Protocol
1. Embryo Framställning
- Om inte gjort rutinmässigt som en del av embryokultur, de-gelé embryona med 2,5% cystein, pH 8,0 före fixering 8. Även om det inte är absolut nödvändigt, är det bra att ta bort befruktning kuvertet manuellt före fixering med fin pincett.
- Använd glas Pasteur pipetter för att överföra embryon. Pipetten inte är tillräckligt bred för att överföra embryon så använd en diamant penna för att skära glas pipett vid en punkt tillräckligt bred för att plocka upp ett embryo. Eliminera de skarpa kanterna på pipetternas efter skärning genom att snabbt passera den skurna spetsen genom lågan av en bunsenbrännare för att smälta de skarpa kanterna.
OBS: Försiktighet måste tas, eftersom glaset kan fortfarande vara varm nog för att orsaka brännskador även om det verkar ha svalnat genom visuell inspektion.
- Använd glas Pasteur pipetter för att överföra embryon. Pipetten inte är tillräckligt bred för att överföra embryon så använd en diamant penna för att skära glas pipett vid en punkt tillräckligt bred för att plocka upp ett embryo. Eliminera de skarpa kanterna på pipetternas efter skärning genom att snabbt passera den skurna spetsen genom lågan av en bunsenbrännare för att smälta de skarpa kanterna.
- Utför embryot fixering i etapper. Först förbereder glasflaskor för användning i embryo fixering. Använd dessa flaskor för alla steg inklusive finallagring. Använd flaskor som är tydliga med en bra teflontätning i locket, vilket möjliggör övervakning av embryon under alla steg i processen. Märk rören med lämplig experimentell information med hjälp av märkpenna och sedan täcka etiketten med tydliga band, som till och med permanent markör kommer att gå förlorade under loppet av förfarandet på grund av användningen av alkoholer och andra lösningsmedel.
- Använd Mempfa att fixa embryon. Gör ett lager av 8% paraformaldehyd i satser om 50-100 ml i taget. Använd cirka 75% av den erforderliga H2O och värm till 50-60 ° C, vilket behövs för att få den paraformaldehyd i lösning.
OBS: Denna lösning är något annorlunda än den Memfa används i äldre publicerade protokollversioner genom att den utnyttjar paraformaldehyd istället för formaldehyd. - Lägg 2-3 droppar 10 N NaOH eller tills pH är cirka 7,5 (användning pH-papper för att kontrollera pH). Paraformaldehyd är mycket giftiga, därför generera stamlösningen i ett dragskåp. När paraformaldehyd är i lösning, filtrera lösningen genom Whatman papper i en färsk behållare och tillsätt H2O till slutvolymen. Om det behövs, lagra paraformaldehydlösning vid 4 ° C under 1-2 veckor.
- Montera de återstående komponenterna i Mempfa fixeringslösning (tabell 1). Se till att den slutliga arbetskoncentrationen paraformaldehyd är 4%. Förvara alla komponenter i fixeringslösningen vid 4 ° C som lager.
- Med hjälp av en nedskärning glaspipett, fixa embryon genom att lägga de embryon som de märkta glasflaskor som har fyllts med de cirka 3-4 ml Mempfa lösning (tabell 1). Undvik att fästa mer än 20-30 embryon per flaska. Lägg embryona med ett minimum av vätskeöverföring från embryot mediet. Fix embryon i Mempfa lösning under 2 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- För sena endoderm strukturer utför i situs manuellt isolerade gut och endoderm derivat 9,10, Vilket möjliggör god penetration av sonden och även undviker hålighet färgning.
- Förvara en lösning av 100% metanol vid -20 ° C. Efter paraformaldehyden fixering, ersätta Mempfa lösningen med ca 4 ml av -20 ° C, 100% metanol för lagring av embryona.
- Snurra flaskorna efter tillsats av metanol för att förhindra embryona från att fastna på glaset eller andra embryon. Se också till att flaskorna är tätt förslutna eftersom metanol kan avdunsta i frysen över tiden om lös.
OBS: Embryon kan lagras under minst ett år, och troligen längre, i metanol före färgning med bibehållen situ hybridisering kvaliteten i.
- Använd Mempfa att fixa embryon. Gör ett lager av 8% paraformaldehyd i satser om 50-100 ml i taget. Använd cirka 75% av den erforderliga H2O och värm till 50-60 ° C, vilket behövs för att få den paraformaldehyd i lösning.
2. Sond Framställning
- Använd 1-2 pg av templat-DNA för att göra digoxigeninmärkt sonder. Cut plasmid innehållande den lämpliga DNA-sekvensen vid 5'-änden av genen av intresse med ett restriktionsenzym lämpliga för thaT-vektor för att generera antisens-prober.
OBS: plasmiden bör ha en lämplig RNA-polymeras bindningsställe (t.ex. T7, T3 eller SP6). - Låt DNA, vatten, NTP blanda och polymerasbuffert värmas till rumstemperatur innan montering av sondsyntesreaktionen. Lägg komponenterna i RNA-syntesreaktionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör i den ordning som listas i tabell 2. Justera volymen av vatten tillsättes för att bringa den totala volymen av sondsyntesreaktionen till 20 | il. Montera reaktionen vid rumstemperatur, eftersom komponenterna i polymerasbuffert kan utfälla mall-DNA när i höga koncentrationer och kall.
- Inkubera transkriptionsreaktionen under 2 h vid 37 ° C.
OBS: Inkuberingar av något längre än två timmar leder till några negativa effekter, men också visa lite ökat utbyte. Om odlas i en timme, kommer avkastningen att minskas men ändå tillräckligt för att göra en bra sond.- I väntan på att transkriptionsreaktionen till slut, göra en agarosgel som kommer att användas för att testa kvaliteten av sonden. Smält 1 pg av agaros i 100 ml 1X TAE-buffert (se tabell 1) genom upphettning av lösningen till kokpunkten. Avlägsna lösningen från värmen när agarospulver har helt upplöst.
- Lägg 2 pl etidiumbromid stamlösning (10 mg / ml) till omkring 100 ml agarosgel när agarosen har svalnat till omkring 60 ° C för att medge visualisering av RNA under ultraviolett (UV) ljus.
NOTERA: Detta agarosgel lösning kan förvaras i en 60 ° C inkubator så att framtida geler kan hällas utan upprepad smältning. Var försiktig vid hantering etidiumbromid grund av potentiell toxicitet.
- Lägg ett pl DNAsel (RNAse fri kvalitet) till transkriptionsreaktionen efter två timmars inkubation och inkubera under ytterligare 10 min vid 37 ° C för att eliminera DNA-templat.
- Avlägsna 1 ul av reaktionsblandningen tillkontrollera på 1% agaros-TAE-gel och till resten (20 | il) tillsätt 80 | il av 1% SDS i TE-buffert (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), 10 | il 5M NH4 acetat och 220 pl kall etanol. Vortex mixen kraftigt och ställ åt sidan på is tills resultatet av RNA kvalitetskontroll är kända.
- Kör de 1 pl RNA avlägsnas innan nederbörd på 1% agaros-TAE-gel. För att underlätta lastningen på gelén, tillsätt 4-5 pl vatten och 1 pl av standardladdningsfärg till RNA. Visa RNA på gelen med hjälp av en UV-ljus transilluminator för att kontrollera kvaliteten på sonden (se diskussion).
- Fälla ut återstående RNA som avsattes på is i steg 2.5 genom att snurra i en mikro i full fart i 10 till 15 min. Tappa av supernatanten med en utdragen glaspipett och låt torka helt kort.
- Resuspendera sonden med en ml av RNA-hybridiseringsbuffert (Tabell 1) i Eppendorf-rör. Vortexa och briefly värma röret till 37 ° C och vortexa igen. Överför sondlösningen till en 15 ml med skruvlock polystyrenrör och fyll till 7-10 ml med RNA-hybridiseringsbuffert. Obs: Sonden kan spädas ytterligare (en 10-faldig ytterligare utspädning kan fortfarande arbeta) ofta resulterar i låg bakgrund men färgningsreaktioner kommer också att ta längre tid.
3. In situ hybridisering
- Ta de embryon som lagrats i -20 ° C metanol och låt värmas till rumstemperatur. Utför hela proceduren i glasflaskor. Om olika embryon från en grupp kommer att granskas av olika sonder, hålla dem i en injektionsflaska tills strax innan sond läggs för att minska variationen och arbetskraft på den första dagen.
- Rehydrera embryon genom en metanolserie som beskrivs i tabell 3 (se tabell 1 för tvätt recept) som förberedelse för tillsättning av sonden. Snurra försiktigt embryos efter varje ändring för att se till att de inte fastnar sidorna eller varandra, och rock embryon genom att montera flaskorna på en nutator. Vid överföring av vätskor, kontrollera insidan av locken så att embryon inte har varit instängda där.
- Väl inne i sondlösningen, hybridisera embryon över natten såsom beskrivits i tabell 3.
- Ta sondlösningen. Spara den använda sonden genom lagring i ett 15 ml med skruvlock polystyrenrör, märkta med datum och antal gånger sonden har använts, vid -20 ° C.
OBS: Samma prob kan återanvändas många gånger för efterföljande in situ hybridisering tills kolorimetriska reaktioner börja ta en onormalt lång tid att nå önskad intensitet.- När sonden är borttagna, förbereda embryon för antikroppar färgning mot sonden genom serien tvättar som beskrivs i tabell 4. Ändra temperaturen efter behov (tabell 4) genom att flytta tHan nutator, med flaskor av embryon bifogas, direkt i hybridiseringsförfaranden ugnar som är inställda till lämplig temperatur.
- Gör upp lämplig volym av MAB + HTSS + BR + anti-Dig antikropp (tabell 4) vid tiden att embryona som inkuberas i MAB + HTSS + BR blockerande lösningen så att antikroppen är blockerad innan du lägger till embryon. Gör de blockerande lösningar färsk på användningsdagen.
- Ta antikroppslösningen och börja tvättar som beskrivs i tabell 5 efter inkubation över natten med antikropp. Utför minst tolv 30 minuterstvättar i syfte att förbereda för färgning med alkaliskt fosfatas-substrat och minska bakgrunden så mycket som möjligt. Använd antingen MAB buffert eller TBT-lösning (tabell 1) för tvättstegen.
OBS: TBT-lösning är TTW som har 2 mg / ml BSA tillsattes.- Ersätt sista tvättlösningen med BM Lila alkaliskt fosfatas substrat. Utför färgnings REACtion vid antingen rumstemperatur eller 37 ° C.
OBS: Färgning är snabbare vid 37 ° C, men om de lämnas över natten, kan oacceptabelt bakgrundsfärgning ofta vara ett resultat. De färgreaktioner kräver ofta över natten färgning och rumstemperaturen är säkrast för detta. - Om ytterligare färgning krävs och BM lila lösningen tar på en blå färg, byt ut färglösningen med färsk BM Lila och sätta rören i 37 ° C. Om målet mRNA är mycket riklig, satte embryona i färglösningen vid 4 ° C över natten och sedan flytta embryon till rumstemperatur eller 37 ° C för att möjliggöra en bättre övervakning av färgreaktion.
- Övervaka nya reaktioner noggrant, eftersom tiden för att slutresultatet varierar kraftigt mellan olika mål-RNA. För konsekvensens stoppa färgningsreaktionen (se 3.4), när det inte finns några nya platser uttrycks uppstår med längre inkubation. Viktigare, om in situ hybridisering används som en analysför experiment tittar på olika behandlingsgrupper, använder samma tid för färgreaktioner mellan behandlings- och kontroll embryon.
- Ersätt sista tvättlösningen med BM Lila alkaliskt fosfatas substrat. Utför färgnings REACtion vid antingen rumstemperatur eller 37 ° C.
- Stoppa färgningsreaktionen och förbereda embryon för lagring och bildinspelning genom att ändra vätskorna som beskrivs i tabell 6. Vicka inte embryona i detta skede eftersom avlägsnandet av fläcken kan visualiseras som lila färgning av metanol runt embryona.
OBS: Ofta embryon har en ljusblå färgning från färgningslösningen och kall metanol kan åtminstone delvis ta bort det, även om detta inte är tillräckligt för att avlägsna tunga bakgrund eller hålrum färgning. Kall metanol hänför sig till metanol som bibehålls i en -20 ° C frys.- Rehydrera embryon och fixa fläcken med Mempfa (Tabell 6). När fast, ta bort Mempfa och tvätta embryon med 25% metanol.
- Ta bort 25% metanol och tillbleknings lösningen om avlägsnande av endogen pigmentkrävs. Var försiktig vid hantering av blekningslösningen eftersom det kan orsaka brännskador. Beakta blekn nära som det händer relativt snabbt och graden av blekning kan varieras för olika effekter (Figur 2).
- Torka embryon genom en metanol serie till 100% metanol för långtidsförvaring efter blekning, eller överföra till PBS för korttidslagring och efterföljande bildbehandling (se tabell 6).
4. Bild Embryon
- När ett embryo har avslutat färgningsprocessen, bild embryot så att information om var den intressanta genen uttrycks fångas för en bredare publik. Använd 1% -ig som bakgrund för att visa icke godkända embryon.
OBS: agaros ger en blå / grå bakgrund som kontrasterar väl med embryot och den blå färgen på färgreaktion. Det hjälper också diffusa störande skuggor och reflexer som avleder uppmärksamheten från embryot.- Lägg agaros till vatten och sedan koka tills agarosen är i lösning och sedan låt svalna till 50 innan du häller in i petriskål. Som med TAE gellösningen, lagra agaroslösningen i 55 ° C inkubator för flera användningsområden. Häll agarosen till ett djup av ca 2 mm in i petriskål. Om så erfordras, justera djupet av agaros för att ge en något annorlunda nyans av bakgrunden.
- Efter rehydratisering av lagringen i metanol till en vattenlösning (PBS eller TTW), med användning av en metanol serie, placera embryona i en petriskål med agarosen bas (se tabell 6). Förvara lösningen rena och vid behov, använda enkla filtrering för att eliminera små partiklar som kan störa den rena bakgrunden av bra bilder.
- Till bilden embryon från alternativa vyer, såsom från den ventrala sidan, skär tunna kanaler i agarosen att passa embryot med fin pincett och placera embryon i dessa kanaler för orientering (Figur 3 OBS: De flesta scener har en karakteristisk position som de antar när den placeras i lösningen. Till exempel, embryon blastula skede brukar sitta djursidan uppåt. När embryona börjar avlånga, de låg på deras sida.
- Använd den fiberoptiska ljuskällan för att belysa embryo från en flack vinkel, skapar skuggor på embryot som ger djup till bilden och hjälpa urskilja ytstrukturer. Eftersom blekning kan eliminera pigment som ger användbara landmärken, använder skuggning för starkt blekta embryon.
- Rensa embryon till bild färgning som är djup inom embryot, såsom i notochord, lunga eller regioner i hjärnan, (Figur 4). För att åstadkomma detta, satte embryon genom en metanol serie förrän i 100% metanol.
- Efter fullständig nedsänkning i metanol, överföra embryon till en lösning av en del bensylalkohol och två delar bensyl varanzoate (BABB). Embryona kommer inledningsvis flyta på ytan men eftersom metanol blandas med BABB, kommer de att sjunka ner i BABB. Utför varje steg som behandlar BABB i glasflaskor eller rätter; BABB smälter någon plast eller färg.
- När rensas, visa embryon med överfört ljus som kommer underifrån embryot. Justera ljusintensiteten samt vinkeln underifrån för att förbättra kontrast och ge den bästa färgen.
- När du tittar rensas embryon höjer glaset petriskål bort av basen. Gör detta genom att bara använda två andra petriskål lock för att höja det, så att det område av skålen med embryon är förhöjd.
OBS: Detta har fördelen av att ta basen ur fokus och eliminera störande effekter från brister eller fläckar på mikroskopbasen som kan störa bilden.
5. Dubbel In situ hybridisering
- För att samtidigt visa uttrycksmönstret för two olika gener i en enda embryo, syntetisera två prober, en för var och en av de olika generna. Syntetisera en sond med användning av DIG-11-UTP som en etikett, såsom beskrivits ovan. Späd produkten av transkriptionsreaktionen i RNA hybridiseringsbuffert för att ge en 3x mer koncentrerad sond än används för singel in situ hybridiseringar.
- Syntetisera den andra proben av intresse med användning av samma protokoll som för DIG-märkta probades med undantag för att fluorescein-12-UTP måste substitueras för DIG-11-UTP. Späd produkten av transkriptionsreaktionen i RNA hybridiseringsbuffert för att ge en 3x mer koncentrerad sond än används för singel in situ hybridiseringar.
- Blanda de två koncentrerade prober i en 1: 1-förhållande. För bästa resultat, använd fluoresceinmärkta sond för genen som visar den starkaste uttryck i singel in situ hybridisering protokollet.
- Använd samma in situ hybridisering protokoll som beskrivs för enstaka in situ </ Em> hybridiseringar, använd dock dubbel sond (sond innehållande 1.5x koncentrerad blandning av digoxigeninmärkt och fluorescein-märkta prober) i slutet av den första dagen i stället för en enda in situ hybridiseringsprob.
- Följ enda hybridisering protokollet på den andra dagen av den dubbla in situ hybridisering protokoll, utom användning anti-fluorescein-AP Fab-fragment på en 1: 4000 utspädning i stället för anti-DIG-AP Fab-fragment. Tvätta ut överflödigt antikropp från embryot som i singel in situ-protokollet och genomföra den första färgreaktion med hjälp av BM-Purple AP-substrat.
- Efter den första färgreaktionen, inaktivera fluorescein antikropp i 0,1 M glycin pH 2,0 för 40 minuter följt av fem tio min tvättar i MAB. Blockera embryona i MAB + HTSS + BR för 90 min. Lägg anti-DIG-antikropp vid en 1: 2000 utspädning i MAB + HTSS + BR och inkubera vid 4 ° C över natten.
- Följande dag, tvätta embryon thoroughly i MAB (12 tvättar av 30 min) för att ta bort överskott antikropp.
- Tvätta embryona under 10 min i AP-buffert (Tabell 1) och sedan färgas med BCIP (0,5 mg / ml i AP-buffert).
OBS: Den in situ kombinationen bör ge en mörk blålila färgning för den första färgreaktion och en ljusblå färg reaktion för den andra (Figur 5). - Stoppa den slutliga färgreaktionen genom att avlägsna AP-buffert och skölj tre gånger med MAB. Fäst embryon med Mempfa i 10 min. Tvätta embryon med fem snabba tvättar i MAB eller TBT.
- Med denna färgkombination, är inte längre möjligt att använda metanol i efterfärgnings behandlingar, eftersom det kommer att eliminera BCIP enbart färgen. Förvara embryona efter färgning och fixering i PBS med 0,02% natriumazid. Färgningsintensitet kan vara svag med dubbel i situs. Om detta är ett problem, minska tvättarna till fyra, var och en av två HR varaktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användningen av vävnadsspecifika prober kan ge enastående uppgifter i fråga om att staten utveckling för specifika organ. I de följande exemplen, är det stadium av embryot baserad på Nieuwkoop och Faber staging tabell 11. Om man använder sonder formulär gener som uttrycks efter differentiering, cardiac troponin I vid scenen 28-30, till exempel (Figur 1C), förekomsten eller storlek på ett differentierat organ kan bedömas i något skede efter differentiering. År sedan, embryologer kunde göra en sådan analys baserad på anmärkningsvärd kunskap om histologi av den tidiga embryot 12,13 men att kompetens har till stor del förlorat till den nuvarande generationen av embryologer. Även kan förlusten av denna expertis anses beklagligt, tillförlitlighet och användarvänlighet av in situ hybridisering tekniker gör identifiering av specifika vävnader tillgängliga för alla forskare. Vävnader som är relativt obemärkt, tHan kläckning körtel i fosterstadiet 25 till exempel (Figur 1A), kan livfullt markeras med hjälp av situs utan behov av specifika antikroppar eller histologiska tekniker (Figur 1C). Även användningen av hela berget i situs tillåter en att se hela organet i samband med hela embryot stället förlita sig på slutledning från histologiska sektioner (Figur 2). Även vävnader som är djupt inne i embryot inklusive optiska stjälk (Figur 4) kan ses lätt och användningen av embryot clearing kan ge skarp avgränsning av gränser organ.
Blekning av embryon för att avlägsna endogena pigment använder peroxidlösningar har till stor del eliminerat kravet på att använda albino embryon som saknar pigment. Blekning efter olika tider kan vara användbart. Till exempel, om fläcken är stark, en lättare blekning som tillåter viss pigmente ses kan vara användbart eftersom det helaows för bättre iscensättning och orientering av embryot (Figur 2A). Men om fläcken är ett område där det finns höga nivåer av pigmentering, såsom njuren (fig 2B), i närheten av fullständig eliminering av pigmentet efter längre inkubation i blekningslösningen ger ett bättre resultat.
Embryon tenderar att ta upp särskilda positioner i lösning. Efter neurulation, de tenderar att ligga platt på deras sidor. Detta är bra för bilder av flanken (figur 2B), men kan vara ett problem med andra områden. Användning av en agaros bas gör att man kan skära kanaler in i agaros som kan användas för att orientera embryon. Till exempel är blodprekursorer lokaliserad till den ventrala sidan av embryot (Figur 2A) och den fulla omfattningen av färgning är svår att observera. Positionering av embryot i en kanal med den ventrala sidan uppåt, tillåter sedan för fullständig visning av denna genuttrycksmönstret (figur 3A). Användningen av dubbel hybridisering in situ kan visa sambandet mellan två genexpressionsmönster inom en enda organism (Figur 5) eliminering av nödvändigheten av att jämföra mellan olika embryon som kan ha små skillnader i morfologi. Kanske viktigast av allt, ger man användningen av in situ hybridisering förmågan att tydligt markera celler före rensa histologisk differentiering baserad på uttrycket av gener som uttrycks i tidiga förfäder av en härstamning, såsom pax2 som uttrycks i många vävnader i tidiga embryot, före differentiering (Figur 4A). Förmågan att identifiera stamceller och vävnader som inte är tydligt urskiljas baserat på histologi, såsom myeloida cellprekursorer (Figur 1B), har gjort forskarna att fråga mycket mer detaljerade frågor om tillståndet i ett organ utveckling och även att utvärdera resultaten av experimentella manipulation utformats för att orsaka ektopisk differentiering av en vävnad.
Figur 1:. Exempel på hela berget i situ hybridisering på Xenopus embryon Den blåfärgning från en in situ hybridisering experiment kan tydligt avgränsa utveckla strukturer tidiga Xenopus embryot (A) En främre syn på en etapp 26 embryo belyser kläckning körteln. som avgränsas av uttrycket av uvs.2 14 (B) En ventrala syn på en embryon som visar platsen för tidiga myeloida celler vid stadium 20 använder uttrycket av myeloperoxidas 15 som en markör (C) Den tidiga hjärta vid stadium 28.. - 30 visualiseras genom uttryck av kardiellt troponin I 16. En klar fördel med att använda denna metod är att alladessa genexpressionsmönster visualiserades med hjälp av olika sonder men det protokoll som används är identisk i alla fall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Olika nivåer av blekning kan användas för att visualisera färgning i embryot (A) Denna blåfärgning längs botten av detta embryo visar uttrycket av hemoglobin i de ventrala blod öarna vid ungefär stadium 36. Detta är en region av. embryo som är endast lätt pigmenterad och sålunda embryot inte blektes under en lång tid som kan ses av den brunfärgat pigment i ögat och längs flanken av embryot. Att kunna se den pigmente möjliggör bättre visualisering av scenen av embryot. Om färgningen är i en region med större naturlig pigmentering, såsom nervsystemet och flanken av embryot, kommer större blekning hjälpa läser in situ såsom sett i B. (B) Här uttrycket av pax8 17 i formnings njure , pronephric kanal och bakhjäman bäst visualiseras efter blekning har avlägsnats nästan alla endogena pigment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Manipulering av agarosen basen kan hjälpa till med orienteringen av embryona Imaging specifika regioner i embryot kan vara svårt eftersom de tenderar att ta upp särskilda positioner i skålen (A) Vid grodyngel iscensätter embryot kommer att ligga på sidan.. . Genom snittting en fin kanal i Agar (svarta pilar) embryot kan ses från den ventrala sidan, här visar hemoglobin uttryck vid scenen 36, med tillräcklig stabilitet för att fånga en bra bild. (B) Denna ventrala syn på hand1 uttryck vid scenen 20 skisserar sidoplåten mesoderm 6. Embryot placeras i ett litet hål som stabiliserat sin ställning med den ventrala sidan uppåt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Inre organ kan ses i både ogenomskinliga, icke avräknade och i clearade embryon I en uncleared embryo färgas för pax2 i stadium 34 (A), den optiska stjälk (gul pil) kan visualiseras relativt enkeltsom kan färgn ned neuralröret. Men detaljerna är inte skarp. Genom att rensa embryot (B) gränserna för uttryckssajter, inklusive optiska stjälk (gul pil) är skarpare. Omfattningen av clearing visas genom förmågan att se båda ögonen i detta rensas embryo. Tänk också på att vissa färgning har samlats i de inre hålrum (lila pil), ett vanligt problem när du tittar rensas embryon.
Figur 5:. En representativ dubbel in situ hybridisering på en Xenopus embryo Expression av sidoplåten markör, hand1, visualiseras av ljusblå färgning vid steg 26. Redovisning av etv2 inom utvecklingskärl visualiseras genom mörkblå lila fläck. Uttryck av hand1 är vanligtvis mycket intensiv och därför användes för than svagare fluorescein-märkt sond och BCIP kombination. Den utnyttjade digoxigeninmärkt sond och BM-lila kombination för den svagare etv2 uttrycket.
| Namn | Slutkoncentration | Belopp / 100 ml |
| Mempfa | 1 mM MgSO 4 | 100 ^ 1 M MgSO 4 |
| (Förvaras vid 4 ° C) | 2 mM EGTA, pH 8,0 | 10 ml av 20 mM EGTA, pH 8,0 |
| 0.1 M MOPS, pH 7,5 | 10 ml av en M MOPS, pH 7,5 | |
| 4% paraformaldehyd, pH 7,5 | 50 ml av 8% paraformaldehyd, pH 7,5 | |
| TTW | 50 mM Tris, pH 7,4 | 5 ml av 1 M Tris, pH 7,4 |
| 200 mM NaCl | 4 ml av 5 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 pl av Tween 20 | |
| 100X Denhardts lösning | 2% BSA | 2 g BSA |
| (Filtrera genom 0,2 ìm filter, | 2% PVP-40 | 2 g PVP-40 |
| lagra vid -20 ° C) | 2% Ficoll 400 | 2 g Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M NaCl | 17,5 g NaCl |
| 300 mM trinatriumcitrat | 8,8 g trinatriumcitrat | |
| RNA hybridiseringsbuffert | 50% formamid | 50 ml av 100% formamid |
| (Förvaras vid 4 ° C) | 5x SSC | 25 ml 20x SSC |
| 1 mg / ml jäst-RNA | 4 ml av 1 mg / ml jäst-RNA löst i 50% formamid | |
| 1X Denhardts lösning | 1 ml av 100x Denhardts lösning | |
| 0,1% Tween 20 | 100 pl av Tween 20 | |
| 5 mM EDTA, pH 8,0 | 1 ml av 0,5 M EDTA, pH 8,0 | |
| MAB | 100 mM Maleinsyra | 1,16 g maleinsyra |
| (PH 7,5, förvara vid 4 ° C) | 150 mM NaCl | 0,88 g NaCl |
| MAB + HTSS + BR | 100 mM Maleinsyra | 96 ml av MAB |
| 4% Värmebehandlad fårserum | 4 ml av värmebehandlat fårserum (värmebehandlades vid 55 ° C under 30 min och alikvoteras) | |
| 2% blockeringsreagens | 2 g Roche Blocking Reagent | |
| MAB + HTSS + BR + anti-Dig antikropp | 100 mM Maleinsyra | 96 ml av MAB |
| 4% Värme Treated fårserum | 4 ml Värmebehandlad Sheep Serum | |
| 2% blockeringsreagens | 2 g Roche Blocking Reagent | |
| 1: 10000 Anti-Dig-AP, Fab-antikroppsfragment | 1.5 pl Anti-digoxygenin-AP, Fab-antikroppsfragment | |
| Alkaliskt fosfatas (AP) buffert | 100 mM Tris, pH 9,5 | 10 ml av 1 M Tris, pH 9,5 |
| 50 mM MgCl2 | 5 ml av 1 M MgCl2 | |
| 100 mM NaCl | 2,5 ml av 4 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 pl av Tween 20 | |
| Blekningslösning | 0,3% H 2 O 2 | 3,34 ml av 30% H 2 O 2 |
| 5% formamid | 5 ml av 100% formamid | |
| 0,5% SSC | 2,5 ml av 20x SSC | |
| Clearing Lösning | 1/3 bensylalkohol | 33 ml |
| 2/3 Bensylbensoat | 67 ml |
Tabell 1: Lösning Recept
| Namn | Mängd |
| Dig-NTP Mix | 5 pl 20 mM CTP |
| (40 | il reaktion) | 5 pl 20 mM GTP |
| 5 pl av 20 mM ATP | |
| 3.25 pl 20 mM UTP | |
| 3.5 pl 10 mM Dig-11-UTP | |
| 18.25 xl destillerat, autoklaveras vatten | |
| Probsyntes | x il templat-DNA(Beroende på koncentration) |
| (20 | il reaktion) | x il destillerat, autoklaveras vatten |
| 4 pl av Dig-NTP-blandning | |
| 0,5 | il RNas-inhibitor | |
| 2 ^ il 10 x RNA-polymeras-buffert | |
| 2 | il av RNA-polymeras |
Tabell 2: Probe Synthesis Recept
| Namn på reagens | Ungefärlig volym | Varaktighet | Temperatur |
| 100% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 75% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 50% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, gunga | Rumstemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, gunga | Rumstemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, gunga | Rumstemperatur |
| Pre-varma RNA Hybridiseringsbuffert och Probe till 65 ° C | |||
| TTW | 4 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| TTW | 4 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| RNA hybridiseringsbuffert | 2 ml | 10 min, gunga | Rums Temperature |
| Förvärmda RNA Hybridiseringsbuffert | 2 ml | 1 tim, gunga | 65 ° C |
| Sondlösning | 1 ml | Övernattning, gunga | 65 ° C |
Tabell 3: Steg för första dagen av In Situ Hybridisering Protocol (ca 3 tim totalt)
| Namn på reagens | Ungefärlig volym | Varaktighet | Temperatur | ||||
| Pre-varma RNA Hybridiseringsbuffert och 02.x SSC till 65 ° C och 2x SSC till 37 ° C | |||||||
| Återgå sondlösning till röret för upprepad användning | |||||||
| RNA hybridiseringsbuffert | 2 ml | 10 min, gunga | 65 ° C | 2X SSC | 2 ml | 20 min, gunga | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 ml | 20 min, gunga | 37 ° C | ||||
| 0,2X SSC | 4 ml | 1 tim, gunga | 65 ° C | ||||
| 0,2X SSC | 4 ml | 1 tim, gunga | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1,5 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur | ||||
| MAB + HTSS + BR + anti-DIG antikropp | 1,5 ml | Övernattning, gunga | 4 ° C |
Tabell 4: Steg för andra dag In Situ Hybridisering Protocol (ca 4 tim totalt)
| Namn på reagens | Ungefärlig volym | Varaktighet | Temperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| BM Lila AP Substrat | 500-750 | il | Övernattning, gunga (se text) | Rumstemperatur / 37 ° C (se text) |
Tabell 5: Steg för tredje dagen av In Situ Hybridisering Protocol (ca 7 timmar)
| Namn på reagens | Ungefärlig volym | Varaktighet | Temperatur |
| 25% Metanol | 2 ml 5 min, gunga | Rumstemperatur | |
| 50% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 75% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 100% Metanol (kall) | 2 ml | 20 min, gunga | Rumstemperatur |
| 100% Metanol (kall) | 2 ml | Varierar, ingen gungn | Rumstemperatur |
| 75% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 50% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| Mempfa | 2 ml | 30 min, gunga | Rumstemperatur |
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| Blekningslösning | 4 ml | 40 min-3 h, gunga | Rumstemperatur / 37 ° C (se text) |
| Förvaring av embryon | |||
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 50% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 75% Metanol | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 100% Metanol | 4 ml | Förvara vid -20 ° C | |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, gunga | Rumstemperatur |
Tabell 6: Steg för Stoppa In Situ Hybridisering, Blekning och lagring av embryon
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Möjligheten att använda in situ-hybridisering för att visualisera expressionsmönstret av specifika gener är fortfarande den mest använda metoden för att identifiera specifika organ eller celltyper i Xenopus embryo. Detta är på grund av flera fördelar som erbjuds av denna teknik. Uttrycket av en gen kan identifiera specifika strukturer väl innan någon histologiska tecken på differentiering såsom fallet för Nkx2.5 uttryck i hjärtat stamfäder före någon klar avgränsning av dessa celler 18. När väl alla reagenser är i sidan är det också mycket kostnadseffektivt. Generering av många enskilda sonder, som effektivt kan återanvändas, är möjligt med lite extra tid och kostnad investering annat än att få de plasmider som kodar generna av intresse. Enligt vår erfarenhet kan sonder återanvändas för år med liten förlust i aktivitet trots de oundvikliga små späd som kommer med varje användning. Slutligen, det finns lite optimering behöver utförasrött när använder olika sonder.
Kvaliteten på sonden syntes är en viktig faktor i framgången av protokollet. Det finns många sätt att kontrollera kvaliteten av RNA prob utan helt enkelt kör RNA-sond på en TAE-gel är en snabb och enkel metod som är ganska tillförlitliga. Vi använder rutinmässigt etidiumbromid att färga RNA och som kräver särskild hantering och bortskaffande av gelerna av de flesta institutioner. Giftfria alternativ finns kommersiellt tillgängliga även om vi inte specifikt har jämfört dem för att visualisera sonder. Sonden ska köras som ett enda band, även om den kommer att visas något luddig jämfört med DNA på en TAE-gel. En uppskattning av den mängd RNA kan erhållas: en bra reaktion kommer att ha ungefär en mikrogram / l av RNA. En lätt visualiseras bandet kommer att representera minst 0,5 pg av RNA och ett ljust band kommer att representera över 1 pg. Även klart inte helt korrekt och kräver viss erfarenhet, kvantifiering baserad på gelen är rapid och robusthet i förfarandet situ gör att den fungerar bra. Om det finns oro för repeterbarhet, kan man enkelt använda UV-absorbans för att kvantifiera en liten mängd av transkriptionsreaktionen, även om vi inte har funnit att det är ett stort problem. Slutligen ger gelén en att se om mall-DNA har eliminerats. Om gelén indikerar att det inte finns något RNA, de två mest troliga förklaringar är en dålig DNA-mall eller att transkriptionsbuffert inte fungerar bra. Uppvärmning transkriptionen bufferten till 37 ° C och noggrann blandning före användning, eller tillägg av 1 pl färsk 100 mM DTT till transkriptionsreaktionen kan ibland hjälpa till med det senare. En viktig komponent i transkriptionsreaktionsbuffert är spermidin och det kan fälla ut DNA-mallen vid låga temperaturer gör uppvärmningen av bufferten viktiga. DTT i bufferten kan också framkalla avsevärt hämma reaktionen. Om en fällning syns i bufferten, värma lösningen ochskaka kraftigt. Det finns inget behov av att ta några ovanliga försiktighetsåtgärder, såsom behandling av vattnet med DEPC eller autoklave tips och rör, för att förhindra RNAse aktivitet. Närvaron av den kommersiella ribonukleasinhibitor ger avsevärt skydd mot RNAs från omgivningen. Observera att andra UTP etiketter kan användas, såsom fluorescein, även i vår erfarenhet, den digoxigeninmärkt UTP och anti-digoxigenin kombination antikropp ger de mest konsekventa resultat.
Tidiga protokoll för sond generation antyder att alkalisk hydrolys av de syntetiserade prober bör göras 4 för att möjliggöra en större sondpenetration. Hydrolys av proben inte visas för att hjälpa med situ hybridisering förfarandet, t.ex. RNA-prober som är större än 500 bp ger oftast en utmärkt signal och sonder som är längre än 2 kb i längd fungerar också bra. Kortare prober kan fungera om mål-RNA är riklig men längre sönder ger better färgning. Det tycks inte finnas någon klar fördel med att använda alkalisk spjälkning för att bryta upp längre sönder.
Vård i den initiala hanteringen av embryona är mycket viktigt. Borttagning av befruktning kuvertet är särskilt användbart för embryon efter neurala veck stängning och innan naturlig kläckning ur befruktning kuvertet. Under förlängning av embryot inuti befruktning kuvertet, blir embryot ringlad och om fast i den positionen, embryona är svårare att bilden efter in situ hybridisering. Men om embryona bort från befruktning kuvertet innan fixering, de snabbt räta ut. Om embryon skadas under membran borttagning, låta dem läka såret innan fixeringen eftersom skadad vävnad kan resultera i ett falskt in situ hybridisering signal vid sårområdet. Om små, såren läker mycket snabbt, ofta inom några minuter 19. Senare steg kan också skada embryon DUring vätskeöverföring och så vård behövs vid byte lösningar. Skador i tidiga steg innebär oftast att embryot dåligt kommer att skadas i slutet av förfarandet och skadade områden kommer att orsaka falskt in situ signaler vid åsynen av skador. Dessutom kan upp till 30 embryon sonderas i en injektionsflaska, men med fler embryon finns det större chanser att höga bakgrunds utvecklas under den kolorimetriska reaktionen dock öka tvättar på dag 3 eller tvättning över natten kan kompensera för detta.
I detta protokoll har antalet steg minskat och användningen av flera vanliga reagens har eliminerats. Observera att detta protokoll eliminerar flera steg som används i många andra protokoll, inklusive en proteinas K matsmältningen och användning av ättiksyraanhydrid att blockera positivt laddade grupper. Dessa åtgärder kan fortfarande vara användbart när man tittar på däggdjurs- och fågelembryon, men att använda Xenopus, eliminera dessa steg har liten effekt on de slutliga resultaten av in situ hybridisering. Vårt laboratorium har inte fastställt huruvida dessa samma förenklingar kan tillämpas på in situ hybridisering protokoll för andra arter. Proteinas K matsmältningen särskilt kan fortfarande krävas i andra embryon såsom chick eller mus där sondpenetration kan ha större begränsningar.
Användningen av BM lila substrat är bekväm och pålitlig. Det finns dock ett antal andra alternativ tillgängliga för fällning, färg alkaliska substrat som krävs för att lokalisera mål-RNA i embryot. I synnerhet är en kombination av NBT / BCIP som vanligen används 4 och fungerar bra. Vissa färgreagens är löslig i metanol, i vilket fall, kommer användningen av metanol efter färgning eliminera fläcken och måste undvikas. Andra färgkombinationer kan också användas när du utför dubbel i situs. Användningen av en liknande kombination (NBT / BCIP stället BM lila) har också visatatt vara mycket robust när musembryon 20. Den blå färgen på färgning och den endogena pigmentet av embryot är ofta svårt att tydligt urskilja i bilder. Användning av albino embryon kommer också att eliminera pigment men blekningslösningen är nästan lika effektivt och är mycket mer praktiskt eftersom det inte kräver underhåll av albino vuxna för avel. Om färgningen är relativt svag, kan stark blekning betona att färgning. Om färgningen är stark, kan lämna lite ljus pigment vara en effektiv kontrast och även hjälpa till med att orientera och iscensättning embryot.
Efter hybridisering över natt i RNA-sond, kan protokollet avvika från den strikt manuella protokoll som beskrivs här på användningen av en in situ hybridisering robot. Användningen av in situ hybridisering robot sparar nästan en hel dag som dag två och dag tre av den manuella protokoll kan reduceras till en dag som roboten arbetar genom natten end kan göra alla lämpliga temperaturförändringar. Roboten är också mycket konsekvent i sina resultat och tillåter samtidig sondering av många prover effektivt. Det återstår fördelaktigt att göra den första dagen för hand eftersom det möjliggör återanvändning av sonder och användning av mindre volymer av reagens. Den enda betydande nackdelen med att använda en robot är den initiala kostnaden för instrumentet.
Detta protokoll diskuterar några av de sätt att effektivt bild en in situ hybridisering. Det är viktigt att göra det så mycket av informationen kan gå förlorad om bilden är dålig. I många fall, avbildning av in situ resultaten av ett experiment kräver samma tid som den inledande experiment. Vissa delar av proceduren variabler såsom graden av blekning har ett inslag av personliga preferenser. Andra bildeffekter kan uppnås genom att placera skålen på en färgad bas. Ofta en liten blå nyans till agar kan betona djupblå färgning av i situ-hybridisering. Enkelt uttryckt petriskålen innehållande agar över ett ark av blå plast för att få den önskade effekten.
Men de metoder som beskrivs här ger underlag med att utforska avbildningsmöjligheter. Embryon kan ses antingen rensas (görs transparent för bättre bild interna strukturer) eller uncleared (ses som de visas under normala ljusförhållanden). En del av beslutet när det gäller hur bilden embryot är beroende på platsen för uttrycket. Om uttrycket är på eller nära ytan av embryot, är det bäst att bilden embryot utan clearing. Det finns flera fördelar med att använda de icke godkända embryon. Processen att rensa embryon kräver många steg och de kemikalier som används för att rensa embryona är svåra att hantera. Även flera håligheter i embryot tillåter utfällning av alkaliska fosfatsubstrat som kan resultera i falskt hålighet färgning. I synnerhet blastocoel av tidiga embryon och pharynGEAL hålighet visar ofta färgning (Figur 4). Denna falska färgning inte syns i embryon som inte clearas. För det mesta, även måttligt djupt uttryck kan visualiseras i avräknade embryon, inklusive mesodermala vävnader såsom hjärta, njurar och somites och endodermala Konstruktioner sådana som sköldkörtel och lever. Flytta embryona genom en metanolserie till antingen hydrat i PBS för visning eller tas i 100% metanol för lagring möjliggör för flera omgångar av lagring och bildbehandling. Metanol lagring gör att man kan prova olika ändringar i bild över längre tid.
Det finns vissa nackdelar med att använda in situ-hybridiseringsteknik att titta på genuttryck. Nivåer av yttrandefrihet är inte strikt kvantifierbara trots jämförelse inom ett embryo och brutto förändringar i uttryck och förändringar i uttrycksdomänstorleken är oftast uppenbart. Som med andra RNA-baserade tekniker, ger den inte någon information som to proteinerna som kodas av genen av intresse, vilket kan begränsa tolkningen av resultaten. Slutligen är det ofta svårt att avgöra vad som kan vara bakgrundsfärgning jämfört med den sanna uttrycket domänen. Detta är speciellt ett problem med gener med okänd uttrycksmönster som kan vara utbredd. Ofta används en prob som genererats från senssträngen av samma gen som används som en kontroll för icke-specifik färgning. Användning av en känsla sträng kontroll kan ge viss information om ett problem med reagens, men det ger inte definitiva bevis för att färgning baserad på antisens sonden är helt korrekt. Resultat från en in situ är oftast anmärkningsvärt konsekvent mellan embryon när flera embryon används och detta kan användas som ett mått på förtroende för en färgningsmönster. Dessutom kan olika antisensprober, genererade från olika delar av genen, särskilt otranslaterade regioner, användas för att se om de ger samma färgningsmönster. Om de gör det,det ger också förtroendet för observerade färgningsmönster om det är identiskt. Prober Spädda kan också användas med förlängd exponering till färgningslösningen för att se om samma färgningsmönster framträder. En faktor som brukar inger förtroende i ett färgningsmönster är om det mönstret motsvarar en specifik embryonal struktur. Tillräckligt i situs har nu gjort med en stor variation av gener som nya expressionsmönstren sannolikt relativt sällsynta händelser. Stora databaser med in situ bilder har fastställts för olika organismer som kan användas för att jämföra bildresultat. För Xenopus embryon är Xenbase (www.xenbase.org) ett utmärkt exempel på en resurs som kan användas för att förstå uttrycksmönster. Andra modellorganismer har också liknande, omfattande databaser av bilder.
Trots dessa potentiella förbehåll, in situ hybridisering förblir ett kraftfullt och pålitligt verktyg som är mycket användbart förstudiet av organogenes. Det är sannolikt att förbli den viktigaste metoden för att identifiera celltyper och undersöka förändringar i genuttryck domäner för överskådlig framtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
