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Developmental Biology

了解早期器官使用简体 Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/51526
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 2,5, 2,4,5
1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

Protocol

1.胚胎准备

  1. 如果不是作为胚胎培养，脱果冻用2.5％半胱氨酸，pH 8.0中之前定影8胚胎的一部分经常做。虽然这不是绝对必要的，它然后手动使用细镊子固定之前​​除去受精信封是有用的。
    1. 使用玻璃巴斯德吸管转移的胚胎。移液器是不够宽传送胚胎所以使用金刚石笔来切割玻璃吸管在一个点宽到足以拿起一个胚胎。通过快速传递切断端通过本生灯的火焰来熔化尖锐边缘切割后消除移液器的锐边。
      注：护理需要采取，因为即使它似乎已经冷却目测玻璃仍然很热，会造成烫伤。
  2. 在执行阶段，胚胎固定。首先，准备玻璃小瓶中的胚胎固定使用。使用这些小瓶的所有步骤，包括最后的存储。用小瓶清楚，在盖子的好聚四氟乙烯密封，允许在所有加工步骤的监测胚胎。标签使用永久性记号笔适当的实验信息的小瓶，然后盖上透明胶带标签，因为即使记号笔将失去在诉讼过程中由于使用酒精等溶剂。
    1. 使用Mempfa修复的胚胎。使在50-100毫升批次8％多聚甲醛的库存的时间。使用所需的H 2 O和热的约75％至50〜60℃，这是必要的，以获得多聚甲醛溶液中。
      注意：此解决方案比使用旧的发布的协议版本Memfa，它采用多聚甲醛，而不是甲醛略有不同。
    2. 加入2-3滴10N的NaOH或直到pH值大约为7.5（用pH试纸来检查pH值）。多聚甲醛的毒性很大，因此产生的原液在通风橱。一旦第甲醛是在溶液中，过滤通过Whatman纸上的溶液到一个新的容器中，添加的H 2 O来最终体积。如果需要的话，储存在4℃下的多聚甲醛溶液为1-2周。
    3. 组装Mempfa定影溶液（ 表1）的剩余部分。确保多聚甲醛的最终工作浓度是4％。存储在固定解决方案的所有部件，在4℃为股票。
    4. 使用切玻璃吸管中，加入胚胎与标记的玻璃小瓶已填充有大约3-4毫升Mempfa溶液（ 表1）定出的胚胎。避免定影每瓶超过20-30胚胎。添加的胚胎以最小从胚胎介质液体传输。固定在Mempfa溶液胚胎2小时，在室温下过夜或在4℃下。
    5. 对于后期的内胚层结构上手动隔离肠道和内胚层衍生工具9,10进行的拓扑，其允许探针的良好渗透和还避免空腔染色。
    6. 存储100％的甲醇在-20℃的溶液中。的多聚甲醛固定后，替换为约4毫升的-20℃，100％的甲醇用于存储的胚胎的Mempfa溶液。
    7. 加入甲醇后摇动小瓶，以防止胚粘到玻璃或其它胚胎。另外，确保小瓶密封，因为甲醇可如果松动，在冷冻蒸发随着时间的推移。
      注：胚胎可以存储在至少一年的时间，并有可能更长，在以染色与原位杂交质量没有损失的现有的甲醇。

2.探针制备

  1. 用1-2微克模板DNA，使高辛标记的探针。含有合适的DNA序列在用限制性感兴趣的基因的5'端切割酶的质粒适于塔T载体，产生反义RNA探针。
    注：质粒应当具有适当的RNA聚合酶结合位点（ 例如 T7，T3或SP6）。
  2. 允许该DNA，水，NTP混合和聚合酶缓冲温热至室温，组装探针合成反应之前。添加的顺序的RNA合成反应到1.5ml微量离心管中的成分如表2中列出。调整水的量加入，使所述探针合成反应的总体积为20微升。装配在室温下将反应因聚合酶缓冲的部件可以沉淀在高浓度和冷的模板DNA时。
  3. 孵育2小时，在37℃的转录反应。
    注：稍长于两个小时的孵育导致无不良影响，而且还显示很小增加的产量。如果温育1小时，产率会降低，但仍足以使一个好的探针。
    1. 在等待转录反应到结束，使将要用于测试探针的质量的琼脂糖凝胶。熔体1微克琼脂糖在100毫升1×TAE缓冲液的（ 见表1）通过加热该溶液到沸点。起锅的解决方案时，琼脂糖粉完全溶解。
    2. 添加2微升溴化乙锭原液（10毫克/毫升），以约100毫升琼脂糖凝胶时琼脂糖已冷却至约60℃，以允许的RNA在紫外线（UV）光可视化。
      注意：此琼脂糖凝胶溶液，可以保持在60℃的培养箱中，使得将来的凝胶可以在不重复的熔化浇。小心处理溴化乙锭由于潜在的毒性。
  4. 添加1μl的DNA酶I（无RNA酶的级）的转录反应的2小时温育后，孵育另外10分钟，在37℃下，以消除模板DNA。
  5. 除去1微升反应混合物中，以检查在1％琼脂糖TAE凝胶和其余（20微升）中的TE缓冲液（10mM的Tris pH值8.0，1mM EDTA）中，加入10μl5M NH 4醋酸纤维，和220微升添加80μl的1％SDS的冷乙醇。涡大力混合，并预留冰上直到RNA质量检查的结果是已知的。
    1. 运行1微升RNA沉淀在1％琼脂糖凝胶TAE前去除。为了缓解加载在凝胶上，加4-5微升水和1μl的标准样染料与RNA。查看使用UV光透射​​凝胶中的RNA，以检查探针的质量（见讨论）。
  6. 沉淀被搁置在冰上，在步骤2.5通过纺丝在微量全速进行10至15分钟，剩余的RNA。抽出上清液用抽出玻璃吸管，并允许简单干燥。
    1. 重悬探针用1ml的RNA杂交缓冲液（ 见表1），在微量离心管中。涡和BRiefly再次加热该管至37℃并涡旋。探头溶液转移到一个15毫升的螺丝帽聚苯乙烯管，并填写7-10毫升RNA杂交缓冲液。注意：该探针可以进一步稀释（10倍进一步稀释仍然可以工作）常常导致低的背景，但在染色反应也将花费更长的时间。

3. 在原位杂交

  1. 取被储存在-20℃的甲醇，该胚胎，并允许温热至室温。在玻璃小瓶中执行整个过程。如果从一组不同的胚胎要由不同的探针来看待，使他们在一个单一的小瓶中加入之前的探针，以减少在第一天的变异和劳动罚金。
    1. 再水化通过甲醇系列胚胎根据在制备例表3（见表1对洗涤配方）概述的加成探针。轻轻摇动安莉芳每次更改后的OS，以确保它们不会附着在侧面或彼此，并且通过安装在小瓶一个nutator摇动胚胎。当传送的液体，检查盖的内侧，以确保胚胎尚未被困在那里。
    2. 一旦在探针溶液，如表3中所述杂交胚胎过夜。
  2. 拆除探头的解决方案。减所使用的探针通过存储在15ml螺丝帽的聚苯乙烯管中，标有日期和时间的探针已被用于数，在-20℃下。
    注意：相同的探针可以重复使用多次为原位杂交随后直至比色反应开始采取异常长的时间以达到期望的强度。
    1. 一旦探针被去除，制备了胚胎对通过串联在表4中概述洗涤的探针抗体染色。改变温度的要求（ 表4）通过移动吨他章动器，附加的胚胎的小瓶，直接进入被设置为适当的温度的杂交炉。
    2. 弥补了MAB适当体积+ HTSS + BR +抗DIG抗体（ 表4），在该胚胎被培养在MAB + HTSS + BR封闭液，使抗体之前加入到阻止时间胚胎。使阻断溶液新鲜上使用的当天。
  3. 除去抗体溶液，并开始如以下过夜孵育抗体在表5中概述的洗涤。为了染色准备与碱性磷酸酶底物，并减少背景尽可能执行至少12 30分钟洗涤。使用任一MAB缓冲或TBT溶液（ 表1），用于洗涤步骤。
    注：TBT溶液是TTW具有2mg / ml的牛血清白蛋白的补充。
    1. 替换为BM紫碱性磷酸酶底的最后洗涤液。进行染色REAC灰在室温或37℃。
      注：染色是在37℃，更迅速，但如果放置过夜，不可接受的背景染色往往是一个结果。染色反应往往需要通宵染色和室温下是最安全的了。
    2. 如果进一步染色是必需的，对BM紫溶液将具有一种蓝色，替换以新鲜的BM紫染色溶液，并把管放入37℃。如果靶mRNA是非常丰富，放于染色溶液中的胚胎在4℃下过夜，然后将胚胎至室温或37℃，以允许更好地监测该染色反应。
    3. 仔细监测新的反应，随着时间的最终结果，不同的目标的RNA之间有很大的差别。为了保持一致性，停止染色反应（见3.4）时，有较长的潜伏期而产生的表达没有新的站点。重要的是，如果在原位杂交被用作测定对于实验看不同的治疗组，使用相同的时间进行治疗和对照胚胎之间的颜色反应。
  4. 停止染色反应和制备的胚胎用于存储和图像记录通过如在表6中概述改变的液体。在此阶段，不要摇动胚胎因为去除污渍可以被可视化为围绕胚胎的甲醇紫色着色。
    注意：通常胚胎有从染色溶液和冷的甲醇可以至少部分地移除光蓝染色，虽然这是不足够的，以除去重背景或空腔染色。冷甲醇是指保持在-20℃的冷冻的甲醇。
    1. 再水合胚胎和修复Mempfa（ 表6）的污点。一旦固定，取下Mempfa和洗涤，用25％甲醇的胚胎。
    2. 除去25％的甲醇和如果添加漂白溶液除去内源性颜料是必须的。小心处理漂白解决方案，它可引起灼伤。密切观察漂白，因为它发生相对迅速和漂白的程度可以变化为不同的效果（ 图2）。
    3. 通过甲醇系列至100％甲醇于长期贮存以下漂白脱水胚胎，或转移到PBS中于短期存储和随后的成像（ 见表6）。

4.成像胚胎

  1. 一旦胚胎已完成染色的过程中，图像中的胚胎，使上，其中感兴趣的基因表达的信息被捕获为更广泛的观众。琼脂糖使用1％作为背景，查看未清除的胚胎。
    注：琼脂糖给出一个蓝色/灰色的背景，与胚胎和染色反应的蓝色对比井。它还有助于弥漫出现阴影和转移注意力从胚胎反射。
    1. 琼脂糖加入水，然后煮沸，直到琼脂糖是在溶液中，然后放凉到50倒入培养皿之前。由于与TAE凝胶液，保存在55℃培养箱用于多种用途的琼脂糖溶液。倒入琼脂糖至约2mm的深度到陪替氏培养皿中。如果需要的话，调整的琼脂糖的深度以产生稍微不同的色光的背景。
    2. 以下从存储在甲醇补液的水溶液（PBS或TTW），使用甲醇系列，放置在培养皿中的琼脂糖基的胚胎（ 见表6）。保持清洁的解决方案，如果需要，可以使用简单的过滤，消除小颗粒物，能破坏的良好形象干净的背景。
    3. 图像从备用视图，如从腹侧胚胎，切细的通道中使用的琼脂糖细镊子以适合胚胎并放置在胚胎中的那些信道对的方向（ 图3中 注意：大多数阶段都有自己承担时，放入溶液中的特征位置。例如，囊胚期胚胎倾向于坐动物朝上。当胚胎开始拉长，他们躺在自己的身边。
  2. 使用光纤光源从一个浅角度照亮胚胎，创建提供深度图像上的阴影胚胎，并有助于辨别表面结构。由于漂白可以消除色素，提供有用的标志性建筑，用阴影的强烈漂白的胚胎。
  3. 清除胚胎染色图像是深的胚胎内，如在脊索，肺，或脑部，（ 图4）的区域。为了实现这一点，把通过甲醇系列的胚胎直到在100％甲醇。
    1. 在甲醇中完成浸泡后，将胚转移到溶液1份苄醇和2份苄基是nzoate（BABB）。胚胎最初将浮在表面上，但由于与BABB甲醇混合，它们将沉入BABB。每次执行与BABB处理玻璃小瓶或菜肴一步; BABB会融化任何塑料或油漆。
    2. 一旦清除，查看与透射光从胚胎下方传来的胚胎。调节光的强度，以及所述角度从下方，以提高对比度，并提供最好的颜色。
    3. 当观看清除胚胎提高玻璃培养皿关闭基地。只需使用另外两个培养皿的盖子，以提高它，以便与胚胎菜的区域升高做到这一点。
      注意：这具有服用碱失焦和消除从在显微镜基，可以与图像干扰的缺陷或污迹分散效果的优点。

5.双击原位杂交

  1. 为了同时查看总重量的表达模式o在单个胚胎不同的基因，合成两个探头，一个用于每个不同的基因。合成使用DIG-11-UTP作为标签如上所述一个探针。稀释在核糖核酸杂交缓冲液的转录反应的产物，以产生3倍更浓缩的探针比用于单原位杂交。
    1. 合成其它探针的利益使用相同的协议，作为DIG标记探测不同的是荧光素-12-UTP，必须取代DIG-11-UTP。稀释在核糖核酸杂交缓冲液的转录反应的产物，以产生3倍更浓缩的探针比用于单原位杂交。
    2. 混合两种浓缩探针以1：1的比例。为了达到最佳效果，使用荧光素标记探针，显示了强大的表达在单原位杂交协议的基因。
  2. 原位杂交协议使用相同的描述单原位</ em>的杂交，除了使用双探针（探针含地高辛标记和荧光标记的探针的1.5倍浓缩混合物）在第一天的代替单个原位杂交探针的末端。
    1. 按照对双原位杂交协议的第二天单杂交协议，除了在一个1使用抗荧光素-AP Fab片段：4000稀释代替抗DIG-AP Fab片段。从胚胎中洗出过量的抗体作为单原位协议，并进行第一色反应使用BM-紫色的AP底物。
  3. 继第一显色反应，灭活荧光素抗体的0.1M甘氨酸pH值2.0 40分钟后万分之五分钟洗的人与生物圈计划。阻止MAB + HTSS + BR胚胎90分钟。添加抗DIG抗体以1：2000稀释MAB + HTSS + BR和孵化在4℃过夜。
    1. 次日，洗涤胚胎第oroughly在生物圈（12次洗涤30分钟），以除去过量的抗体。
    2. 洗胚胎中的AP缓冲液10分钟（ 表1），然后染色用BCIP（为0.5mg / ml，在AP缓冲液）。
      注： 在原位组合应该得到暗蓝紫色染色剂用于第一色反应和用于第二（ 图5）为淡蓝色的显色反应。
    3. 停止最终色反应通过除去AP缓冲液和冲洗三次生物圈。固定用Mempfa胚胎10分钟。与5速洗的MAB或TBT洗胚胎。
    4. 与此颜色组合，在后染色处理使用甲醇不再可能，因为这将消除BCIP单独颜色。染色和固定在PBS中与0.02％叠氮化钠后存储所述胚胎。染色强度可以与疲软的双重所在地 。如果这是一个问题，减少洗涤至4，每2个小时的持续时间。

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Representative Results

利用组织特异性探针可以在关于开发特定器官的状态提供了优秀的信息。在下列实施例中，胚胎的阶段是基于新科普和费伯临时表11。若用分化后表达的探针形式的基因， 心肌肌钙蛋白I在阶段28-30，例如（ 图1C），分化的器官的存在或大小可以在任何阶段交分化进行评估。几年前，胚胎学家们能够基于早期胚胎12,13的组织学显着的知识，做这样的分析，但这些专业知识已经在很大程度上失去了目前这一代的胚胎学家的。虽然，本专业技术的损失可以被认为令人遗憾， 原位杂交技术的可靠性和易用性使得标识提供给任何研究者的特定组织中。组织是相对不显眼，叔他在胚胎期25例（ 图1A）孵化腺体，可以使用拓扑而不需要特异性抗体或组织学技术（ 图1C）来生动地标记。另外， 在拓扑的使用整装的允许一个以查看整个胚胎的上下文中，整个器官，而不是依赖于从组织切片（ 图2）的推断。甚至组织是胚胎，包括视柄（ 图4）内的深可以很容易地观看和使用胚胎结算可以提供器官的边界的尖锐轮廓。

胚胎漂白使用过氧化解决方案已经在很大程度上消除了使用缺乏色素白化胚胎的要求，以消除内源性色素。漂白对于不同的时间可能是有用的。例如，如果污渍强，一个打火机漂白，允许某些色素沉着待观察可能是有用的，因为它的所有OWS更好的分期和胚胎（ 图2A）的方向。然而，如果污渍是在有在漂白溶液高水平的色素沉着，如肾（ 图2B），几乎完全消除了颜料的用较长的温育的区域给出了一个更好的结果。

胚胎往往在溶液中时，占用特定的位置。神经胚形成后，他们往往将其平放在身体两侧。这是细的侧翼（ 图2B）的图像，但可以是与其他领域中的问题。使用琼脂糖碱允许一个切通道成可以使用定向胚胎琼脂糖。例如，血液前体定位于胚胎（ 图2A）和染色的完整范围的腹侧被难以观测。与腹侧沟道胚胎定位，然后允许全屏观看该基因的表达模式（ 图3A）的。 原位杂交使用双能显示在一个单一的有机体（ 图5）消除可能具有在形态的微小差异不同的胚胎之间比较的必要性2的基因表达模式之间的关系。或许最重要的是， 在原位杂交中使用的赋予1的功能明确标记清除基于基因被表达于谱系的早期祖先，如PAX2被表达在许多组织中表达组织分化前的细胞早期胚胎，在微分之前（ 图4A）。找出祖细胞和组织没有明确区分的基础上组织学的，如髓样细胞前体（ 图1B）的能力，使得研究人员询问有关器官的发育状况更详细的问题，并评估实验结果米anipulation设计以引起组织的异位分化。

图1
图1：在整个安装中的爪蟾胚胎原位杂交的例子来自蓝染色原位杂交实验中可以清楚地描绘发展早期非洲爪蟾胚胎的结构（A）的一个阶段26胚胎的前视图突出孵化腺。所划分uvs.2 14的表达（B）一种胚胎表示早期骨髓细胞的位置，在级20使用髓过氧化物酶 15的表达作为标记（C）的早期心脏在阶段28的腹面观。 - 30由心肌肌钙蛋白I 16的表达可视化。使用这种方法的一个明显的优点是，所有的这些基因的表达模式使用不同的探针可视化，但所使用的协议是在所有情况下是相同的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2：不同的漂白的水平可用于可视化染色在胚胎（A）中该蓝染色沿着该胚胎的底部示出的血红蛋白在腹侧血岛的表达在约阶段36这是一个区域。胚胎即只轻轻着色，因此胚胎未漂白为如可通过褐色色素的眼睛沿胚胎的侧面可以看到一个长的时间。能够看到的色素沉着允许更好的可视化胚胎的阶段的。如果染色是用更大的自然色素沉着，一个区域，如神经系统和胚胎的侧翼，更大的漂白将有助于查看现场作为B.（B）看到这里PAX8 17的表达在肾脏形成，pronephric管和后脑是最好的可视化漂白后，消除了几乎所有的内源性色素。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3：琼脂糖碱的操纵可以帮助与胚胎的取向 ，因为他们往往占用在盘特定位置上的胚胎成像的特定区域可能是困难的（A）中在蝌蚪阶段胚胎将位于其一侧。 。通过切廷在琼脂糖细通道（黑色箭头）的胚胎可以从腹侧观看，这里示出在阶段36 的血红蛋白的表达，只要有足够的稳定性以捕获了良好的图像。（B）中 ，在阶段HAND1这种表达腹面观20概述了侧板中胚层6。胚胎被放置在稳定其与腹侧位置的小孔。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4：内部器官可以在两个不透明的，未清除和清零胚胎阶段34（A）中，视柄（黄色箭头） 被视为在一个未清除的胚胎染色PAX2可以相对容易地可视化作为可以染色下来的神经管。但是，细节不清晰。通过清除胚胎（B）的表达网站的边界，包括视柄（黄色箭头）的清晰。结算的程度示出通过看两个眼睛在这种清零胚胎的能力。还要注意的是一些染色已在内部空腔（紫色箭头），可视清零胚胎当一个共同的问题积累。

图5
图5：A代表双原位杂交上的爪蟾胚胎的横板标记的表达，HAND1，被光蓝染色在阶段可视显影脉管内ETV2 26.表达由深蓝紫色染色可视化。 HAND1的表达通常是非常激烈的，因此它被用于吨他弱荧光标记探针和BCIP组合。在所使用的地高辛标记的探针和BM-紫色组合较弱ETV2表达。

名字 终浓度 量/ 100ml的
Mempfa 1毫米硫酸镁4 100微升的1M MgSO 4干燥
（储存在4°C）的 2mM的EGTA，pH 8.0的加入10ml的20mM EGTA，pH 8.0的
0.1M的MOPS，pH值7.5 加入10ml的1M MOPS，pH为7.5
4％多聚甲醛，pH值7.5 50毫升8％多聚甲醛，pH值7.5
TTW 的50mM Tris，pH 7.4中加入5ml的1M Tris，pH 7.4中
200毫米氯化钠加入4ml 5 M氯化钠
0.1％吐温20 100微升吐温20的
100X登哈特的解决方案 2％BSA的 2克BSA
（过滤通过0.2微米的过滤器， 2％PVP-40 2克PVP-40
在-20℃店） 2％聚蔗糖400 2克聚蔗糖400
20X SSC 3M NaCl的 17.5克氯化钠
300毫米柠檬酸三钠 8.8克柠檬酸三钠
RNA杂交缓冲液 50％的甲酰胺 50毫升100％甲酰胺的
（储存在4°C）的 5X SSC 将25ml 20×SSC的
1mg / ml的酵母RNA 4毫升的1mg / ml的酵母RNA溶解在50％甲酰胺
1X登哈特的解决方案将1ml 100X Denhardt溶液
0.1％吐温20 100微升吐温20的
5毫摩尔EDTA，pH 8.0的将1ml的0.5M EDTA，pH 8.0的
MAB 100毫米马来酸 1.16克马来酸的
（pH值7.5，保存于4℃） 150毫米氯化钠 0.88克氯化钠
MAB + HTSS + BR 100毫米马来酸 96毫升MAB的
4％热处理羊血清加入4ml热处理羊血清（加热处理在55℃进行30分钟，并等分）
2％封闭试剂 2克罗氏封闭试剂
MAB + HTSS + BR +抗DIG抗体 100毫米马来酸 96毫升MAB的
4％Tr的热eated羊血清 4毫升的热处理羊血清
2％封闭试剂 2克罗氏封闭试剂
1：10,000抗DIG-AP，Fab片段抗体 1.5微升抗洋地黄毒苷-AP，Fab片段抗体
碱性磷酸酶（AP）缓冲 100毫米的Tris，pH值9.5 加入10ml的1M Tris，pH值9.5
50毫米氯化镁2 加入5ml的1M MgCl 2的
100毫米氯化钠加入2.5ml 4M的氯化钠
0.1％吐温20 100微升吐温20的
漂白解决方案 0.3％H 2 O 2 3.34毫升30％H 2 O 2
5％甲酰胺 5毫升100％甲酰胺的
0.5％SSC 加入2.5ml 20×SSC的
结算解决方案 1/3苯甲醇 33毫升
2/3苯甲酸苄酯 67毫升

表1：解决方案食谱

名字 量
挖-NTP混合 5微升的20mM CTP
（40微升反应） 5微升的20mM GTP
5微升的20毫摩尔ATP
3.25微升20mM的UTP的
3.5微升10毫挖-11-UTP的
18.25微升蒸馏水，灭菌水
探针合成 X微升模板DNA的（依赖于浓度）
（20微升反应） X微升蒸馏水，高压灭菌水
4微升掏-NTP组合
0.5微升RNA酶抑制剂
2微升10X聚合酶缓冲
2微升RNA聚合酶的

表2：探针合成食谱

该试剂的名称 近似体积 长短 温度
100％甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
75％甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
50％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
25％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
TTW 2毫升 10分钟，摆动室温
TTW 2毫升 10分钟，摆动室温
TTW 2毫升 10分钟，摆动室温
预暖RNA杂交缓冲液和探头，以65℃
TTW 4毫升 5分钟，摇室温
TTW 4毫升 5分钟，摇室温
RNA杂交缓冲液 2毫升 10分钟，摆动客房。温度Ë
预热的RNA杂交缓冲液 2毫升 1小时后，摇摆 65℃
探测解决方案 1毫升一夜之间，摇摆 65℃

表3：第一天原位杂交协议（约3小时计）的步骤

该试剂的名称 近似体积 长短 温度
预暖RNA杂交缓冲液和0​​2.x SSC至65°C和2X SSC至37℃
返回探测器解决方案，管重复使用
RNA杂交缓冲液 2毫升 10分钟，摆动 65℃ 2X SSC 2毫升 20分钟，摇 37℃
2X SSC 2毫升 20分钟，摇 37℃
0.2X SSC 4毫升 1小时后，摇摆 65℃
0.2X SSC 4毫升 1小时后，摇摆 65℃
MAB + HTSS + BR 1.5毫升 30分钟后，摆动室温
MAB + HTSS + BR +抗DIG抗体 1.5毫升一夜之间，摇摆 4℃

表4：二日在原位杂交协议（约4小时计）的步骤

该试剂的名称 近似体积 长短 温度
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
MAB 4毫升 30分钟后，摆动
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
MAB 4毫升 30分钟后，摆动室温
BM紫AP底物 500-750微升一夜之间，摇摆（见正文） 房间温度/ 37°C（见正文）

表5：第三天原位杂交协议（约7小时）步骤

该试剂的名称 近似体积 长短 温度
25％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
50％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
75％甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
100％甲醇（冷） 2毫升 20分钟，摇室温
100％甲醇（冷） 2毫升因人而异，没有摇摆室温
75％甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
50％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
25％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
Mempfa 2毫升 30分钟后，摆动室温
25％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
25％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
25％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
漂白解决方案 4毫升 40分钟，3小时，摇摆房间温度/ 37°C（见正文）
存储胚胎
25％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
50％的甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
75％甲醇 2毫升 5分钟，摇室温
100％甲醇 4毫升储存在-20℃
1X PBS 2毫升 5分钟，摇室温
1X PBS 2毫升 5分钟，摇室温
1X PBS 2毫升 5分钟，摇室温

表6：停在原位杂交胚胎，漂白和存储步骤

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Discussion

使用原位杂交技术来可视化特定基因的表达模式的能力仍然是最常用的方法，以确定在非洲爪蟾胚胎的特定器官或细胞类型。这是因为通过该技术提供若干优点。的基因的表达可以前充分分化的任何组织学征兆确定具体的结构，例如在之前的那些细胞18的任何明确划界的心脏祖细胞NKX2.5表达的情况。一旦所有的试剂是在手，它也是非常符合成本效益。许多个别的探针，能够有效地再利用，产生的是可能与一些额外的时间和成本的投资比获得编码感兴趣的基因的质粒等。根据我们的经验，探针可重复使用多年，几乎没有损失活性尽管不可避免小稀释附带每次使用。最后，还有一点优化requi红利用不同的探头时。

探针合成的质量是在协议的成功的关键因素。有很多种方法来检查RNA的探针的质量，而只是在TAE凝胶上运行的RNA探针是一种快速，简单的方法，该方法是相当可靠的。我们经常使用溴化乙锭染色的RNA和需要特殊处理和处置的凝胶被大多数机构。无毒的替代品是可商购的，尽管我们没有特别相比那些用于显像探针。探头应作为一个单一的频带中运行，虽然相比于TAE凝胶的DNA会出现一定程度的模糊。 RNA的数量的估计值可以得到：一个好的反应将具有约1微克/微升的RNA。容易显现乐队将代表至少0.5 RNA微克和亮带将代表超过100微克。虽然显然并不完全准确，需要一定的经验，量化基于凝胶是说唱ID和的原位过程的鲁棒性使得它能够很好地工作。如果对重复性的关注，人们可以很容易地使用紫外吸收量化少量的转录反应，虽然我们还没有发现这是一个大问题。最后，凝胶允许人们看到如果模板DNA已被淘汰。如果凝胶表明不存在的RNA，这两个有可能的解释是一个坏的DNA模板或转录缓冲都不尽如人意。加热该转录缓冲至37℃，并充分混合后使用，或添加1微升新鲜的100mM DTT于转录反应可以偶尔帮助与后者。转录反应缓冲液的一个重要组成部分是亚精胺和它可以沉淀在低温下使缓冲重要的变暖的DNA模板。 DTT在缓冲器也可以沉淀显著抑制反应。如果沉淀被认为是在缓冲液，温热的溶液中并涡大力。没有必要采取任何不寻常的预防措施，如处理水用DEPC或高压灭菌提示和管，以防止RNA酶的活性。商用核糖核酸酶抑制剂的存在提供了相当的保护，防止来自环境的RNA酶。需要注意的是其它双绞线的标签都可以使用，如荧光素，虽然在我们的经验中，地高辛标记的UTP和抗洋地黄毒苷抗体的组合提供最一致的结果。

用于探测生成早期协议建议合成探针的碱性水解应该以允许更大的探针渗透进行4。探针的水解未出现，以帮助与原位杂交过程;大于500 bp的RNA探针通常给一个很好的信号和探测长度超过2 KB的长度也很好地工作。较短的探头可以工作，如果目标RNA丰富，但较长的探针会给B埃特染色。有不出现任何明显的优势，在使用碱性消化分手较长的探针。

在意在胚胎的初始处理是非常重要的。除去受精封套是用于神经褶闭合和自然孵化之前出受精信封的后胚胎特别有用。在受精信封内的胚胎的伸长，胚胎变得卷曲，如果固定在该位置，所述胚胎是原位杂交更难图像后。但是，如果将胚从固定之前的受精信封除去，它们迅速理顺。如果胚在膜除去损坏，允许它们医治固定之前的伤口，因为受损组织可以在伤口部位导致原位杂交信号假。如果小，伤口愈合得很快，往往在几分钟之内19。由于以后的工序也能破坏胚胎杜变化的解决方案时，环移液等保健是必要的。在早期步骤损伤通常意味着胚胎将受到严重的过程结束时破损和损坏的区域将导致错误的原位信号在损伤的视线。此外，多达30个胚胎可以在一个单一小瓶但具有更多的胚胎被探测有高背景的比色反应中培养更多的机会，但是增加了洗涤在第3天或洗涤过夜可以弥补这一点。

在这个协议中，步骤的数目已经减少并且使用几种常用的试剂已被淘汰。请注意，该协议消除了在许多其他协议，包括一个蛋白酶K消化和使用乙酸酐来阻止带正电荷的基团使用的几个步骤。这些步骤时，看着哺乳动物和鸟类的胚胎，但在使用爪可能仍然是有用的，消除了这些步骤没有太大影响Øn的原位杂交的最终结果。我们的实验室还没有确定这些相同的简化是否可应用于原位杂交协议其他物种。蛋白酶K消化尤其可能仍然需要在其他胚胎如小鸡或鼠标，其中探针渗透可能有更大的限制。

使用BM紫衬底的方便可靠。但是，也有一些其他选项可用于所需要的定位在胚胎靶RNA沉淀，颜色碱性基材。特别是，NBT / BCIP的组合通常用于4和效果很好。一些彩色试剂是溶于甲醇，在这种情况下，染色后使用甲醇将消除色斑，必须避免。其他颜色组合还可以在拓扑进行双时使用。采用了类似的组合（NBT / BCIP而非BM紫色）也已示出用小鼠胚胎20时是非常强大的。染色的蓝色和胚胎的内源色素往往难以明确区分中的图片。使用白化胚胎也将消除色素但漂白溶液几乎是一样有效和更方便，因为它不要求白化成人用于育种的维护。如果染色比较弱，强漂白可以强调染色。如果染色强，致使一些浅色素，可有效的对比，也有利于与定向和分期胚胎。

在RNA探针的杂交过夜后，该协议可以偏离这里概述的原位杂交机器人使用的严格手册协议。几乎一整天原位杂交机器人使用的保存作为第二天和手动协议的第三天可以减少为一天作为机器人工作彻夜一个D可使得所有的相应的温度变化。该机器人还处于它的结果非常一致，并允许同时有效地探测许多样品。它仍然是有利的手工完成的第一天作为其允许探针的再利用和使用较小体积的试剂。使用机器人的唯一显著缺点是仪器的初始成本。

该协议将讨论的一些方法，以有效地像的原位杂交。这样做的尽可能多的信息可能会丢失，如果图像差是重要的。在许多情况下，实验的原位结果成像需要的同时，在初始实验。该过程变量的一些元素，如漂白的程度有个人喜好的元素。其他的成像效果可以通过将盘上的彩色基来实现。经常有轻微的蓝色遮阳琼脂可以强调的静坐中的深蓝色染色ü杂交。简单地把含有琼脂培养皿上的蓝色塑料片材，以获得所需的效果。

然而，这里介绍的方法提供与探索成像的可能性的基础。胚胎可以被视为任何清除（因为它们在正常照明条件下出现看去）（由透明，以更好地视图内部结构），或者未清除。一些在问候如何将图像中的胚胎是依赖于表达的部位的决定。如果表达式为上或胚胎的表面附近，最好是将图像的胚胎不结算。有几个优点，以使用未清除的胚胎。清除胚胎的过程需要很多步骤，用于清除在胚胎的化学物质是难以处理。此外，一些腔在胚胎容许的碱金属含磷酸盐底物，可能导致假腔染色沉淀。早期胚胎及pharyn的具体地，囊胚geal空腔常显示染色（ 图4）。这种虚假的染色是不是在未清除胚胎可见。在大多数情况下，甚至中等深度表达可以可视化在未清除的胚胎，其中包括中胚层组织如心脏，肾和体节和内胚钢结构如甲状腺和肝脏。通过甲醇系列要么水合物在PBS观看或投入100％甲醇为存储移动胚胎允许多轮的存储和成像。甲醇存储允许一个尝试不同的修改的摄像在延长的时间。

也有一些缺点，使用原位杂交技术来看待的基因表达。表达水平不严格量化的，虽然胚胎和毛利率变化的表达和变化，表达域的大小范围内的比较通常是显而易见的。与其它的RNA为基础的技术，它不提供任何信息为tø由感兴趣的基因，它可以限制结果的解释编码的蛋白质。最后，它往往是很难确定什么可能是背景染色相比于真实表达域。这是特别的基因与可广泛未知表达模式的一个问题。通常，来自相同基因的有义链中产生的探针被用作用于非特异性染色的对照。使用有义链的控制，可提供关于与试剂中的问题的一些信息，但它并没有提供明确的证据表明，染色基于所述反义探针是完全准确的。结果从原位通常显着地跨胚一致时多个胚胎的使用和这种可以用作信任一个染色模式的量度。此外，不同的反义探针，从基因的不同部分，特别是非翻译区，产生可用于查看它们是否得到相同的染色模式。如果他们这样做，它也提供了信心观察染色模式，如果它是相同的。稀释探针也可与长时间暴露在染色溶液中使用，以查看是否相同的染色模式出现。一个因素，通常鼓励信心在染色模式是否该图案对应于一个特定的胚胎结构。够在拓扑现已完成了大量的各种基因的新的表达模式很可能相对罕见的事件。 原位图像大型数据库已经建立了可用于比较图象的结果不同的有机体。对非洲爪蟾胚胎，Xenbase（www.xenbase.org）是可用于理解表达模式的资源的一个很好的例子。其他模式生物也有图像的类似，丰富的数据库。

尽管有这些潜在的警告， 原位杂交仍然是一个强大而可靠的工具，它是非常有用的研究器官的。它很可能继续选择用于识别的细胞类型和检查改变的基因表达结构域，在可预见的未来的方法。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Labguake Tube Shakers VWR 17-08-2011
VWR Vials VWR 10-07-2012
L-Cysteine BioShop CYS342.500
Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM Roche 11277057001
Digoxigenin-11-UTP Roche 11209256910
Rnase inhibator (Rnase OUT) Invitrogen  10777-019
T7 RNA Polymerase Fermentas EPO111
T3 RNA Polymerase Fermentas EPO101
SP6 RNA Polymerase Fermentas EPO131
Dnase 1 Invitrogen  18047-019
Sheep Serum  Wisent 31150
Blocking reagent Roche 11096176001
BM purple Ap Substrate Roche 11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments Roche 11093274910
Methanol VWR CAMX0485-7
NaCl BioShop SOD002.10
SDS EM  7910
EDTA BioShop EDT001.500
Tris BioShop TRS003.5
Tween-20 EM  9480
MgSO4 Sigma M-2643
Mops BioShop MOP001.250
EGTA Sigma E-3889-25G
Paraformaldehyde BioShop PAR070.500 
Formamide  VWR     CAFX0420-4 
RNA Roche 10109223001
Maleic Acid  VWR     CAMX0100-3
tri-Sodium Citrate BioShop CIT001
Hydrogen Peroxide (30% Solution) EM  HX0635-2
BSA BioShop ALB001.100
PVP-40 ICN 195451
Ficoll 400 GE Healthcare 17-0300-10
Benzyl Alcohol Sigma B-1042
Benzyl Benzoate Sigma B-6630
UltraPure Agarose  Invitrogen  16500-500

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发育生物学，第95，爪蟾，器官，
了解早期器官使用简体<em&gt;原位</em&gt;杂交协议<em&gt;爪</em
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Deimling, S. J., Halabi, R. R., Grover, S. A., Wang, J. H., Drysdale, T. A. Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus. J. Vis. Exp. (95), e51526, doi:10.3791/51526 (2015).

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