergrond, maar de vlekken reacties zal ook langer duren.
3. In situ hybridisatie
- Neem de embryo's die werden opgeslagen in -20 ° C methanol en laat opwarmen tot kamertemperatuur. Voer de gehele procedure in glazen flesjes. Als verschillende embryo's van de ene groep gaat op om bekeken te worden door verschillende sondes, bewaar ze in een enkele flacon tot net voor de sondes worden toegevoegd aan variabiliteit en arbeid te verlagen op de eerste dag.
- Hydrateren het embryo door een methanol reeks zoals aangegeven in tabel 3 (zie Tabel 1 voor wassen recepten) ter voorbereiding toevoeging van de probe. Zwenk de embryos na elke wijziging om ervoor te zorgen dat ze niet vast te houden aan de zijkanten of met elkaar, en rock de embryo's door het monteren van de injectieflacons op een nutator. Bij het overbrengen van de vloeistoffen, controleer dan de binnenkant van de kappen om ervoor te zorgen dat de embryo's niet zijn er gevangen.
- Eenmaal in de probe oplossing, hybridiseren de embryo's nachts zoals beschreven in Tabel 3.
- Verwijder de probe oplossing. Sla de gebruikte probe door opslag in een 15 ml schroefdop polystyreen buis, gemarkeerd met datum en het aantal keren dat de probe is gebruikt, bij -20 ° C.
OPMERKING: Dezelfde sonde kan vele malen worden hergebruikt voor de daaropvolgende in situ hybridisatie, totdat de colorimetrische reacties beginnen om een abnormaal lange tijd te nemen om de gewenste intensiteit te bereiken.- Zodra de sonde verwijderd, bereid de embryo's voor antilichaamkleuring tegen de sonde door de reeks wassingen opgesomd in tabel 4. Wijzig de temperatuur vereist (tabel 4) door verplaatsing thij nutator met injectieflacons embryo gevoegd, direct in hybridisatie ovens die zijn ingesteld op de juiste temperatuur.
- Vul het geschikte volume van de MAB + HTSS + BR + anti-Dig antilichaam (Tabel 4) op het moment dat het embryo worden geïncubeerd in de MAB + HTSS + BR blokkeeroplossing zodat het antilichaam voorafgaand geblokkeerd aan het toevoegen aan de embryo. Maak de blokkerende oplossingen vers op de dag van gebruik.
- Verwijder de antilichaamoplossing en beginnen wast zoals in Tabel 5 na overnacht incubatie met antilichaam. Voer minstens twaalf 30 min wassingen in voorbereiding op kleuring met alkalische fosfatase substraat en achtergrondgeluid zoveel mogelijk. Gebruik ofwel MAB buffer of TBT-oplossing (tabel 1) voor de stappen wassen.
OPMERKING: TBT oplossing is TTW dat 2 mg heeft / ml BSA toegevoegd.- Vervang de laatste wasbeurt oplossing met de BM Purple alkalische fosfatase substraat. Voer de kleuring reactie bij ofwel kamertemperatuur of 37 ° C.
OPMERKING: Kleuring is sneller bij 37 ° C maar als nacht staan, kunnen ongewenste achtergrondkleuring vaak resultaat. De kleuring reacties zullen vereisen vaak 's nachts vlekken en kamertemperatuur is het veiligst voor dit. - Als verdere kleuring wordt vereist en de BM paarse oplossing neemt op een blauwe kleur, vervang de kleuring met een fris BM Purple en zet de buizen in 37 ° C. Als het doel-mRNA is zeer overvloedig, zet de embryo's in de kleuroplossing bij 4 ° C geïncubeerd en vervolgens naar de embryo kamertemperatuur of 37 ° C een betere controle van de kleuringsreactie mogelijk.
- Nieuwe reacties voorzichtig, als de tijd tot eindresultaat verschilt aanzienlijk tussen de verschillende doelgroepen RNA's. Voor de consistentie, stop de kleuringsreactie (zie 3.4) als er geen nieuwe sites van meningsuiting die voortvloeien met langere incubatietijd. Belangrijk, indien in situ hybridisatie wordt gebruikt als een assayvoor experimenten te kijken naar verschillende behandelgroepen, gebruiken dezelfde tijd voor kleur reacties tussen behandeling en controle embryo's.
- Vervang de laatste wasbeurt oplossing met de BM Purple alkalische fosfatase substraat. Voer de kleuring reactie bij ofwel kamertemperatuur of 37 ° C.
- Stop de kleuringsreactie en voorbereiden van de embryo's voor opslag en beeldopname door het veranderen van de vloeistoffen zoals aangegeven in tabel 6. Niet rocken het embryo in dit stadium, omdat het verwijderen van de vlek kan worden gevisualiseerd als paarse verkleuring van de methanol rond de embryo's.
OPMERKING: Vaak embryo een lichtblauwe kleuring van de kleuroplossing en koude methanol kan ten minste gedeeltelijk verwijderen dat, hoewel dit niet voldoende om zware achtergrond of holte vlekken verwijderen. Koud methanol verwijst naar methanol die wordt bijgehouden in een -20 ° C vriezer.- Rehydrateren de embryo's en bevestig de vlek met Mempfa (Tabel 6). Eenmaal bevestigd, verwijder de Mempfa en was de embryo's met 25% methanol.
- Verwijder de 25% methanol en voeg de blekende oplossing als verwijdering van endogeen pigmentis vereist. Wees voorzichtig bij het hanteren van de bleken oplossing als het brandwonden kan veroorzaken. Neem het bleken dicht het gebeurt relatief snel en de mate van bleken kan worden gevarieerd voor verschillende effecten (Figuur 2).
- Dehydrateer embryo door methanol reeks 100% methanol voor langdurige opslag na bleken of plaatsing PBS voor de korte termijn opslag en latere beeldvorming (zie tabel 6).
4. Imaging Embryo's
- Zodra een embryo de kleuring proces is voltooid, afbeelding het embryo, zodat de informatie over waar het gen van belang wordt uitgedrukt wordt vastgelegd voor een breder publiek. Gebruik 1% agarose als achtergrond aan niet-afgehandelde embryo's te bekijken.
OPMERKING: De agarose geeft een blauw / grijze achtergrond die goed contrasteert met de embryo en de blauwe kleur van de kleuringsreactie. Het helpt ook diffuus storende schaduwen en reflecties die de aandacht afleiden van het embryo.- Voeg agarose aan water en breng aan de kook totdat de agarose is opgelost en laat afkoelen tot 50 voordat gieten in de petrischaal. Zoals bij de TAE gel oplossing bewaar de agarose oplossing 55 ° C incubator voor meerdere doeleinden. Giet de agarose tot een diepte van ongeveer 2 mm in de petrischaal. Indien nodig, pas de diepte van agarose om een iets anders tint van de achtergrond opleveren.
- Na rehydratie van opslag in methanol aan een waterige oplossing (PBS of TTW), met methanol serie, plaatst de embryo's in een petrischaal met agarose basis (zie tabel 6). Bewaar de oplossing schoon en, indien nodig, gebruik maken van eenvoudige filtering tot kleine deeltjes die de schone achtergrond van goede beelden kunnen verstoren te elimineren.
- Om het beeld van de embryo's van alternatieve opvattingen, zoals van de buikzijde, snijd dunne kanalen in de agarose om het embryo te passen met behulp van fijne tang en plaats de embryo's in die kanalen voor oriëntatie (Figuur 3 OPMERKING: De meeste fasen hebben een karakteristieke positie die zij nemen wanneer geplaatst in oplossing. Bijvoorbeeld, blastula-stadium embryo's hebben de neiging om dierlijke kant gaan zitten. Zodra de embryo's beginnen te verlengen, leggen ze aan hun kant.
- Gebruik de glasvezel lichtbron om het embryo te verlichten van een kleine hoek, het creëren van schaduwen op het embryo die diepte geven aan het imago en helpen onderscheiden oppervlaktestructuren. Omdat bleken pigment dat nuttig bezienswaardigheden biedt, kan elimineren gebruiken shadowing voor sterk gebleekt embryo's.
- Schakel de embryo afbeelding kleuring die diep in het embryo, zoals in de notochord, long of gebieden van de hersenen (figuur 4). Hiertoe zet het embryo door een methanol serie tot 100% methanol.
- Na volledige onderdompeling in methanol, breng de embryo's een oplossing van een deel benzylalcohol en twee delen benzylnzoate (BABB). De embryo zal aanvankelijk drijven op het oppervlak, maar als methanol mengt met de BABB, zullen ze zinken in de BABB. Voeren elke stap omgaan met BABB in glazen flesjes of schotels; BABB zal geen plastic of verf smelten.
- Eenmaal gewist, bekijk de embryo's met doorgelaten licht van beneden komt het embryo. De intensiteit van het licht en de hoek van onder naar contrast te verbeteren en de beste kleur.
- Bij het bekijken ontruimd embryo heffen het glas petrischaal van de basis af. Dit doe je door simpelweg met behulp van twee andere petrischaal deksels op te trekken, zodat de regio van de schotel met embryo's wordt verhoogd.
LET OP: Dit heeft het voordeel van het nemen van de basis uit van focus en het elimineren van storende effecten van onvolkomenheden of vlekken op de microscoop basis die kunnen interfereren met de afbeelding.
5. Dubbelklik in situ hybridisatie
- Om tegelijkertijd te bekijken het expressiepatroon van two verschillende genen in een embryo, synthetiseren twee sondes, één voor elk van de verschillende genen. Samenstel een probe met DIG-11-UTP als label zoals hierboven beschreven. Verdun het product van de transcriptie reactie in RNA hybridisatie buffer tot een meer geconcentreerde 3x probe opleveren dan voor een enkele in situ hybridisaties.
- Samenstel de andere probe plaats met hetzelfde protocol als voor DIG gemerkte gesondeerd met uitzondering fluoresceïne-12-UTP worden vervangen DIG-11-UTP. Verdun het product van de transcriptie reactie in RNA hybridisatie buffer tot een meer geconcentreerde 3x probe opleveren dan voor een enkele in situ hybridisaties.
- Meng de twee geconcentreerde probes in een 1: 1 verhouding. Voor het beste resultaat, gebruik dan de fluoresceïne-gelabelde probe voor het gen dat de sterkste uitdrukking in de single in situ hybridisatie protocol laat zien.
- Gebruik hetzelfde in situ hybridisatie protocol beschreven voor de enkele in situ </ Em> hybridisaties, behalve gebruikt een dubbele sonde (probe die de 1,5x geconcentreerde mengsel van digoxigenine-gelabelde en fluoresceïne-gelabelde probes) aan het einde van de eerste dag in plaats van een in situ hybridisatie probe.
- Volg de enkele hybridisatie protocol op de tweede dag van de dubbele in situ hybridisatie protocol, met uitzondering van het gebruik van anti-fluoresceïne-AP Fab fragmenten bij een 1: 4000 verdunning in plaats van anti-DIG-AP Fab-fragmenten. Spoel de overtollige antilichaam uit het embryo als in de single in situ-protocol en het uitvoeren van de eerste kleur reactie met behulp van de BM-Purple AP substraat.
- Na de eerste kleurreactie, inactiveren de flourescein antilichaam in 0,1 M glycine pH 2,0 gedurende 40 min gevolgd door vijf tien minuten wassingen in MAB. Blokkeer de embryo MAB + HTSS + BR 90 min. Voeg de anti-DIG antilichaam bij een 1: 2000 verdunning in MAB + HTSS + BR en incuberen bij 4 ° C overnacht.
- De volgende dag was de embryo thoroughly in MAB (12 wasbeurten van 30 min) om de overmaat antilichaam te verwijderen.
- Was de embryo's gedurende 10 minuten in AP-buffer (Tabel 1) en vervolgens kleuren met BCIP (0,5 mg / ml AP-buffer).
OPMERKING: De in situ combinatie zou een donker blauwpaarse kleuring voor de eerste kleurreactie en een lichtblauwe kleur reactie voor het tweede (figuur 5) werd verkregen. - Stop de uiteindelijke kleur reactie door het verwijderen van de AP-buffer en spoel drie keer met MAB. Bevestig de embryo's met Mempfa gedurende 10 min. Was de embryo's met 5 snelle wasbeurten in MAB of TBT.
- Met deze kleurencombinatie, het gebruik van methanol in de post kleuring behandelingen niet meer mogelijk, omdat de BCIP alleen kleur elimineren. Bewaar de embryo na kleuren en fixeren in PBS met 0,02% natriumazide. Kleuringsintensiteit kan zwak met dubbele in situs zijn. Indien dit een probleem is, verminderen de wassingen vier, elk van 2 uur duren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gebruik van weefselspecifieke probes uitstekende informatie met betrekking tot de stand van de specifieke organen. In de volgende voorbeelden wordt de stap van het embryo op basis van Nieuwkoop en Faber stagingtabel 11. Gebruikt men probes vorm genen tot expressie na differentiatie, cardiaal troponine I in stadium 28-30, bijvoorbeeld (figuur 1C), de aanwezigheid of de grootte van een gedifferentieerde orgaan kan worden beoordeeld in elk stadium na differentiatie. Jaren geleden, embryologen in staat waren om een dergelijke analyse te doen op basis van opmerkelijke kennis van de histologie van het vroege embryo 12,13 maar dat deskundigheid is grotendeels verloren aan de huidige generatie embryologen. Hoewel, kan het verlies van deze deskundigheid jammer worden beschouwd, de betrouwbaarheid en gebruiksgemak van in situ hybridisatietechnieken maakt identificatie van specifieke weefsels beschikbaar voor elke onderzoeker. Weefsels die relatief onopvallend, thij broedeieren klier in embryonale stadium 25 bijvoorbeeld (figuur 1A), kunnen levendig worden gekleurd met in situs zonder specifieke antilichamen of histologische technieken (figuur 1C). Ook het gebruik van hele mount in situs maakt het mogelijk om het gehele orgaan in de context van het hele embryo bekijken in plaats van te vertrouwen op gevolgtrekking histologische secties (figuur 2). Zelfs weefsels die diep in het embryo, waaronder de optische steel (figuur 4) zijn kunnen eenvoudig worden bekeken en het gebruik van embryo clearing kunnen scherpe afbakening van het orgel grenzen bieden.
Bleken van embryo tot endogene pigment te verwijderen met behulp van peroxide-oplossingen heeft grotendeels geëlimineerd de eis voor het gebruik van albino embryo's die pigment missen. Bleken voor verschillende tijden kan nuttig zijn. Als bijvoorbeeld de vlek sterk, een lichtere bleken waarmee sommige pigmentatie zichtbaar kan nuttig zijn omdat allesows betere stagering en oriëntatie van het embryo (Figuur 2A). Als de vlek is een gebied waar er hoge pigmentatie, zoals de nier (figuur 2B), vrijwel volledige eliminatie van het pigment door langere incubatie in bleeksop een beter resultaat geeft.
Embryo's hebben de neiging tot het nemen van bepaalde posities als in oplossing. Na neurulatie, hebben ze de neiging om plat op hun kant. Dit is prima voor beelden van de flank (figuur 2B), maar kan een probleem zijn met andere gebieden. Het gebruik van een agarose base kan men kanaal gesneden in de agarose die kunnen worden gebruikt om de embryo's te oriënteren. Bijvoorbeeld, bloed voorlopers gelokaliseerd aan de ventrale zijde van het embryo (Figuur 2A) en de volledige omvang van de kleuring is moeilijk te observeren. Plaatsing van het embryo in een kanaal met de ventrale zijde naar boven, dan maakt volledige weergave van dat genexpressie patroon (figuur 3A). Het gebruik van dubbele in situ hybridisatie kan de relatie tussen twee genexpressiepatronen in een organisme (figuur 5) waardoor de noodzaak vergelijken tussen verschillende embryo dat kleine verschillen in morfologie kunnen hebben vertonen. Het belangrijkste is misschien het gebruik van in situ hybridisatie geeft men de mogelijkheid geëtiketteerd cellen voor histologische differentiatie duidelijk gebaseerd op de expressie van genen die tot expressie in vroege voorlopers van een lijn, zoals pax2 die wordt uitgedrukt in veel weefsels in het vroege embryo vóór differentiatie (figuur 4A). De mogelijkheid om voorlopers en weefsels die niet duidelijk onderscheiden op basis histologie, zoals myeloïde cel precursors (figuur 1B) te identificeren, heeft toegestaan onderzoekers meer gedetailleerde vragen over de toestand van ontwikkeling een orgaan te vragen en om de resultaten van experimentele evaluatie manipulation ontworpen om ectopische differentiatie van weefsel.
Figuur 1:. Voorbeelden van de gehele mount in situ hybridisatie op Xenopus embryo De blauwkleuring van een in situ hybridisatie-experiment af te bakenen ontwikkelen structuren van de vroege Xenopus embryo (A) een anterieur aanzicht van een fase 26 embryo benadrukken het uitkomen klier. zoals afgebakend door de expressie van uvs.2 14 (B) Een ventrale weergave van een embryo's waarop de locatie van de vroege myeloïde cellen in stadium 20 met behulp van de uitdrukking van myeloperoxidase- 15 als een marker (C) De vroege hart in fase 28.. - 30 wordt gevisualiseerd door de expressie van cardiaal troponine I 16. Een duidelijk voordeel van deze methode is dat alledeze genexpressie patronen werden gevisualiseerd met behulp van verschillende sondes, maar het protocol dat gebruikt wordt is gelijk in alle gevallen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Verschillende niveaus bleken kan worden gebruikt voor kleuring zichtbaar in het embryo (A) Dit blauwe kleuring langs de bodem van deze embryo toont de expressie van hemoglobine in het ventrale bloedeilandjes ongeveer stadium 36. Dit is een gebied van de. embryo dat slechts licht gepigmenteerd en derhalve het embryo niet gebleekt lange tijd kan worden gezien door de bruin gekleurde pigment in het oog en langs de flank van de embryo. In staat zijn om de pigmentatie zien zorgt voor een betere visualisatie van het stadium van het embryo. Indien kleuring in een gebied met grotere natuurlijke pigmentatie, zoals het zenuwstelsel en de flank van het embryo zal meer bleken te bekijken in situ zoals in B. (B) Hier de expressie van PAX8 chromosomale 17 in de vormende nier , pronephric kanaal en achterhersenen is het best zichtbaar gemaakt na het bleken bijna alle endogene pigment heeft verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Manipulatie van de agarose base kan helpen bij de oriëntatie van de embryo Imaging specifieke gebieden van het embryo kan moeilijk zijn omdat ze nemen vaak bepaalde plaatsen in de schaal (A) op kikkervisje fasen het embryo op zijn kant ligt.. . Door cutting een prima kanaal in de agarose (zwarte pijlen) het embryo kan worden bekeken vanuit de buikzijde, hier tonen hemoglobine uitdrukking in fase 36, met voldoende stabiliteit om een goede foto te maken. (B) Dit ventrale uitzicht op de hand1 expressie op het podium 20 schetst de laterale plaat mesoderm 6. Het embryo wordt geplaatst in een klein gat dat zijn standpunt met de ventrale zijde naar boven gestabiliseerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4:. Interne organen kan men zowel in ondoorzichtige, vereffende en gewist embryo in een afgehandelde embryo gekleurd pax2 in stadium 34 (A), de optische steel (gele pijl) relatief gemakkelijk gevisualiseerdnet als de vlekken langs de neurale buis. Echter, de details zijn niet scherp. Bij de goedkeuring van het embryo (B) de grenzen van meningsuiting sites, met inbegrip van de optische stengel (gele pijl) zijn scherper. De mate van clearing blijkt uit het vermogen zowel ogen in deze gewist embryo. Merk ook op dat sommige vlekken heeft verzameld in de interne holtes (paarse pijl), een veelvoorkomend probleem bij het bekijken gewist embryo's.
Figuur 5:. Een vertegenwoordiger dubbel in situ hybridisatie op een Xenopus embryo Expressie van het laterale plaat marker, hand1, wordt gevisualiseerd door de licht blauwe vlekken in fase 26. Expressie van etv2 binnen de zich ontwikkelende vaatstelsel wordt gevisualiseerd door donkerblauw paarse vlek. Expressie van hand1 is meestal zeer intens en dus het werd gebruikt voor thij zwakker fluoresceïne-gelabelde probe en BVIE combinatie. De gebruikte de digoxigenine gemerkte probe en BM-paarse combinatie voor de zwakkere etv2 expressie.
| Naam | Eindconcentratie | Bedrag / 100 ml |
| Mempfa | 1 mM MgSO4 | 100 ul 1 M MgSO4 |
| (Bewaar bij 4 ° C) | 2 mM EGTA, pH 8,0 | 10 ml van 20 mM EGTA, pH 8,0 |
| 0,1 M MOPS, pH 7,5 | 10 ml 1 M MOPS, pH 7,5 | |
| 4% paraformaldehyde, pH 7,5 | 50 ml 8% paraformaldehyde, pH 7,5 | |
| TTW | 50 mM Tris, pH 7,4 | 5 ml van 1 M Tris, pH 7,4 |
| 200 mM NaCl | 4 ml van 5 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 ul Tween 20 | |
| 100X Denhardt Solution | 2% BSA | 2 g BSA |
| (Filteren door middel van 0,2 um filter, | 2% PVP-40 | 2 g PVP-40 |
| bewaar bij -20 ° C) | 2% Ficoll 400 | 2 g Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M NaCl | 17,5 g NaCl |
| 300 mM trinatriumcitraat | 8,8 g trinatriumcitraat | |
| RNA Hybridization Buffer | 50% formamide | 50 ml 100% formamide |
| (Bewaar bij 4 ° C) | 5x SSC | 25 ml van 20x SSC |
| 1 mg / ml gist-RNA | 4 ml van 1 mg / ml gist RNA opgelost in 50% formamide | |
| 1X Denhardt Solution | 1 ml van 100x Denhardt Solution | |
| 0,1% Tween 20 | 100 ul Tween 20 | |
| 5 mM EDTA, pH 8,0 | 1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 | |
| MAB | 100 mM maleïnezuur | 1,16 g maleïnezuur |
| (PH 7,5, bewaar bij 4 ° C) | 150 mM NaCl | 0,88 g NaCl |
| MAB + HTSS + BR | 100 mM maleïnezuur | 96 ml MAB |
| 4% warmte behandeld schaap Serum | 4 ml warmte behandelde schapen Serum (warmte behandeld bij 55 ° C gedurende 30 minuten en hoeveelheden verdeeld) | |
| 2% blokkeringsreagens | 2 g Roche Blocking Reagent | |
| MAB + HTSS + BR + anti-Dig antilichaam | 100 mM maleïnezuur | 96 ml MAB |
| 4% warmte Trat 's avonds Schapen Serum | 4 ml Warmte behandeld Schapen Serum | |
| 2% blokkeringsreagens | 2 g Roche Blocking Reagent | |
| 1: 10,000 Anti-Dig-AP, Fab Fragmenten Antibody | 1.5 gl anti-digoxygenine-AP, Fab fragmenten Antibody | |
| Alkalische fosfatase (AP) Buffer | 100 mM Tris, pH 9,5 | 10 ml 1 M Tris, pH 9,5 |
| 50 mM MgCl2 | 5 ml van 1 M MgCl2 | |
| 100 mM NaCl | 2,5 ml 4 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 ul Tween 20 | |
| Bleeksop | 0.3% H 2 O 2 | 3,34 ml 30% H 2 O 2 |
| 5% formamide | 5 ml 100% formamide | |
| 0,5% SSC | 2,5 ml 20x SSC | |
| Clearing Solution | 1/3 Benzylalcohol | 33 ml |
| 2/3 Benzylbenzoaat | 67 ml |
Tabel 1: Oplossing Recepten
| Naam | Bedrag |
| Dig-NTP Mix | 5 pl van 20 mM CTP |
| (40 pi reactie) | 5 pl van 20 mM GTP |
| 5 pl van 20 mM ATP | |
| 3.25 ui 20 mM UTP | |
| 3,5 gl 10 mM Dig-11-UTP | |
| 18.25 pi gedistilleerd, geautoclaveerd water | |
| Sonde Synthese | x pl matrijs-DNA(Afhankelijk van de concentratie) |
| (20 pl reactie) | x pi gedestilleerd, geautoclaveerd water |
| 4 ui van Dig-NTP mix | |
| 0.5 gl RNAse inhibitor | |
| 2 ui 10X RNA polymerase buffer | |
| 2 pl RNA polymerase |
Tabel 2: Probe Synthese Recepten
| Naam van het serum | Geschatte Volume | Duur | Temperatuur |
| 100% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 50% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| TTW | 2 ml | 10 min, rockende | Kamertemperatuur |
| TTW | 2 ml | 10 min, rockende | Kamertemperatuur |
| TTW | 2 ml | 10 min, rockende | Kamertemperatuur |
| Voorverwarmen RNA Hybridization Buffer en Probe tot 65 ° C | |||
| TTW | 4 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| TTW | 4 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| RNA Hybridization Buffer | 2 ml | 10 min, rockende | Kamer Temperatuure |
| Voorverwarmde RNA Hybridization Buffer | 2 ml | 1 uur, rockende | 65 ° C |
| Probe Oplossing | 1 ml | 'S nachts, rockende | 65 ° C |
Tabel 3: Stappen voor de eerste dag van de in situ hybridisatie protocol (ongeveer 3 uur in totaal)
| Naam van het serum | Geschatte Volume | Duur | Temperatuur | ||||
| Voorverwarmen RNA Hybridization Buffer en 02.x SSC bij 65 ° C en 2x SSC bij 37 ° C | |||||||
| Terug sonde oplossing voor de buis voor meervoudig gebruik | |||||||
| RNA Hybridization Buffer | 2 ml | 10 min, rockende | 65 ° C | 2X SSC | 2 ml | 20 min, rockende | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 ml | 20 min, rockende | 37 ° C | ||||
| 0,2 x SSC | 4 ml | 1 uur, rockende | 65 ° C | ||||
| 0,2 x SSC | 4 ml | 1 uur, rockende | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1.5 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur | ||||
| MAB + HTSS + BR + anti-DIG antilichaam | 1.5 ml | 'S nachts, rockende | 4 ° C |
Tabel 4: Stappen voor de tweede dag van In Situ Hybridisatie Protocol (ongeveer 4 uur in totaal)
| Naam van het serum | Geschatte Volume | Duur | Temperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| BM Purple AP Ondergrond | 500-750 pi | 'S nachts, schommelen (zie tekst) | Kamertemperatuur / 37 ° C (zie tekst) |
Tabel 5: Stappen voor de derde dag van de in situ hybridisatie protocol (ongeveer 7 uur)
| Naam van het serum | Geschatte Volume | Duur | Temperatuur |
| 25% Methanol | 2 ml 5 min, rockende | Kamertemperatuur | |
| 50% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 100% Methanol (koud) | 2 ml | 20 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 100% Methanol (koud) | 2 ml | Verschilt, geen rockende | Kamertemperatuur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 50% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| Mempfa | 2 ml | 30 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| Bleeksop | 4 ml | 40 min-3 uur, schommelstoel | Kamertemperatuur / 37 ° C (zie tekst) |
| Opslaan van embryo's | |||
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 50% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 100% Methanol | 4 ml | Bewaren bij -20 ° C | |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, rockende | Kamertemperatuur |
Tabel 6: Stappen voor het stoppen van in situ hybridisatie, bleken en opslag van embryo's
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het vermogen om te gebruiken in situ hybridisatie met het expressiepatroon van specifieke genen zichtbaar blijft de meest gebruikte methode om specifieke organen of celtypen in het Xenopus embryo identificeren. Dit is wegens verscheidene voordelen van deze techniek. De expressie van een gen kan specifieke structuren te identificeren goed voordat een histologische tekenen van differentiatie, zoals het geval is voor Nkx2.5 expressie in het hart voorouders voorafgaand aan een duidelijke afbakening van die cellen 18. Zodra alle reagentia in de hand, het is ook zeer kosteneffectief. Generatie van veel individuele probes, die effectief kan worden gebruikt, is mogelijk met weinig extra tijd en investeringskosten dan verkrijgen plasmiden die de genen van belang coderen. In onze ervaring, kunnen sondes worden hergebruikt voor de komende jaren met weinig verlies van activiteit, ondanks de onvermijdelijke kleine verdunningen die bij elk gebruik. Tot slot is er weinig optimalisatie requirood bij het gebruik van verschillende sondes.
De kwaliteit van de probe synthese is een belangrijke factor in het succes van het protocol. Er zijn vele manieren om de kwaliteit van de RNA probe controleren maar gewoon lopen de RNA probe een TAE gel is een snelle en eenvoudige methode is betrouwbaar. Wij gebruiken routinematig ethidiumbromide aan het RNA vlekken en die speciale behandeling en verwijdering van de gels door de meeste instellingen vereist. Niet-toxische alternatieven zijn commercieel beschikbaar, hoewel we niet specifiek vergeleken die voor het visualiseren probes. De sonde moet draaien als een enkele band, hoewel het zal lijken enigszins wazig vergeleken met het DNA op een TAE gel. Een schatting van de hoeveelheid RNA kan worden verkregen: een goede reactie wordt ongeveer 1 ug / ul van RNA. Een gemakkelijk gevisualiseerd band zal ten minste 0,5 ug van RNA te vertegenwoordigen en een heldere band zal meer dan 1 ug vertegenwoordigen. Hoewel het duidelijk niet helemaal accuraat en vereist enige ervaring, kwantificering op basis van de gel is rapid en de robuustheid van de in situ procedure kunnen goed werken. Als er bezorgdheid over de herhaalbaarheid, kan men gemakkelijk gebruik maken van UV-absorptie van een kleine hoeveelheid van de transcriptie reactie te kwantificeren, maar we hebben niet gevonden dat dit een groot probleem zijn. Tenslotte, de gel kan men zien dat het template DNA geëlimineerd. Als de gel geeft aan dat er geen RNA, de twee meest waarschijnlijke verklaringen slechte DNA matrijs of dat de transcriptie buffer niet goed werkt. Verwarmen van de transcriptie buffer tot 37 ° C en grondig mengen vóór gebruik of toevoeging van 1 pi vers 100 mM DTT om de transcriptie reactie kan soms helpen met de laatste. Een belangrijk onderdeel van de transcriptie reactie buffer spermidine en kan de DNA-matrijs bij lage temperaturen waardoor opwarming van de buffer belangrijke precipiteren. DTT in de buffer kan ook aanzienlijk neerslaan remmen van de reactie. Als er een neerslag wordt gezien in de buffer, warm de oplossing envortex krachtig. Er is geen noodzaak tot eventuele bijzondere voorzorgen, zoals het behandelen van het water met DEPC of autoclaveren tips en pijpen met RNAse activiteit. De aanwezigheid van het commerciële ribonuclease inhibitor aanzienlijke bescherming tegen RNAses uit de omgeving. Merk op dat andere UTP labels kunnen worden gebruikt, zoals fluoresceïne, hoewel onze ervaring, de digoxigenine gelabelde UTP en anti-digoxigenine antilichaam combinatie geeft de meest consistente resultaten.
Vroege protocollen probe generatie suggereren dat alkalische hydrolyse van de gesynthetiseerde probes 4 moet worden gedaan zodat grotere sondepenetratie. Hydrolyse van de sonde niet lijkt te helpen bij de in situ hybridisatie proces; RNA probes groter dan 500 bp geven meestal een uitstekende signaal en probes die langer zijn dan 2 kb in lengte goed werken. Kortere probes kan werken als het doel RNA is er in overvloed, maar langere probes zal b gevenetter kleuring. Er lijkt geen duidelijke voordelen in het gebruik van alkaline spijsvertering te breken langere probes.
Zorg in de eerste behandeling van het embryo is heel belangrijk. Verwijdering van de bevruchting envelop is vooral nuttig voor het embryo na neurale vouw sluiting en voorafgaand aan natuurlijke uitkomen uit de bevruchting envelop. Tijdens elongatie van het embryo in de bevruchting envelop, wordt het embryo gekrulde en als vaste in die positie, de embryo's moeilijker beeld na de in situ hybridisatie. Indien de embryo's verwijderd uit de bevruchting omhulling voor fixatie, ze snel rechtzetten. Wanneer embryo's zijn beschadigd tijdens membraan verwijderen, zodat zij de wond voor fixatie genezen omdat beschadigd weefsel kan resulteren in een vals in situ hybridisatie signaal op de wond. Als klein, de wonden te helen zeer snel, vaak binnen enkele minuten 19. Later stappen kunnen ook schade de embryo during vloeibare overdracht en dus zorg nodig is bij het wisselen van oplossingen. Schade in de vroege stappen betekent meestal dat het embryo zwaar zal worden beschadigd door het einde van de procedure en de beschadigde gebieden zullen valse in situ signalen veroorzaken bij het zien van de schade. Bovendien kunnen tot 30 embryo's worden gesondeerd per injectieflacon maar meer embryo er grotere kans hoog achtergrondniveau ontwikkelen tijdens de colorimetrische reactie, maar verhogen de wassingen op dag 3 of wassen nachts kan compenseren.
In dit protocol is het aantal stappen verlaagd en het gebruik van verschillende gangbare reagentia is geëlimineerd. Merk op dat dit protocol elimineert verschillende stappen die worden gebruikt in vele andere protocollen zoals een proteinase K digestie en het gebruik van azijnzuuranhydride positief geladen groepen te blokkeren. Die stappen kunnen nog steeds nuttig zijn bij het zoeken naar zoogdieren en vogels embryo's, maar in het gebruik van Xenopus, het elimineren van deze stappen heeft weinig invloed on de uiteindelijke resultaten van de in situ hybridisatie. Ons laboratorium heeft niet vastgesteld of deze zelfde vereenvoudigingen kunnen worden toegepast in situ hybridisatie protocollen voor andere soorten. Proteïnase K spijsvertering in het bijzonder kan nog steeds in andere embryo's zoals chick of muis waar sondepenetratie grotere beperkingen kunnen hebben worden verlangd.
Het gebruik van BM purple substraat gemakkelijk en betrouwbaar. Er zijn echter een aantal andere opties van de precipiterende, kleur alkaline substraten die nodig zijn om het doel-RNA in het embryo lokaliseren. Met name is een combinatie van NBT / BCIP veelgebruikte 4 en werkt goed. Wat kleur reagentia zijn oplosbaar in methanol, in welk geval het gebruik van methanol na kleuring van de vlek te verwijderen en moet worden vermeden. Andere kleurencombinaties kan ook gebruikt worden bij het uitvoeren van dubbele in situs. Het gebruik van een soortgelijke combinatie (NBT / BCIP plaats BM purple) is ook aangetoondzeer robuust te zijn bij het gebruik van de muis embryo's 20. De blauwe kleur van de kleuring en de endogene pigment van de embryo vaak moeilijk om duidelijk onderscheiden afbeeldingen. Gebruik van albino embryo ook pigment elimineren maar bleken oplossing bijna zo effectief en is veel gemakkelijker aangezien het niet de handhaving van albino volwassenen kweken vereisen. Indien kleuring relatief zwak, kan sterk bleken dat kleuring benadrukken. Als de kleuring is sterk, waardoor wat licht pigment kan een effectieve contrast te zijn en ook helpen met het oriënteren en de enscenering van de embryo.
Na overnacht hybridisatie van RNA probe, kan de protocol afwijken van de strikt handmatige protocol hier beschreven om het gebruik van een in situ hybridisatie robot. Het gebruik van de in situ hybridisatie robot slaat bijna een volledige dag als de dag twee en dag drie van de handmatige protocol kan worden teruggebracht tot één dag als de robot werkt door de nacht eend kunnen alle juiste temperatuur veranderingen aan te brengen. De robot is ook zeer consistent in de resultaten en maakt gelijktijdig aftasten van vele monsters efficiënt. Het blijft voordelig de eerste dag doen handmatig als mogelijk maakt hergebruik van probes en het gebruik van kleinere volumina reagens. De enige belangrijke nadeel van het gebruik van een robot is de initiële kosten van het instrument.
Dit protocol bespreekt enkele van de manieren om effectief afbeelding van een in situ hybridisatie. Het is belangrijk om dit te doen als een groot deel van de informatie verloren kan gaan als het beeld is slecht. In veel gevallen, beeldvorming van de in situ resultaat van een experiment moet tegelijk met het eerste experiment. Enkele onderdelen van de procedure variabelen zoals de mate van blekende een element van persoonlijke voorkeur. Andere afbeelden effecten kunnen worden bereikt door de schotel op een gekleurde basis. Vaak een lichte blauwe tint aan de agar kan de diepblauwe kleuring van de in sit benadrukkenU hybridisatie. Simpel gezegd de petrischaal die de agar een vel blauwe plastic om het gewenste effect te krijgen.
Echter, de hier beschreven methoden bieden een basis waarmee beeldvorming mogelijkheden te verkennen. Embryo's kunnen worden bekeken ofwel gewist (transparant gemaakt om beter zicht interne structuren) of niet-vereffende (gezien als ze verschijnen onder normale lichtomstandigheden). Enkele beslissing met betrekking tot hoe het beeld embryo is afhankelijk van de plaats van expressie. Als de expressie op of nabij het oppervlak van het embryo, het beste beeld embryo zonder vereffening. Er zijn verscheidene voordelen aan het gebruik van de afgewikkelde embryo. De werkwijze van het wissen van de embryo vereist vele stappen en de chemicaliën gebruikt om de embryo's te wissen moeilijk te hanteren. Ook verscheidene holten in het embryo toe precipitatie van alkalische fosfaat substraten die kunnen leiden tot verkeerde holte kleuring. Vooral de blastocoel van vroege embryo en de pharyngeal holte vertonen vaak kleuring (figuur 4). Deze valse kleuring is niet zichtbaar in embryo's die niet worden gewist. Voor het grootste deel, zelfs matig diepe expressie kan worden gevisualiseerd in uncleared embryo, inclusief mesodermale weefsels zoals hart, nier en somieten, en endodermale stuctures zoals schildklier en lever. Verplaatsen van de embryo's door middel van een reeks methanol hetzij hydraat in PBS voor het bekijken of in 100% methanol gebracht voor opslag maakt meerdere ronden van opslag en beeldvorming. De methanol opslag maakt het mogelijk om verschillende wijzigingen proberen de beeldvorming over langere tijd.
Er zijn een aantal nadelen aan het gebruik van de in situ hybridisatie techniek te kijken genexpressie. Niveaus van expressie zijn niet strikt kwantificeerbaar hoewel vergelijking binnen een embryo en grove veranderingen in expressie en veranderingen in het domein van de grootte expressie zijn meestal duidelijk. Zoals met andere RNA-gebaseerde technieken, bevat het geen informatie verschaffen to de eiwitten gecodeerd door het gen van belang, die de interpretatie van de resultaten kan beperken. Tenslotte is het vaak moeilijk om te bepalen wat zou achtergrondkleuring worden vergeleken met de werkelijke expressie domein. Dit is vooral een probleem met genen met onbekende expressiepatroon die wijdverbreid zijn. Vaak wordt een probe gegenereerd uit de sense streng van hetzelfde gen als controle voor niet-specifieke kleuring. Toepassing van een sense streng controle kan enige informatie omtrent een probleem met reagentia maar niet definitief bewijs dat kleuring op basis van de antisense probe volledig accurate. Resultaten van een in situ meestal opmerkelijk consistent embryo wanneer meerdere embryo's worden gebruikt en dit kan worden gebruikt als een maat van vertrouwen in een kleurpatroon. Ook kunnen verschillende antisense probes gegenereerd uit verschillende delen van het gen, met name getranslateerde gebieden, worden gebruikt om te zien of ze geven dezelfde kleurpatroon. Als ze dat doen,het biedt ook het vertrouwen in de waargenomen kleurpatroon als deze identiek. Verdunde probes kunnen ook worden gebruikt met langdurige blootstelling aan de kleuroplossing te zien of dezelfde kleuring patroon zien. Een factor die meestal geeft vertrouwen in een kleurpatroon is of dat patroon overeenkomt met een specifieke embryonale structuur. Genoeg in situs zijn nu uitgevoerd met een grote verscheidenheid van genen die nieuwe expressiesystemen waarschijnlijk zullen betrekkelijk zeldzame gebeurtenissen. Grote databases van in situ afbeeldingen zijn vastgesteld voor verschillende organismen die kunnen worden gebruikt om beelden te vergelijken. Voor Xenopus embryo's, Xenbase (www.xenbase.org) is een uitstekend voorbeeld van een bron die kan worden gebruikt om expressie patronen te begrijpen. Andere model organismen hebben ook vergelijkbare, uitgebreide databases van beelden.
Ondanks deze mogelijke kanttekeningen, in situ hybridisatie blijft een krachtig en betrouwbaar hulpmiddel dat is uiterst nuttig voorde studie van de organogenese. Het is waarschijnlijk de voorkeursmethode voor het identificeren van celtypen en onderzoeken verandering in genexpressie domeinen de nabije toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D.
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
