Protocol
1. भ्रूण तैयारी
- भ्रूण संस्कृति, पीएच 8.0 से पहले निर्धारण करने के लिए 8 2.5% सिस्टीन, का उपयोग डे-जेली भ्रूण के हिस्से के रूप में नियमित रूप से नहीं किया है। यह बिल्कुल जरूरी नहीं है तो स्वयं ठीक संदंश का उपयोग करने से पहले निर्धारण करने के निषेचन लिफाफा दूर करने के लिए, यह उपयोगी है।
- भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए कांच पाश्चर pipettes का प्रयोग करें। पिपेट भ्रूण तो एक भ्रूण को लेने के लिए पर्याप्त चौड़ी एक बिंदु पर कांच पिपेट कटौती करने के लिए एक हीरे की कलम का उपयोग करें स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त विस्तृत नहीं है। जल्दी से तेज किनारों पिघला करने के लिए एक लेम्प बर्नर की लौ के माध्यम से कटौती टिप गुजर द्वारा काटने के बाद pipettes के तेज किनारों को हटा दें।
नोट: केयर यह दृश्य निरीक्षण से ठंडा हो गया लगता है, भले ही गिलास अभी भी जलता पैदा करने के लिए काफी गर्म हो सकता है, के रूप में लिया जाना चाहिए।
- भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए कांच पाश्चर pipettes का प्रयोग करें। पिपेट भ्रूण तो एक भ्रूण को लेने के लिए पर्याप्त चौड़ी एक बिंदु पर कांच पिपेट कटौती करने के लिए एक हीरे की कलम का उपयोग करें स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त विस्तृत नहीं है। जल्दी से तेज किनारों पिघला करने के लिए एक लेम्प बर्नर की लौ के माध्यम से कटौती टिप गुजर द्वारा काटने के बाद pipettes के तेज किनारों को हटा दें।
- चरणों में भ्रूण निर्धारण प्रदर्शन करते हैं। सबसे पहले, भ्रूण निर्धारण में उपयोग के लिए कांच की शीशियों तैयार करते हैं। अंतिम सहित सभी चरणों के लिए इन शीशियों का प्रयोग करेंभंडारण। प्रक्रिया के सभी चरणों के दौरान भ्रूण की निगरानी के लिए अनुमति देने के ढक्कन में एक अच्छा Teflon के मुहर के साथ स्पष्ट कर रहे हैं कि शीशियों, का प्रयोग करें। स्थायी मार्कर का उपयोग कर उचित प्रयोगात्मक जानकारी के साथ शीशियों लेबल और यहां तक कि स्थायी मार्कर के कारण एल्कोहल और अन्य सॉल्वैंट्स का उपयोग करने की प्रक्रिया के दौरान अधिक खो जाएगा तो फिर, जैसा स्पष्ट टेप के साथ लेबल को कवर किया।
- भ्रूण को ठीक करने के Mempfa का प्रयोग करें। एक समय में 50-100 मिलीग्राम के बैचों में 8% paraformaldehyde के एक शेयर करें। समाधान में paraformaldehyde के पाने के लिए की जरूरत है, जो 50-60 डिग्री सेल्सियस, करने के लिए आवश्यक एच 2 ओ और गर्मी का लगभग 75% का उपयोग करें।
नोट: यह समाधान यह formaldehyde के बजाय paraformaldehyde के इस्तेमाल करता है कि में Memfa पुराने प्रकाशित प्रोटोकॉल संस्करणों में उपयोग की तुलना में थोड़ा अलग है। - 10N NaOH के 2-3 बूँदें जोड़ें या पीएच तक 7.5 (पीएच जाँच करने के लिए उपयोग पीएच पेपर) लगभग है। Paraformaldehyde बहुत विषैला होता है, इसलिए एक धूआं हुड में शेयर समाधान उत्पन्न करते हैं। पैरा एक बारformaldehyde समाधान में, एक ताजा कंटेनर में वाटमान पेपर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर और अंतिम मात्रा करने के लिए ओ एच 2 जोड़ रहा है। यदि आवश्यक हो, 1-2 हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर paraformaldehyde समाधान की दुकान।
- Mempfa निर्धारण समाधान (तालिका 1) के शेष घटकों को इकट्ठा। Paraformaldehyde के अंतिम काम एकाग्रता 4% है कि सुनिश्चित करें। शेयरों के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर नियतन समाधान के सभी घटकों की दुकान।
- एक कट ग्लास विंदुक का प्रयोग, Mempfa समाधान (तालिका 1) के लगभग 3-4 मिलीलीटर के साथ भर दिया गया है कि लेबल वाली कांच की शीशियों को भ्रूण जोड़कर भ्रूण तय कर लो। शीशी प्रति अधिक से अधिक 20-30 भ्रूण फिक्सिंग से बचें। भ्रूण माध्यम से तरल हस्तांतरण की एक न्यूनतम के साथ भ्रूण जोड़ें। कमरे के तापमान पर दो घंटे या रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए Mempfa समाधान में भ्रूण को ठीक करें।
- देर अन्तर्जनस्तर संरचनाओं के लिए मैन्युअल रूप से अलग-थलग आंत और अन्तर्जनस्तर डेरिवेटिव 9,10 पर साइट में प्रदर्शनजांच की अच्छी पैठ के लिए अनुमति देता है और यह भी गुहा धुंधला से बचा जाता है।
- -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल के एक समाधान की दुकान। Paraformaldehyde के निर्धारण के बाद, लगभग 4 मिलीलीटर -20 डिग्री सेल्सियस, भ्रूण के भंडारण के लिए 100% मेथनॉल के साथ Mempfa समाधान की जगह।
- कांच या अन्य भ्रूण से चिपके से भ्रूण को रोकने के लिए मेथनॉल के अलावा के बाद शीशियों भंवर। इसके अलावा, ढीले अगर मेथनॉल समय के साथ फ्रीजर में लुप्त हो सकते हैं क्योंकि शीशियों कसकर सील कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
नोट: भ्रूण स्वस्थानी संकरण गुणवत्ता में की कोई हानि के साथ धुंधला करने के लिए पूर्व में मेथनॉल, संभावना अब कम से कम एक साल के लिए भंडारित किया जा सकता है।
- भ्रूण को ठीक करने के Mempfa का प्रयोग करें। एक समय में 50-100 मिलीग्राम के बैचों में 8% paraformaldehyde के एक शेयर करें। समाधान में paraformaldehyde के पाने के लिए की जरूरत है, जो 50-60 डिग्री सेल्सियस, करने के लिए आवश्यक एच 2 ओ और गर्मी का लगभग 75% का उपयोग करें।
2. जांच तैयारी
- Digoxigenin लेबल जांच करने के लिए टेम्पलेट डीएनए के 1-2 माइक्रोग्राम प्रति का उपयोग करें। एक प्रतिबंध के साथ ब्याज की जीन के 5 'अंत में उपयुक्त डीएनए अनुक्रम युक्त कट प्लाज्मिड था के लिए उपयुक्त एंजाइमटी वेक्टर antisense जांच उत्पन्न करने के लिए।
नोट: प्लाज्मिड एक उपयुक्त शाही सेना पोलीमरेज़ बाध्यकारी साइट (जैसे T7, T3 या SP6) होना चाहिए। - डीएनए, पानी, एनटीपी जांच संश्लेषण प्रतिक्रिया कोडांतरण से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए मिश्रण और पोलीमरेज़ बफर की अनुमति दें। तालिका 2 में सूचीबद्ध के रूप में एक आदेश में 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब आरएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया के घटक जोड़ें। पानी की मात्रा समायोजित 20 μl जांच संश्लेषण प्रतिक्रिया की कुल मात्रा को लाने के लिए कहा। पोलीमरेज़ बफर के घटकों को उच्च सांद्रता और ठंड में टेम्पलेट डीएनए जब तेज़ कर सकते हैं क्योंकि कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया इकट्ठा।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेते हैं।
नोट: अब थोड़ा की तुलना में दो घंटे की incubations कोई प्रतिकूल प्रभाव की ओर जाता है, लेकिन यह भी थोड़ा उपज में वृद्धि हुई दिखा। एक घंटे के लिए incubated हैं, तो उपज अभी भी एक अच्छा जांच करने के लिए पर्याप्त कम है, लेकिन किया जाएगा।- खत्म करने के लिए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया का इंतजार करते हुए, जांच की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि एक agarose जेल बनाते हैं। 1x TAE बफर के 100 मिलीलीटर में agarose की एक माइक्रोग्राम प्रति पिघल उबलते बिंदु का हल हीटिंग द्वारा (1 टेबल देखें)। Agarose पाउडर पूरी तरह से भंग कर दिया है जब गर्मी से समाधान निकालें।
- Agarose पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत शाही सेना के दृश्य की अनुमति के बारे में 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो गया जब agarose जेल के बारे में 100 मिलीलीटर के लिए 2 μl ethidium ब्रोमाइड शेयर समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें।
नोट: भविष्य जैल दोहराया पिघलने के बिना डाला जा सकता है इतना है कि यह agarose जेल समाधान के लिए एक 60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है। कारण संभावित विषाक्तता के लिए ethidium ब्रोमाइड से निपटने में ख्याल रखना।
- टेम्पलेट डीएनए को खत्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 10 मिनट के लिए 2 घंटे ऊष्मायन के बाद प्रतिलेखन प्रतिक्रिया करने के लिए एक μl DNAseI (RNase मुक्त ग्रेड) जोड़ें और सेते हैं।
- करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण की एक μl निकालेंते बफर (10 मिमी Tris पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA), 5M एनएच 4 एसीटेट के 10 μl, और 220 μl में 1% एसडीएस के 80 μl जोड़ने 1% agarose-tae जेल पर और बाकी (20 μl) के लिए जाँच की ठंड इथेनॉल। भंवर मिश्रण सख्ती और आरएनए गुणवत्ता की जांच के परिणामों में जाना जाता है, जब तक बर्फ पर अलग निर्धारित करें।
- 1% agarose-tae जेल पर तेज़ी से पहले हटा दिया शाही सेना के एक μl चलाएँ। जेल पर लोड हो रहा है को कम करने के लिए, पानी के 4-5 μl और शाही सेना के लिए मानक लोड हो रहा है डाई की एक μl जोड़ें। (चर्चा देखें) जांच की गुणवत्ता की जांच के क्रम में एक यूवी प्रकाश transilluminator का उपयोग कर जेल पर शाही सेना को देखें।
- 10 से 15 मिनट के लिए पूरी गति से एक microcentrifuge में कताई द्वारा 2.5 कदम में बर्फ पर अलग सेट किया गया था कि शेष शाही सेना वेग। एक बाहर खींचा कांच विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला बंद ड्रा और संक्षेप में सूखे के लिए अनुमति देते हैं।
- Eppendorf ट्यूब में शाही सेना संकरण बफर के 1 मिलीलीटर (तालिका 1) के साथ जांच Resuspend। भंवर और briefly फिर 37 डिग्री सेल्सियस और भंवर ट्यूब हीट। 15 मिलीलीटर टोपी polystyrene ट्यूब पेंच एक जांच समाधान स्थानांतरण और शाही सेना संकरण बफर के साथ 7-10 मिलीलीटर भरें। नोट: जांच (एक 10 गुना आगे कमजोर पड़ने अभी भी काम कर सकते हैं) अक्सर कम पृष्ठभूमि में जिसके परिणामस्वरूप लेकिन धुंधला प्रतिक्रियाओं को भी लंबे समय तक ले जाएगा और आगे से पतला किया जा सकता है।
बगल में संकरण में 3.
- -20 डिग्री सेल्सियस मेथनॉल में संग्रहीत किया गया है कि भ्रूण लो और कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं। कांच की शीशियों में पूरी प्रक्रिया को पूरा करें। एक समूह से अलग भ्रूण अलग जांच द्वारा देखा जा करने के लिए जा रहे हैं, जांच पहले दिन परिवर्तनशीलता और श्रम को कम करने के लिए जोड़ रहे हैं, बस से पहले तक एक भी शीशी में उन्हें रखने के लिए।
- जांच के अलावा के लिए तैयार करने में 3 टेबल (धोने के व्यंजनों के लिए 1 टेबल देखें) में उल्लिखित के रूप में एक मेथनॉल श्रृंखला के माध्यम से भ्रूण rehydrate। धीरे Embry ज़ुल्फ़प्रत्येक परिवर्तन के बाद ओएस वे पक्षों या एक दूसरे से चिपके नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करने, और एक nutator पर शीशियों बढ़ते द्वारा भ्रूण रॉक करने के लिए। तरल पदार्थ के हस्तांतरण करते हैं, भ्रूण वहाँ फँस नहीं किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए टोपी के अंदर की जाँच करें।
- तालिका 3 में वर्णित के रूप में जांच के समाधान में एक बार, रातोंरात भ्रूण संकरण।
- जांच के समाधान निकालें। एक 15 मिलीलीटर में भंडारण के द्वारा प्रयोग किया जाता जांच सहेजें -20 डिग्री सेल्सियस पर तारीख और जांच इस्तेमाल किया गया है समय की संख्या के साथ चिह्नित टोपी polystyrene ट्यूब, पेंच।
नोट: वर्णमिति प्रतिक्रियाओं वांछित तीव्रता तक पहुँचने के लिए एक असामान्य रूप से लंबे समय तक लेने के लिए शुरू में जब तक एक ही जांच सीटू hybridizations में बाद के लिए कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।- जांच के निकाले जाने के बाद, तालिका 4 में उल्लिखित washes की श्रृंखला के माध्यम से जांच के खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला के लिए भ्रूण तैयार करते हैं। तापमान परिवर्तन टी ले जाकर (तालिका 4) के रूप में आवश्यकसीधे उपयुक्त तापमान के लिए सेट कर रहे हैं कि संकरण ओवन में संलग्न भ्रूण की शीशियों के साथ वह nutator,।
- एमएबी की उचित मात्रा को बनाओ + HTSS + बीआर + भ्रूण एंटीबॉडी को जोड़ने के लिए पूर्व ब्लॉक किया गया है कि ताकि + HTSS + बीआर अवरुद्ध समाधान एमएबी में incubated किया जा रहा है कि समय पर विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी (तालिका 4) भ्रूण। उपयोग की दिन पर अवरुद्ध समाधान ताजा बनाओ।
- एंटीबॉडी समाधान निकालें और एंटीबॉडी के साथ रात भर ऊष्मायन निम्न तालिका 5 में उल्लिखित के रूप में washes के शुरू करते हैं। Alkaline फॉस्फेट सब्सट्रेट के साथ धुंधला के लिए तैयार है और जितना संभव हो उतना पृष्ठभूमि को कम करने के क्रम में कम से कम बारह 30 मिनट washes के प्रदर्शन करना। वाशिंग चरणों के लिए एमएबी बफर या टीबीटी समाधान (तालिका 1) या तो उपयोग करें।
नोट: टीबीटी समाधान 2 मिलीग्राम है कि TTW है / बीएसए की मिलीलीटर गयी।- बी.एम. बैंगनी alkaline फॉस्फेट सब्सट्रेट के साथ पिछले धोने के समाधान बदलें। धुंधला reac सम्पन्नकमरे के तापमान या 37 डिग्री सेल्सियस पर या तो tion।
नोट: धुंधला 37 डिग्री सेल्सियस पर और अधिक तेजी से है, लेकिन रात भर के लिए छोड़ दिया है, तो अस्वीकार्य पृष्ठभूमि धुंधला अक्सर एक परिणाम हो सकता है। धुंधला प्रतिक्रियाओं अक्सर रात भर धुंधला की आवश्यकता होगी और कमरे के तापमान इस बात के लिए सबसे सुरक्षित है। - आगे धुंधला आवश्यक है और बीएम बैंगनी समाधान के लिए एक नीले रंग पर ले जा रहा है, ताजा बी.एम. बैंगनी रंग के साथ धुंधला समाधान की जगह है और 37 डिग्री सेल्सियस में ट्यूब डाल दिया। लक्ष्य mRNA बहुत प्रचुर मात्रा में है, तो रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला समाधान में भ्रूण डाल दिया और फिर कमरे के तापमान को भ्रूण के लिए कदम या 37 डिग्री सेल्सियस धुंधला प्रतिक्रिया की बेहतर निगरानी की अनुमति है।
- अंतिम परिणाम के लिए समय अलग लक्ष्य RNAs के बीच काफी भिन्न होता है, के रूप में ध्यान से नई प्रतिक्रियाओं पर नज़र रखें। स्थिरता के लिए, अब ऊष्मायन के साथ उत्पन्न होने वाली अभिव्यक्ति का कोई नया साइटों रहे हैं जब (3.4 देखें) धुंधला प्रतिक्रिया बंद करो। महत्वपूर्ण बात है, सीटू संकरण में अगर एक परख के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा हैअलग उपचार समूहों को देख के प्रयोगों के लिए, उपचार और नियंत्रण भ्रूण के बीच रंग प्रतिक्रियाओं के लिए एक ही समय का उपयोग करें।
- बी.एम. बैंगनी alkaline फॉस्फेट सब्सट्रेट के साथ पिछले धोने के समाधान बदलें। धुंधला reac सम्पन्नकमरे के तापमान या 37 डिग्री सेल्सियस पर या तो tion।
- धुंधला प्रतिक्रिया बंद करो और 6 तालिका में उल्लिखित के रूप में तरल पदार्थ बदलकर भंडारण और छवि रिकॉर्डिंग के लिए भ्रूण तैयार करते हैं। दाग को हटाने के भ्रूण के चारों ओर मेथनॉल के बैंगनी रंग के रूप में देखे जा सकते हैं, क्योंकि इस स्तर पर भ्रूण रॉक मत करो।
नोट: इस भारी पृष्ठभूमि या गुहा धुंधला दूर करने के लिए पर्याप्त नहीं है, हालांकि अक्सर भ्रूण, धुंधला समाधान और कम से कम आंशिक रूप से है कि दूर कर सकते हैं ठंड मेथनॉल से एक हल्के नीले रंग धुंधला है। शीत मेथनॉल एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जाता है कि मेथनॉल को दर्शाता है।- भ्रूण rehydrate और Mempfa (तालिका 6) के साथ दाग तय कर लो। तय करने के बाद, Mempfa को हटाने और 25% मेथनॉल के साथ भ्रूण धो लें।
- 25% मेथनॉल निकालें और अगर विरंजन समाधान जोड़ने अंतर्जात वर्णक को हटाने केआवश्यक है। यह जलता पैदा कर सकता है के रूप में विरंजन समाधान से निपटने में ख्याल रखना। यह अपेक्षाकृत जल्दी होता है और विरंजन की डिग्री अलग अलग प्रभाव (चित्रा 2) के लिए अलग किया जा सकता है के रूप में निकटता विरंजन का निरीक्षण करें।
- विरंजन निम्नलिखित लंबी अवधि के भंडारण के लिए 100% मेथनॉल के लिए एक मेथनॉल श्रृंखला के माध्यम से भ्रूण निर्जलीकरण, या लघु अवधि के भंडारण और बाद में इमेजिंग के लिए पीबीएस के लिए स्थानांतरण (6 तालिका देखें)।
4. इमेजिंग भ्रूण
- एक भ्रूण धुंधला प्रक्रिया पूरा कर लिया है एक बार, छवि भ्रूण ब्याज की जीन व्यक्त की है, जहां के बारे में जानकारी के लिए एक व्यापक दर्शकों के लिए कब्जा कर लिया है कि इतनी। मिलावटी भ्रूण को देखने के लिए एक पृष्ठभूमि के रूप में agarose 1% का उपयोग करें।
नोट: agarose भ्रूण और धुंधला प्रतिक्रिया के नीले रंग के साथ अच्छी तरह से विरोधाभासों कि एक नीला / ग्रे पृष्ठभूमि देता है। यह भी ध्यान भंग छाया और भ्रूण से ध्यान हटाने कि प्रतिबिंब फैलाना मदद करता है।- पानी के लिए agarose जोड़ें और agarose समाधान में है तब तक एक उबाल लाने और उसके बाद पेट्री डिश में गिरने से पहले 50 को शांत करते हैं। TAE जेल समाधान के साथ के रूप में, कई उपयोगों के लिए 55 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में agarose समाधान की दुकान। पेट्री डिश में लगभग 2 मिमी की गहराई तक agarose डालो। यदि आवश्यक हो, पृष्ठभूमि की एक से थोड़ा अलग तरह से छाया उपज के लिए agarose की गहराई को समायोजित।
- एक जलीय घोल (पीबीएस या TTW) मेथनॉल में भंडारण से पुनर्जलीकरण के बाद, एक मेथनॉल श्रृंखला का उपयोग कर, (6 तालिका देखें) agarose के आधार के साथ एक पेट्री डिश में भ्रूण जगह है। स्वच्छ समाधान रखें और यदि आवश्यक हो, अच्छा छवियों की साफ पृष्ठभूमि बाधित कर सकते हैं कि छोटे कण बात को खत्म करने के लिए सरल छानने का उपयोग करें।
- छवि के लिए इस तरह के उदर पक्ष से के रूप में वैकल्पिक विचारों से भ्रूण, चित्रा 3 ठीक संदंश का उपयोग भ्रूण फिट और (उन्मुखीकरण के लिए उन चैनलों में भ्रूण स्थान के लिए agarose में पतली चैनलों में कटौती नोट: अधिकांश चरणों समाधान में रखा जब वे मानते हैं कि एक विशेषता स्थिति है। उदाहरण के लिए, ब्लासटुला चरण भ्रूण पशु पक्ष को बैठने के लिए जाते हैं। भ्रूण बढ़ाना शुरू करने के लिए एक बार, वे अपने पक्ष में करना।
- छवि को गहराई प्रदान कि भ्रूण पर छाया बनाने, एक उथले कोण से भ्रूण रोशन और सतह संरचनाओं विचार करने में मदद करने के लिए फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत का उपयोग करें। विरंजन उपयोगी स्थलों प्रदान करता है कि रंग, खत्म कर सकते हैं क्योंकि दृढ़ता से प्रक्षालित भ्रूण के लिए ग्रहण का उपयोग करें।
- ऐसे मस्तिष्क, (चित्रा 4) के पृष्ठदंड, फेफड़े, या क्षेत्रों में के रूप में, गहरी भ्रूण के भीतर है कि छवि को धुंधला भ्रूण को साफ़ करें। इसे पूरा करने के लिए 100% मेथनॉल में जब तक एक मेथनॉल श्रृंखला के माध्यम से भ्रूण डाल दिया।
- मेथनॉल में पूर्ण विसर्जन के बाद, एक समाधान के एक भाग के बेंजाइल अल्कोहल भ्रूण हस्तांतरण और दो भागों लोबान होnzoate (Babb)। भ्रूण शुरू में सतह पर तैरने लगते हैं जाएगा, लेकिन मेथनॉल Babb के साथ घोला जा सकता है, के रूप में वे Babb में डूब जाएगी। कांच की शीशियों या बर्तन में Babb के साथ काम कर हर कदम प्रदर्शन; Babb किसी भी प्लास्टिक या रंग पिघल जाएगा।
- एक बार को मंजूरी दे दी भ्रूण नीचे से आ रही प्रेषित प्रकाश के साथ भ्रूण को देखने। इसके विपरीत में सुधार लाने और सबसे अच्छा रंग प्रदान करने के लिए नीचे से प्रकाश की तीव्रता के साथ ही कोण समायोजित करें।
- देखने को मंजूरी दे दी भ्रूण बेस के बंद कांच पेट्री डिश बढ़ा। बस भ्रूण के साथ डिश के क्षेत्र बुलंद इतना है कि यह जुटाने के लिए दो अन्य पेट्री डिश पलकों का उपयोग करके यह मत करो।
नोट: यह ध्यान से बाहर बेस ले रही है और छवि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि माइक्रोस्कोप आधार पर खामियों या दाग से ध्यान भंग प्रभाव को नष्ट करने का लाभ दिया है।
5. डबल में बगल में संकरण
- एक साथ TW की अभिव्यक्ति पैटर्न देखने के लिए आदेश मेंएक भी भ्रूण में विभिन्न जीनों ओ, दो जांच, विभिन्न जीनों में से प्रत्येक के लिए एक synthesize। ऊपर वर्णित के रूप में एक लेबल के रूप में डीआईजी-11-UTP का उपयोग करते हुए एक जांच synthesize। सीटू hybridizations में एकल के लिए इस्तेमाल की तुलना में एक 3x अधिक ध्यान केंद्रित जांच उपज के लिए शाही सेना संकरण बफर में प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के उत्पाद पतला।
- डीआईजी डीआईजी-11-UTP के लिए प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए कि fluorescein-12-UTP के सिवाय जांच लेबल के लिए के रूप में ही प्रोटोकॉल का उपयोग हित के अन्य जांच synthesize। सीटू hybridizations में एकल के लिए इस्तेमाल की तुलना में एक 3x अधिक ध्यान केंद्रित जांच उपज के लिए शाही सेना संकरण बफर में प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के उत्पाद पतला।
- : 1 के अनुपात में एक एक में दो केंद्रित जांच मिलाएं। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सीटू संकरण प्रोटोकॉल में एकल में सबसे मजबूत अभिव्यक्ति से पता चलता है कि जीन के लिए fluorescein-लेबल जांच का उपयोग करें।
- सीटू संकरण प्रोटोकॉल में उसी का प्रयोग <बगल में एकल के लिए वर्णित/ उन्हें> hybridizations, डबल जांच का उपयोग को छोड़कर सीटू संकरण जांच में एक भी के स्थान पर पहले दिन के अंत में (लेबल-digoxigenin और fluorescein लेबल जांच के 1.5x केंद्रित मिश्रण युक्त जांच)।
- विरोधी डीआईजी एपी फैब टुकड़े के स्थान पर 4,000 कमजोर पड़ने: एक एक पर उपयोग विरोधी fluorescein-एपी फैब टुकड़े को छोड़कर, सीटू संकरण प्रोटोकॉल में डबल के दूसरे दिन ही संकरण प्रोटोकॉल का पालन करें। सीटू प्रोटोकॉल में एकल के रूप में भ्रूण से अतिरिक्त एंटीबॉडी बाहर धोने और बीएम-बैंगनी एपी सब्सट्रेट का उपयोग पहली रंग प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले।
- पहली रंग की प्रतिक्रिया के बाद, 0.1 एम ग्लाइसिन पीएच में एमएबी में पांच से दस मिनट washes के द्वारा पीछा 2.0 40 के लिए न्यूनतम flourescein एंटीबॉडी निष्क्रिय। 90 मिनट के लिए एमएबी + HTSS + बीआर में भ्रूण ब्लॉक। एक एक पर विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी जोड़ें: एमएबी + HTSS + बीआर में 2,000 कमजोर पड़ने और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- अगले दिन, वें भ्रूण धोनेoroughly एमएबी (30 मिनट के 12 washes के) में अतिरिक्त एंटीबॉडी हटाने के लिए।
- एपी बफर में 10 मिनट (तालिका 1) के लिए भ्रूण धो लें और फिर BCIP (एपी बफर में 0.5mg / एमएल) के साथ दाग।
नोट: सीटू संयोजन में पहली रंग प्रतिक्रिया और दूसरा (चित्रा 5) के लिए एक हल्के नीले रंग की प्रतिक्रिया के लिए एक गहरे नीले-बैंगनी दाग देना चाहिए। - एपी बफर हटाने के द्वारा अंतिम रंग प्रतिक्रिया बंद करो और एमएबी के साथ तीन बार कुल्ला। 10 मिनट के लिए Mempfa के साथ भ्रूण को ठीक करें। एमएबी या टीबीटी में 5 त्वरित washes के साथ भ्रूण धो लें।
- यह BCIP अकेले रंग को समाप्त होगा के रूप में इस रंग संयोजन के साथ, पोस्ट धुंधला उपचार में मेथनॉल के उपयोग, संभव नहीं रह गया है। 0.02% सोडियम azide साथ पीबीएस में धुंधला हो जाना और निर्धारण के बाद भ्रूण की दुकान। तीव्रता धुंधला साइट में डबल के साथ कमजोर हो सकता है। यह एक समस्या है, तो, चार को 2 घंटे की अवधि का प्रत्येक washes के कम।
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Representative Results
ऊतक विशिष्ट जांच के उपयोग के विशिष्ट अंगों के लिए विकास की स्थिति के संबंध में बकाया जानकारी प्रदान कर सकते हैं। निम्न उदाहरण में, भ्रूण के मंच Nieuwkoop और फैबर मचान तालिका में 11 पर आधारित है। एक जांच फार्म भेदभाव के बाद व्यक्त जीन, चरण 28-30 में मैं कार्डियक ट्रोपोनिन, उदाहरण के लिए (चित्रा 1C), एक विभेदित अंग की उपस्थिति या आकार का उपयोग करता है, तो किसी भी स्तर पद भेदभाव पर मूल्यांकन किया जा सकता है। सालों पहले, embryologists जल्दी भ्रूण 12,13 के ऊतक विज्ञान की उल्लेखनीय ज्ञान के आधार पर इस तरह के विश्लेषण करने में सक्षम थे, लेकिन विशेषज्ञता है कि मोटे तौर पर embryologists की वर्तमान पीढ़ी के लिए खो गया है। हालांकि, इस विशेषज्ञता के नुकसान के किसी भी शोधकर्ता के लिए उपलब्ध विशिष्ट ऊतकों की पहचान बनाता सीटू संकरण तकनीक में विश्वसनीयता और उपयोग में आसानी, अफसोस की बात पर विचार किया जा सकता है। अपेक्षाकृत अस्पष्ट हैं कि ऊतकों, टीभ्रूण चरण 25 (उदाहरण के लिए चित्रा 1 ए) में ग्रंथि सेने वह ताजा विशिष्ट एंटीबॉडी या ऊतकीय तकनीक (चित्रा 1C) के लिए आवश्यकता के बिना साइट में उपयोग कर के रूप में चिह्नित किया जा सकता है। इसके अलावा, साइट में पूरे माउंट के उपयोग के एक नहीं बल्कि ऊतकीय वर्गों (चित्रा 2) से अनुमान पर भरोसा से पूरे भ्रूण के संदर्भ में पूरे अंग देखने के लिए अनुमति देता है। ऑप्टिक डंठल (चित्रा 4) सहित भ्रूण के भीतर गहरे हैं कि यहां तक कि ऊतकों को आसानी से देखा जा सकता है और भ्रूण समाशोधन के उपयोग के अंग सीमाओं के तेज चित्रण प्रदान कर सकते हैं।
भ्रूण की ब्लीचिंग काफी हद तक वर्णक की कमी है कि सूरजमुखी मनुष्य भ्रूण प्रयोग करने के लिए आवश्यकता समाप्त कर दिया है पेरोक्साइड समाधान का उपयोग कर अंतर्जात वर्णक हटाने के लिए। अलग-अलग समय के लिए विरंजन उपयोगी हो सकता है। दाग मजबूत है अगर देखा जा करने के लिए कुछ रंजकता उपयोगी हो सकता है के लिए उदाहरण के लिए, एक लाइटर विरंजन की अनुमति देता है कि यह सब इसलिए क्योंकिबेहतर मचान और भ्रूण (2A चित्रा) के उन्मुखीकरण के लिए OWS। दाग विरंजन समाधान में अब ऊष्मायन द्वारा वर्णक के पूर्ण उन्मूलन के पास इस तरह के गुर्दे (चित्रा 2 बी) के रूप में रंजकता के उच्च स्तर पर, कर रहे हैं, जहां एक क्षेत्र है हालांकि, अगर एक बेहतर परिणाम देता है।
भ्रूण जब समाधान में विशेष पदों पर ले जाते हैं। Neurulation के बाद, वे अपने पक्ष पर फ्लैट करना के लिए करते हैं। इस दिशा (चित्रा 2B) की छवियों के लिए ठीक है, लेकिन अन्य क्षेत्रों के साथ एक समस्या हो सकती है। एक agarose आधार का उपयोग एक भ्रूण उन्मुख करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि agarose में चैनल में कटौती करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, रक्त व्यापारियों भ्रूण (2A चित्रा) और धुंधला की पूर्ण सीमा तक के उदर पक्ष को निरीक्षण करने के लिए कड़ी मेहनत कर रहा है स्थानीयकृत हैं। उदर पक्ष के साथ एक चैनल में भ्रूण की स्थिति तो यह है कि जीन अभिव्यक्ति पैटर्न (चित्रा 3 ए) का पूरा देखने के लिए अनुमति देता है। स्वस्थानी संकरण में डबल का उपयोग आकृति विज्ञान में छोटे मतभेदों हो सकता है कि अलग भ्रूण के बीच तुलना करने की आवश्यकता को नष्ट करने के लिए एक एकल जीव (चित्रा 5) के भीतर दो जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के बीच संबंधों को दिखा सकते हैं। शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, सीटू संकरण में के उपयोग के एक स्पष्ट रूप में कई ऊतकों में व्यक्त किया है कि इस तरह के pax2 के रूप में एक वंश के प्रारंभिक पूर्वज, में व्यक्त कर रहे हैं कि जीनों की अभिव्यक्ति के आधार पर ऊतकीय भेदभाव खाली करने के लिए पूर्व की कोशिकाओं को चिह्नित करने की क्षमता देता है जल्दी भ्रूण, पूर्व भेदभाव करने के लिए (चित्रा -4 ए)। ऐसे माइलॉयड सेल व्यापारियों (चित्रा 1 बी) के रूप में स्पष्ट रूप से ऊतक विज्ञान के आधार पर प्रतिष्ठित नहीं कर रहे हैं कि progenitors और ऊतकों की पहचान करने की क्षमता, एक अंग के विकास की स्थिति के बारे में और अधिक विस्तृत सवाल पूछने के लिए शोधकर्ताओं ने अनुमति दे दी है और यह भी प्रयोगात्मक के परिणामों का आकलन करने के लिए एमanipulation एक ऊतक के अस्थानिक भेदभाव पैदा करने के लिए बनाया गया है।
चित्रा 1:। Xenopus भ्रूण पर सीटू संकरण में पूरे माउंट के उदाहरण सीटू संकरण प्रयोग में एक से नीले रंग धुंधला स्पष्ट रूप से जल्दी Xenopus भ्रूण की संरचनाओं के विकास को चित्रित कर सकते हैं (ए) के एक चरण 26 भ्रूण के एक पूर्वकाल देखें सेने ग्रंथि पर प्रकाश डाला। uvs.2 14 की अभिव्यक्ति के द्वारा सीमांकन के रूप में (बी) के चरण 28 पर एक मार्कर के रूप में (सी) जल्दी दिल myeloperoxidase 15 की अभिव्यक्ति का उपयोग चरण 20 पर जल्दी माइलॉयड कोशिकाओं के स्थान दिखा एक भ्रूण की एक उदर देखें।। - 30 कार्डियक ट्रोपोनिन मैं 16 की अभिव्यक्ति के द्वारा कल्पना की है। इस विधि का उपयोग करने का एक स्पष्ट लाभ की है कि सभी हैइन जीन अभिव्यक्ति पैटर्न अलग जांच का उपयोग कल्पना, लेकिन इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल सभी मामलों में समान थे। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: विरंजन के विभिन्न स्तरों के भ्रूण में धुंधला कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (क) इस भ्रूण के नीचे के साथ इस नीले धुंधला इस का एक क्षेत्र है चरण 36. बारे में उदर रक्त द्वीप समूह में हीमोग्लोबिन की अभिव्यक्ति से पता चलता है। केवल हल्के से pigmented है और इस प्रकार भ्रूण आंखों में तन रंग वर्णक द्वारा और भ्रूण के पार्श्व के साथ देखा जा सकता है के रूप में एक लंबे समय के लिए प्रक्षालित नहीं किया गया है कि भ्रूण। रंजकता को देखने के लिए सक्षम होने के नाते भ्रूण के मंच के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता है। धुंधला ऐसे तंत्रिका तंत्र और भ्रूण की दिशा के रूप में अधिक से अधिक प्राकृतिक रंजकता के साथ एक क्षेत्र में है, तो अधिक से अधिक विरंजन बी (बी) के रूप में देखा गठन गुर्दे में यहाँ बगल में pax8 17 की अभिव्यक्ति देखने में मदद मिलेगी , pronephric वाहिनी और पश्चमस्तिष्क सबसे अच्छा विरंजन लगभग सभी अंतर्जात वर्णक हटा दिया गया है के बाद कल्पना की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: agarose के आधार के हेरफेर भ्रूण के उन्मुखीकरण के साथ मदद कर सकते हैं वे डिश में विशेष पदों पर ले जाते हैं, क्योंकि भ्रूण की इमेजिंग विशिष्ट क्षेत्रों के लिए मुश्किल हो सकता है (ए) टैडपोल में अपने पक्ष पर झूठ होगा भ्रूण चरणों।। । कटौती सेting के agarose में एक ठीक चैनल (काला तीर) भ्रूण एक अच्छी छवि पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त स्थिरता के साथ, यहाँ चरण 36 में हीमोग्लोबिन अभिव्यक्ति दिखा, उदर पक्ष से देखा जा सकता है। (बी) के स्तर पर hand1 अभिव्यक्ति की इस उदर देखें 20 पार्श्व प्लेट मेसोडर्म 6 रूपरेखा। भ्रूण उदर पक्ष के साथ अपनी स्थिति स्थिर है कि एक छोटे से छेद में रखा गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। आंतरिक अंगों अपारदर्शी, मिलावटी और में मंजूरी दे दी भ्रूण दोनों में देखा जा सकता है pax2 के लिए दाग एक मिलावटी भ्रूण में मंच 34 (ए), ऑप्टिक डंठल (पीले तीर) पर अपेक्षाकृत आसानी से देखे जा सकते हैंन्यूरल ट्यूब नीचे धुंधला कर सकते हैं। बहरहाल, विवरण तेज नहीं कर रहे हैं। ऑप्टिक डंठल (पीले तीर) सहित भ्रूण (बी) अभिव्यक्ति साइटों की सीमाओं, समाशोधन द्वारा तेज कर रहे हैं। समाशोधन की हद तक इस मंजूरी दे दी भ्रूण में दोनों आंखों से देखने की क्षमता से दिखाया गया है। इसके अलावा कुछ धुंधला आंतरिक cavities (बैंगनी तीर) को मंजूरी दे दी भ्रूण को देखने जब एक आम समस्या में जमा हो गया है कि ध्यान दें।
चित्रा 5:। एक Xenopus भ्रूण पर सीटू संकरण में एक प्रतिनिधि डबल पार्श्व प्लेट मार्कर की अभिव्यक्ति, hand1, विकासशील vasculature के भीतर etv2 की 26. अभिव्यक्ति गहरे नीले रंग बैंगनी दाग द्वारा कल्पना है चरण में हल्के नीले रंग धुंधला द्वारा कल्पना की है। Hand1 की अभिव्यक्ति आमतौर पर बहुत तीव्र है और इस तरह यह टी के लिए उपयोग किया गया थाfluorescein लेबल जांच और BCIP संयोजन वह कमजोर। कमजोर etv2 अभिव्यक्ति के लिए digoxigenin लेबल जांच और बीएम-बैंगनी संयोजन का उपयोग किया।
| नाम | अंतिम एकाग्रता | राशि / 100 मिलीलीटर |
| Mempfa | 1 मिमी MgSO 4 | 1 एम MgSO 4 के 100 μl |
| (4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर) | 2 मिमी EGTA, पीएच 8.0 | 20 मिमी EGTA, पीएच 8.0 से 10 मिलीलीटर |
| 0.1 एम mops, पीएच 7.5 | 1 एम mops, पीएच 7.5 से 10 मिलीलीटर | |
| 4% Paraformaldehyde, पीएच 7.5 | 8% Paraformaldehyde, पीएच 7.5 से 50 मिलीलीटर | |
| TTW | 50 मिमी Tris, पीएच 7.4 | 1 एम Tris, पीएच 7.4 से 5 मिलीलीटर |
| 200 मिमी NaCl | 5 एम NaCl के 4 मिलीलीटर | |
| 0.1% बीच 20 | बीच 20 से 100 μl | |
| 100X Denhardt का समाधान | 2% बीएसए | 2 जी बीएसए |
| (0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर, | 2% पीवीपी-40 | 2 जी पीवीपी-40 |
| -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर) | 2% Ficoll 400 | 2 जी Ficoll 400 |
| 20X एसएससी | 3 एम NaCl | 17.5 छ NaCl |
| 300 मिमी Trisodium साइट्रेट | 8.8 जी Trisodium साइट्रेट | |
| शाही सेना संकरण बफर | 50% formamide | 100% formamide की 50 मिलीलीटर |
| (4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर) | 5x एसएससी | 20x एसएससी की 25 मिलीलीटर |
| 1 मिलीग्राम / एमएल खमीर शाही सेना | 50% formamide में भंग 1mg / एमएल खमीर शाही सेना के 4 मिलीलीटर | |
| 1X Denhardt का समाधान | 100x Denhardt के समाधान के 1 मिलीलीटर | |
| 0.1% बीच 20 | बीच 20 से 100 μl | |
| 5 मिमी EDTA, पीएच 8.0 | 0.5 एम EDTA, पीएच 8.0 से 1 मिलीलीटर | |
| एमएबी | 100 मिमी Maleic एसिड | Maleic एसिड की 1.16 छ |
| (4 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 7.5, स्टोर) | 150 मिमी NaCl | NaCl के 0.88 छ |
| एमएबी + HTSS + बीआर | 100 मिमी Maleic एसिड | एमएबी की 96 मिलीलीटर |
| 4% हीट इलाज भेड़ सीरम | हीट इलाज भेड़ सीरम के 4 मिलीलीटर (गर्मी 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इलाज और aliquoted) | |
| 2% अवरुद्ध अभिकर्मक | रॉश को अवरूध्द अभिकर्मक के 2 जी | |
| एमएबी + HTSS + बीआर + विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी | 100 मिमी Maleic एसिड | एमएबी की 96 मिलीलीटर |
| 4% गर्मी treated भेड़ सीरम | हीट इलाज भेड़ सीरम के 4 मिलीलीटर | |
| 2% अवरुद्ध अभिकर्मक | रॉश को अवरूध्द अभिकर्मक के 2 जी | |
| 1: 10,000 विरोधी डीआईजी एपी, फैब टुकड़े एंटीबॉडी | एंटी Digoxygenin-एपी, फैब टुकड़े एंटीबॉडी के 1.5 μl | |
| Alkaline फॉस्फेट (एपी) बफर | 100 मिमी Tris, पीएच 9.5 | 1 एम Tris, पीएच 9.5 से 10 मिलीलीटर |
| 50 मिमी 2 MgCl | 1 एम 2 MgCl के 5 मिलीलीटर | |
| 100 मिमी NaCl | 4 एम NaCl के 2.5 मिलीलीटर | |
| 0.1% बीच 20 | बीच 20 से 100 μl | |
| विरंजन समाधान | 0.3% एच 2 ओ 2 | 30% एच के 3.34 मिलीलीटर 2 2 हे |
| 5% Formamide | 100% Formamide के 5 मिलीलीटर | |
| 0.5% एसएससी | 20x एसएससी के 2.5 मिलीलीटर | |
| क्लियरिंग समाधान | 03/01 बेंजाइल अल्कोहल | 33 मिलीलीटर |
| 03/02 लोबान Benzoate | 67 मिलीलीटर |
तालिका 1: समाधान व्यंजनों
| नाम | राशि |
| डीआईजी एनटीपी मिक्स | 20 मिमी CTP की 5 μl |
| (40 μl प्रतिक्रिया) | 20 मिमी जीटीपी के 5 μl |
| 20 मिमी एटीपी के 5 μl | |
| 20mm UTP के 3.25 μl | |
| 10mM खोदो-11-UTP के 3.5 μl | |
| 18.25 μl आसुत, autoclaved पानी | |
| जांच संश्लेषण | टेम्पलेट डीएनए के एक्स μl(एकाग्रता पर निर्भर) |
| (20 μl प्रतिक्रिया) | आसुत, autoclaved पानी की एक्स μl |
| डीआईजी एनटीपी मिश्रण के 4 μl | |
| RNase अवरोध करनेवाला के 0.5 μl | |
| 10X शाही सेना पोलीमरेज़ बफर के 2 μl | |
| शाही सेना पोलीमरेज़ के 2 μl |
तालिका 2: जांच संश्लेषण व्यंजनों
| अभिकर्मक के नाम | लगभग वॉल्यूम | अवधि | तापमान |
| 100% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 75% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 50% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 25% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| TTW | 2 मिलीलीटर | 10 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| TTW | 2 मिलीलीटर | 10 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| TTW | 2 मिलीलीटर | 10 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| शाही सेना संकरण बफर और जांच पूर्व गर्म करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस | |||
| TTW | 4 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| TTW | 4 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| शाही सेना संकरण बफर | 2 मिलीलीटर | 10 मिनट, कमाल | कक्ष Temperaturई |
| शाही सेना संकरण बफर पूर्व गर्म | 2 मिलीलीटर | 1 घंटा, कमाल | 65 डिग्री सेल्सियस |
| जांच समाधान | 1 मिलीलीटर | रातों रात, कमाल | 65 डिग्री सेल्सियस |
तालिका 3: पहले दिन के बगल में संकरण प्रोटोकॉल (लगभग 3 घंटा कुल) के लिए कदम
| अभिकर्मक के नाम | लगभग वॉल्यूम | अवधि | तापमान | ||||
| पूर्व गर्म शाही सेना संकरण बफर और 37 डिग्री से 65 डिग्री सेल्सियस और 2x एसएससी को 02.x एसएससी सी | |||||||
| दोहराने उपयोग के लिए ट्यूब के लिए जांच के समाधान लौटें | |||||||
| शाही सेना संकरण बफर | 2 मिलीलीटर | 10 मिनट, कमाल | 65 डिग्री सेल्सियस | 2X एसएससी | 2 मिलीलीटर | 20 मिनट, कमाल | 37 डिग्री सेल्सियस |
| 2X एसएससी | 2 मिलीलीटर | 20 मिनट, कमाल | 37 डिग्री सेल्सियस | ||||
| 0.2x एसएससी | 4 मिलीलीटर | 1 घंटा, कमाल | 65 डिग्री सेल्सियस | ||||
| 0.2x एसएससी | 4 मिलीलीटर | 1 घंटा, कमाल | 65 डिग्री सेल्सियस | ||||
| एमएबी + HTSS + बीआर | 1.5 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान | ||||
| एमएबी + HTSS + बीआर + विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी | 1.5 मिलीलीटर | रातों रात, कमाल | 4 डिग्री सेल्सियस |
टेबल 4: दूसरे दिन के बगल में संकरण प्रोटोकॉल (लगभग 4 घंटे कुल) के लिए कदम
| अभिकर्मक के नाम | लगभग वॉल्यूम | अवधि | तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| एमएबी | 4 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| बी.एम. बैंगनी एपी सब्सट्रेट | 500-750 μl | रातों रात, कमाल (पाठ देखें) | कमरे के तापमान / 37 डिग्री सेल्सियस (पाठ देखें) |
तालिका 5: तीसरे दिन का खेल बगल में संकरण प्रोटोकॉल (7 के बारे में मानव संसाधन) के लिए कदम
| अभिकर्मक के नाम | लगभग वॉल्यूम | अवधि | तापमान |
| 25% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान | |
| 50% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 75% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 100% मेथनॉल (ठंड) | 2 मिलीलीटर | 20 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 100% मेथनॉल (ठंड) | 2 मिलीलीटर | बदलता रहता है, कोई कमाल | कमरे के तापमान |
| 75% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 50% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 25% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| Mempfa | 2 मिलीलीटर | 30 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 25% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 25% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 25% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| विरंजन समाधान | 4 मिलीलीटर | 40 मिनट-3 घंटा, कमाल | कमरे के तापमान / 37 डिग्री सेल्सियस (पाठ देखें) |
| भ्रूण भंडारण | |||
| 25% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 50% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 75% मेथनॉल | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 100% मेथनॉल | 4 मिलीलीटर | स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर | |
| 1x पीबीएस | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 1x पीबीएस | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
| 1x पीबीएस | 2 मिलीलीटर | 5 मिनट, कमाल | कमरे के तापमान |
टेबल 6: भ्रूण के स्वस्थानी संकरण, ब्लीचिंग और भंडारण में रोकने के लिए उठाए जाने वाले कदम
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Discussion
विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न कल्पना करने के लिए सीटू संकरण में उपयोग करने की क्षमता Xenopus भ्रूण में विशिष्ट अंगों या सेल प्रकार की पहचान करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि बनी हुई है। इस वजह से इस तकनीक के द्वारा की पेशकश के कई फायदे की है। एक जीन की अभिव्यक्ति के इस तरह के उन कोशिकाओं 18 में से किसी स्पष्ट सीमांकन करने से पहले दिल progenitors में nkx2.5 अभिव्यक्ति के लिए मामले के रूप में अच्छी तरह से भेदभाव के किसी भी ऊतकीय साइन करने से पहले विशिष्ट संरचनाओं की पहचान कर सकते हैं। अभिकर्मकों के सभी हाथ में एक बार, यह भी बहुत लागत प्रभावी है। प्रभावी रूप से पुन: उपयोग किया जा सकता है कि कई निजी जांच, की पीढ़ी के छोटे से अतिरिक्त समय और ब्याज की जीन सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि प्लास्मिड प्राप्त करने के अलावा अन्य लागत निवेश के साथ संभव है। हमारे अनुभव में, जांच के प्रत्येक उपयोग के साथ आते हैं कि अपरिहार्य छोटे dilutions के बावजूद गतिविधि में थोड़ा नुकसान के साथ साल के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। अंत में, थोड़ा अनुकूलन requi नहीं हैलाल अलग जांच का उपयोग करते हैं।
जांच संश्लेषण की गुणवत्ता प्रोटोकॉल की सफलता में एक महत्वपूर्ण कारक है। वहाँ शाही सेना जांच की गुणवत्ता की जांच करने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन बस एक tae जेल पर शाही सेना जांच चल काफी विश्वसनीय है कि एक तेजी से और आसान तरीका है। हम नियमित रूप से शाही सेना दाग ethidium ब्रोमाइड का उपयोग करें और है कि ज्यादातर संस्थाओं द्वारा विशेष हैंडलिंग और जैल के निपटान की आवश्यकता है। हम विशेष रूप से visualizing जांच के लिए उन लोगों की तुलना नहीं की है, हालांकि गैर विषैले विकल्प व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। यह एक tae जेल पर डीएनए की तुलना में कुछ हद तक फजी दिखाई देगा, हालांकि जांच के लिए एक एकल बैंड के रूप में चलाना चाहिए। शाही सेना की मात्रा का एक अनुमान प्राप्त किया जा सकता है: एक अच्छी प्रतिक्रिया शाही सेना के बारे में एक माइक्रोग्राम प्रति / μl होगा। एक आसानी से कल्पना बैंड शाही सेना के कम से कम 0.5 माइक्रोग्राम प्रति प्रतिनिधित्व करेंगे और एक उज्ज्वल बैंड एक माइक्रोग्राम प्रति अधिक का प्रतिनिधित्व करेंगे। स्पष्ट रूप से पूरी तरह से सही है और कुछ अनुभव की जरूरत नहीं है हालांकि जेल रैप है पर, मात्रा का ठहराव आधारितआईडी और सीटू प्रक्रिया में की मजबूती यह अच्छी तरह से काम करने के लिए अनुमति देता है। Repeatability के बारे में चिंता है, तो एक बड़ी आसानी से हम नहीं मिली है, हालांकि यह एक प्रमुख चिंता का विषय हो सकता है, प्रतिलेखन प्रतिक्रिया की एक छोटी राशि यों के लिए यूवी absorbance का उपयोग कर सकते हैं। अंत में, जेल टेम्पलेट डीएनए का सफाया कर दिया गया है अगर एक को देखने के लिए अनुमति देता है। जेल में कोई शाही सेना है कि वहाँ इंगित करता है, तो दो likeliest स्पष्टीकरण एक बुरा डीएनए टेम्पलेट हैं या प्रतिलेखन बफर अच्छी तरह से काम नहीं कर रहा है। प्रतिलेखन 37 डिग्री सेल्सियस के लिए बफर और पूरी तरह से मिश्रण उपयोग करने से पहले, या प्रतिलेखन प्रतिक्रिया करने के लिए नए सिरे से 100 मिमी डीटीटी का 1 μl के अलावा ताप कभी कभी उत्तरार्द्ध के साथ मदद कर सकते हैं। प्रतिलेखन प्रतिक्रिया बफर का एक महत्वपूर्ण घटक spermidine है और यह महत्वपूर्ण बफर के वार्मिंग बनाने कम तापमान पर डीएनए टेम्पलेट तेज़ कर सकते हैं। बफर में डीटीटी भी प्रतिक्रिया बाधा काफी तेज़ कर सकते हैं। एक वेग बफर में देखा जाता है, तो समाधान गर्म औरभंवर सख्ती। ऐसे RNase गतिविधि को रोकने के लिए, DEPC या वाष्पदावी सुझाव और ट्यूब के साथ पानी के उपचार के रूप में किसी भी असामान्य सावधानियों लेने के लिए कोई जरूरत नहीं है। वाणिज्यिक ribonuclease अवरोध करनेवाला की उपस्थिति वातावरण से RNases के खिलाफ काफी सुरक्षा प्रदान करता है। अन्य UTP लेबल हमारे अनुभव में, हालांकि, इस तरह के fluorescein के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि नोट digoxigenin लेबल UTP और विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी संयोजन सबसे अनुरूप परिणाम प्रदान करता है।
जांच पीढ़ी के लिए प्रारंभिक प्रोटोकॉल संश्लेषित जांच के क्षारीय hydrolysis के अधिक से अधिक जांच के प्रवेश के लिए अनुमति देने के लिए 4 से किया जाना चाहिए कि सुझाव देते हैं। जांच की hydrolysis सीटू संकरण प्रक्रिया में साथ मदद करने के लिए प्रकट नहीं होता है; अधिक से अधिक 500 से बीपी की शाही सेना जांच आमतौर पर एक उत्कृष्ट संकेत और लंबाई में अब से दो केबी भी अच्छी तरह से काम कर रहे हैं कि जांच दे। लक्ष्य शाही सेना प्रचुर मात्रा में है अगर छोटे जांच काम कर सकते हैं लेकिन अब जांच ख दे देंगेएटर धुंधला। अब जांच को तोड़ने के लिए क्षारीय पाचन का प्रयोग करने में कोई स्पष्ट लाभ होने के लिए वहाँ प्रकट नहीं होता है।
भ्रूण के प्रारंभिक निपटने में देखभाल बहुत जरूरी है। निषेचन लिफाफा का हटाया तंत्रिका गुना बंद करने और पूर्व निषेचन लिफाफे के बाहर प्राकृतिक अंडे सेने के बाद भ्रूण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। निषेचन लिफाफे के अंदर भ्रूण के बढ़ाव के दौरान, भ्रूण curled हो जाता है और उस स्थिति में तय करते हैं, तो भ्रूण स्वस्थानी संकरण में के बाद छवि के लिए कठिन हैं। भ्रूण निर्धारण से पहले निषेचन लिफाफा से हटा रहे हैं हालांकि, अगर वे तेजी से बाहर सीधा। भ्रूण झिल्ली हटाने के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे हैं, क्षतिग्रस्त ऊतकों घाव स्थल पर सीटू संकरण संकेत में एक झूठी में परिणाम कर सकते हैं क्योंकि उन्हें निर्धारण से पहले घाव चंगा करने के लिए अनुमति देते हैं। छोटे हैं, घावों को अक्सर मिनट 19 भीतर, बहुत तेजी से चंगा। यह भी भ्रूण du नुकसान पहुंचा सकता है बाद के चरणोंसमाधान बदलते जब अंगूठी तरल हस्तांतरण और इतनी देखभाल की जरूरत है। प्रारंभिक चरणों में नुकसान आम तौर पर भ्रूण बुरी तरह से प्रक्रिया के अंत तक क्षतिग्रस्त हो जाएगा और क्षतिग्रस्त क्षेत्रों के नुकसान की नजर में सीटू संकेतों में झूठी कारण होगा कि इसका मतलब है। इसके अलावा, ऊपर से 30 भ्रूण हालांकि इस बात के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं रातोंरात दिन 3 या कपड़े धोने पर washes के बढ़ रही है, वर्णमिति प्रतिक्रिया के दौरान विकासशील उच्च पृष्ठभूमि के अधिक से अधिक संभावना है एक एक शीशी में है, लेकिन अधिक भ्रूण के साथ जांच की जा सकती है।
इस प्रोटोकॉल में, चरणों की संख्या कम हो गया है और कई आमतौर पर इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के उपयोग का सफाया कर दिया गया है। इस प्रोटोकॉल एक proteinase कश्मीर पाचन और सकारात्मक आरोप लगाया समूहों को ब्लॉक करने के एसिटिक एनहाइड्राइड के उपयोग सहित कई अन्य प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाता है कि कई कदम समाप्त ध्यान दें। स्तनधारी और एवियन भ्रूण पर लेकिन Xenopus का उपयोग करने में लग रही है जब उन कदमों अभी भी उन कदमों को नष्ट करने के ओ कम असर पड़ता है, उपयोगी हो सकता हैएन स्वस्थानी संकरण में के अंतिम परिणाम है। ये वही सरलीकरण अन्य प्रजातियों के लिए सीटू संकरण प्रोटोकॉल में लागू किया जा सकता है कि क्या हमारी प्रयोगशाला निर्धारित नहीं किया गया है। विशेष रूप से proteinase कश्मीर पाचन अभी भी इस तरह के मामले की जांच पैठ अधिक से अधिक सीमाएँ हो सकती है, जहां लड़की या माउस के रूप में अन्य भ्रूण में आवश्यक हो सकता है।
बी.एम. बैंगनी सब्सट्रेट के उपयोग के लिए सुविधाजनक और विश्वसनीय है। हालांकि, भ्रूण में लक्ष्य शाही सेना स्थानीयकरण करने के लिए आवश्यक हैं कि precipitating, रंग क्षारीय substrates के लिए उपलब्ध अन्य विकल्पों में से एक नंबर रहे हैं। विशेष रूप से, एनबीटी / BCIP का एक संयोजन आमतौर पर 4 का इस्तेमाल किया और अच्छी तरह से काम करता है। कुछ रंग अभिकर्मकों जो मामले में, धुंधला के बाद मेथनॉल के उपयोग के दाग को समाप्त होगा और बचा जाना चाहिए, मेथनॉल में घुलनशील हैं। साइट में डबल जब प्रदर्शन अन्य रंग संयोजन का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इसी तरह के एक संयोजन (बल्कि बी.एम. बैंगनी से एनबीटी / BCIP) का उपयोग भी दिखाया गया हैमाउस भ्रूण 20 का उपयोग करते समय बहुत मजबूत होने के लिए। धुंधला के नीले रंग और भ्रूण के अंतर्जात वर्णक स्पष्ट रूप से तस्वीरों में भेद करने के लिए कई बार मुश्किल कर रहे हैं। सूरजमुखी मनुष्य भ्रूण का प्रयोग भी वर्णक को समाप्त होगा लेकिन विरंजन समाधान लगभग रूप में प्रभावी है और यह प्रजनन के लिए सूरजमुखी मनुष्य वयस्कों के रखरखाव की आवश्यकता नहीं है के रूप में और अधिक सुविधाजनक है। धुंधला अपेक्षाकृत कमजोर है, तो मजबूत विरंजन कि धुंधला जोर कर सकते हैं। धुंधला मजबूत है, कुछ प्रकाश वर्णक छोड़ने के लिए एक प्रभावी विपरीत हो सकता है और भी orienting और भ्रूण के मंचन के साथ मदद कर सकते हैं।
शाही सेना जांच में रातोंरात संकरण के बाद, प्रोटोकॉल सीटू संकरण रोबोट में एक के उपयोग के लिए यहां उल्लिखित सख्ती से मार्गदर्शन प्रोटोकॉल से हट जाना जा सकता है। रोबोट रात के माध्यम से काम करता है के रूप में सीटू संकरण रोबोट में के उपयोग के एक दिन के लिए कम किया जा सकता दिवस दो और मैनुअल प्रोटोकॉल के तीसरे दिन के रूप में लगभग एक पूरा दिन बचाता है एकडी उपयुक्त तापमान में परिवर्तन के सभी कर सकते हैं। रोबोट भी अपने परिणामों में बहुत संगत है और एक साथ कुशलता से कई नमूनों की जांच करने के लिए अनुमति देता है। कि जांच के पुन: उपयोग और अभिकर्मक के छोटे संस्करणों के उपयोग के लिए अनुमति देता है के रूप में यह हाथ से पहले दिन करना लाभप्रद रहता है। एक रोबोट का उपयोग कर के ही महत्वपूर्ण नुकसान साधन की प्रारंभिक लागत है।
इस प्रोटोकॉल स्वस्थानी संकरण में तरीकों को प्रभावी ढंग से छवि एक के कुछ चर्चा। यह छवि खराब है अगर जानकारी के इतने ज्यादा के रूप में खो दिया जा सकता है ऐसा करने के लिए महत्वपूर्ण है। कई मामलों में, एक प्रयोग के बगल में परिणामों की इमेजिंग प्रारंभिक प्रयोग के रूप में एक ही समय की आवश्यकता है। ऐसे विरंजन की डिग्री के रूप में प्रक्रिया चर के कुछ तत्वों को व्यक्तिगत पसंद का एक तत्व है। अन्य इमेजिंग प्रभाव एक रंग के आधार पर पकवान रखकर हासिल की जा सकती है। अक्सर अगर एक मामूली नीले रंग छाया बैठने में के गहरे नीले धुंधला जोर कर सकते हैंयू के संकरण। बस इच्छित प्रभाव पाने के लिए नीले रंग की प्लास्टिक की एक शीट के ऊपर अगर युक्त पेट्री डिश में डाल दिया।
हालांकि, यहां उल्लिखित तरीकों इमेजिंग संभावनाओं का पता लगाने के लिए जो के साथ एक आधार प्रदान करते हैं। (वे सामान्य प्रकाश व्यवस्था की स्थिति के तहत दिखाई के रूप में देखा) भ्रूण में देखा या तो मंजूरी दी जा सकती है या मिलावटी (बेहतर दृश्य आंतरिक संरचना को पारदर्शी बनाया)। छवि को भ्रूण अभिव्यक्ति की साइट पर निर्भर है कि कैसे करने के संबंध में निर्णय के कुछ। अभिव्यक्ति पर या भ्रूण की सतह के पास है, यह समाशोधन के बिना भ्रूण छवि के लिए सबसे अच्छा है। मिलावटी भ्रूण का उपयोग करने के कई फायदे हैं। भ्रूण समाशोधन की प्रक्रिया कई चरणों और भ्रूण खाली करने के लिए रसायनों का इस्तेमाल किया संभालना मुश्किल कर रहे हैं की आवश्यकता है। इसके अलावा, भ्रूण में कई cavities के झूठे गुहा धुंधला में परिणाम कर सकते हैं कि क्षारीय फॉस्फेट substrates के तेज़ी अनुमति देते हैं। जल्दी भ्रूण और pharyn की विशेष रूप से, blastocoelGEAL गुहा अक्सर धुंधला (चित्रा 4) दिखा। इस झूठी धुंधला साफ नहीं कर रहे हैं कि भ्रूण में दिखाई नहीं देता है। अधिकांश भाग के लिए, यहां तक कि मामूली गहरी अभिव्यक्ति जैसे हृदय, गुर्दे, और somites के रूप में mesodermal ऊतकों, और थायरॉयड और जिगर के रूप में इस तरह के endodermal stuctures सहित मिलावटी भ्रूण में देखे जा सकते हैं। देखने के लिए पीबीएस में हाइड्रेट या भंडारण के लिए 100% में डाल मेथनॉल के लिए या तो एक मेथनॉल श्रृंखला के माध्यम से भ्रूण बढ़ते भंडारण और इमेजिंग के कई दौर के लिए अनुमति देता है। मेथनॉल भंडारण एक विस्तारित समय के साथ इमेजिंग के लिए विभिन्न संशोधनों के प्रयास करने के लिए अनुमति देता है।
जीन की अभिव्यक्ति को देखने के लिए सीटू संकरण तकनीक में उपयोग करने के लिए कुछ नुकसान कर रहे हैं। एक भ्रूण और अभिव्यक्ति और अभिव्यक्ति डोमेन आकार में परिवर्तन में सकल परिवर्तन के भीतर तुलना में आम तौर पर स्पष्ट कर रहे हैं, हालांकि अभिव्यक्ति के स्तर को कड़ाई से मात्रात्मक नहीं कर रहे हैं। अन्य आरएनए-आधारित तकनीकों के साथ के रूप में, यह टी के रूप में किसी भी जानकारी प्रदान नहीं करतापरिणामों की व्याख्या सीमित कर सकते हैं, जो ब्याज की जीन, द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन ओ। अंत में, यह सच अभिव्यक्ति डोमेन की तुलना में पृष्ठभूमि धुंधला क्या हो सकता है निर्धारित करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है। यह विशेष रूप से बड़े पैमाने पर हो सकता है कि एक अज्ञात अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ जीन के साथ एक समस्या है। अक्सर, एक ही जीन की भावना कतरा से उत्पन्न एक जांच गैर विशिष्ट धुंधला के लिए एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। भावना कतरा नियंत्रण के उपयोग अभिकर्मकों के साथ एक समस्या के बारे में कुछ जानकारी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन यह antisense जांच के आधार पर धुंधला पूरी तरह से सही है कि निश्चित सबूत प्रदान नहीं करता है। कई भ्रूण उपयोग किया जाता है जब बगल में एक से उल्लेखनीय परिणाम आम तौर पर भ्रूण भर में लगातार कर रहे हैं और यह एक धुंधला पैटर्न में विश्वास का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, जीन के विभिन्न भागों, विशेष रूप से ग़ैर-अनुवादित क्षेत्रों से उत्पन्न विभिन्न antisense जांच, वे एक ही धुंधला पैटर्न दे तो यह देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वे ऐसा करते हैं,यह समान है अगर यह भी मनाया धुंधला पैटर्न में आत्मविश्वास प्रदान करता है। पतला जांच भी एक ही धुंधला स्वरूप उभर देखने के लिए अगर धुंधला समाधान करने के लिए लंबे समय तक निवेश के साथ प्रयोग किया जा सकता है। आम तौर पर एक धुंधला पैटर्न में विश्वास प्रेरित एक पहलू है कि उस पैटर्न एक विशिष्ट भ्रूण संरचना से मेल खाती है या नहीं। साइट में पर्याप्त अब उपन्यास अभिव्यक्ति पैटर्न अपेक्षाकृत दुर्लभ घटनाओं की संभावना है कि जीन की एक विशाल विविधता के साथ किया गया है। सीटू छवियों में से बड़े डेटाबेस छवि परिणामों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि विभिन्न जीवों के लिए स्थापित किया गया है। Xenopus भ्रूण के लिए, Xenbase (www.xenbase.org) अभिव्यक्ति पैटर्न को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक संसाधन का एक उत्कृष्ट उदाहरण है। अन्य मॉडल जीवों भी छवियों के समान है, व्यापक डेटाबेस है।
इन संभावित निरंतर बावजूद, बगल में संकरण के लिए अत्यंत उपयोगी है कि एक शक्तिशाली और विश्वसनीय उपकरण रहता हैजीवोत्पत्ति का अध्ययन। यह सेल प्रकार की पहचान करने और निकट भविष्य के लिए जीन अभिव्यक्ति डोमेन में परिवर्तन की जांच के लिए पसंद की विधि रहने की संभावना है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
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