Protocol
1. Эмбрион Подготовка
- Если это не сделано регулярно как часть эмбриона культуры, де-желе эмбрионов с использованием 2,5% цистеин, pH 8,0 до фиксации 8. Хотя это не является абсолютно необходимым, полезно затем вручную удалить оплодотворения конверт до фиксации с использованием тонких щипцов.
- Используйте стекло пипетки Пастера перенести эмбрионы. Пипетки не достаточно широким, чтобы передать эмбрионы, так что используйте с бриллиантом перо, чтобы сократить стеклянную пипетку в точке достаточно широким, чтобы забрать эмбрион. Исключите острые края пипетки после резать, быстро передавая вырезать наконечник через пламя горелки Бунзена, чтобы расплавить острые края.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уход должны быть приняты, как стекло может все еще быть достаточно горячей, чтобы вызвать ожоги, хотя это, кажется, охлаждается визуального осмотра.
- Используйте стекло пипетки Пастера перенести эмбрионы. Пипетки не достаточно широким, чтобы передать эмбрионы, так что используйте с бриллиантом перо, чтобы сократить стеклянную пипетку в точке достаточно широким, чтобы забрать эмбрион. Исключите острые края пипетки после резать, быстро передавая вырезать наконечник через пламя горелки Бунзена, чтобы расплавить острые края.
- Выполните фиксацию эмбриона в несколько этапов. Во-первых, подготовить стеклянные флаконы для использования в зародыше фиксации. Используйте эти пузырьки на всех этапах, включая финалхранение. Использование флаконов, которые понятны с хорошей уплотнения тефлоновой в крышке, что позволяет для мониторинга эмбрионов во всех этапах процесса. Добавьте флаконы с соответствующей экспериментальной информации с использованием постоянного маркера, а затем покрывают этикетку с четким ленты, так как даже маркером будут потеряны в течение процедуры за счет использования спиртов и других растворителей.
- Используйте Mempfa исправить эмбрионов. Сделать запас 8% параформальдегидом в партиях 50-100 мл за один раз. Использование примерно 75% от необходимого H 2 O и нагревают до 50-60 ° С, что необходимо, чтобы получить параформальдегид в раствор.
Примечание: данное решение немного отличается от Memfa используется в старых версиях опубликованных протоколов в том, что он использует параформальдегида, а не формальдегида. - Добавьте 2-3 капель 10N NaOH или до тех пор, пока рН не составляет примерно 7,5 (использование лакмусовой бумажки для проверки рН). Параформальдегид очень токсичен, поэтому генерировать исходный раствор в вытяжном шкафу. После того, как параформальдегида в растворе, фильтруют раствор через ватмана в свежем контейнера и добавить H 2 O до конечного объема. При необходимости хранить параформальдегида раствора при 4 ° С в течение 1-2 недель.
- Сборка остальные компоненты раствора фиксации Mempfa (Таблица 1). Убедитесь, что заключительная рабочая концентрация параформальдегида 4%. Хранить все компоненты фиксирующего раствора при 4 ° С в запасах.
- Используя стеклянную пипетку вырезать, исправить эмбрионов путем добавления эмбрионов с меченым стеклянные флаконы, которые были заполнены с приблизительно 3-4 мл раствора Mempfa (Таблица 1). Избегайте крепления более 20-30 эмбрионов в пузырек. Добавить эмбрионов с минимумом жидкости передачи из эмбриона среды. Исправить эмбрионов в растворе Mempfa в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
- За несвоевременное энтодермы структур выполнять в Situs вручную изолированных кишечных и энтодермы производных 9,10, Который позволяет для хорошего проникновения зонда, а также предотвращает окрашивание полости.
- Хранить раствор 100% метанолом при -20 ° С. После фиксации параформальдегидом, замените решение Mempfa приблизительно с 4 мл -20 ° C, 100% метанола для хранения эмбрионов.
- Вихревой флаконов после добавления метанола, чтобы предотвратить эмбрионов от прилипания к стеклу или других эмбрионов. Кроме того, убедитесь, что флаконы плотно закрытыми, потому что метанол может испариться в морозильной камере в течение долгого времени, если свободно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы могут храниться в течение по крайней мере года, и, вероятно, больше, в метаноле перед окрашиванием без потери качества гибридизация.
- Используйте Mempfa исправить эмбрионов. Сделать запас 8% параформальдегидом в партиях 50-100 мл за один раз. Использование примерно 75% от необходимого H 2 O и нагревают до 50-60 ° С, что необходимо, чтобы получить параформальдегид в раствор.
2. Зонд Подготовка
- Использование 1-2 мкг матричной ДНК, чтобы сделать дигоксигенином-меченых зондов. Сокращение плазмиду, содержащую ДНК-последовательность, соответствующую по 5'-концу гена интереса рестриктазой подходит для Тат вектор для создания антисмысловых зондов.
ПРИМЕЧАНИЕ: плазмиды должны иметь соответствующий РНК-полимеразы сайт связывания (например, T7, T3 или SP6). - Разрешить ДНК, вода, NTP смешивать и полимеразной буфера нагреться до комнатной температуры перед сборкой реакции синтеза зонда. Добавить компоненты реакции синтеза РНК в 1,5 мл микроцентрифужных трубки в порядке, как указано в таблице 2. Настройка громкости добавленной воды, чтобы довести общий объем реакции синтеза зонд 20 мкл. Сборка реакцию при комнатной температуре, потому что компоненты буфера полимеразы может осадить ДНК шаблона, когда в высоких концентрациях и холода.
- Инкубируйте реакции транскрипции в течение 2 ч при 37 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубации чуть больше чем за два часа не приводит к неблагоприятным последствиям, но и показать несколько увеличился урожай. Если инкубировали в течение одного часа, выход будет снижена, но все еще достаточно, чтобы сделать хорошее зонд.- В ожидании реакции транскрипции до конца, сделать агарозном геле, который будет использоваться для проверки качества зонда. Melt 1 мкг агарозы в 100 мл 1x TAE буфер (таблица 1) при нагревании раствора до температуры кипения. Удалить решение от тепла, когда агарозном порошок полностью не растворится.
- Добавить 2 мкл этидий бромида исходного раствора (10 мг / мл) до приблизительно 100 мл агарозном геле агарозы при остынет до около 60 ° С, чтобы позволить визуализацию РНК под действием ультрафиолетового (УФ) света.
Примечание: Этот раствор агарозном геле можно хранить в 60 ° C инкубаторе с тем, что будущие гели можно вылить без повторного плавления. Будьте осторожны при обращении с бромид этидия из-за потенциальной токсичности.
- Добавить 1 мкл (DNAseI РНКазы сорт) к реакции транскрипции после 2 ч инкубации и инкубировать еще в течение 10 мин при 37 ° С, чтобы исключить матричной ДНК.
- Удалить 1 мкл реакционной смеси, чтобыпроверить на 1% агарозном TAE геле-и остальной (20 мкл) добавляют 80 мкл 1% SDS в ТЕ буфере (10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), 10 мкл 5 М NH 4 ацетат и 220 мкл холодного этанола. Vortex смесь энергично и отложите в сторону на льду, пока результаты проверки качества РНК не известны.
- Запустите 1 мкл РНК удалены перед осаждением на 1% агарозном TAE геле. Чтобы облегчить нагрузку на геле, добавить 4-5 мкл воды и 1 мкл стандартного загрузочного красителя к РНК. Просмотр РНК на геле с использованием УФ-света просвечивания для проверки качества зонда (см обсуждение).
- Осадок оставшуюся РНК, которая была установлена в сторону на льду в шаге 2,5 спиннинг в микроцентрифуге при полной скорости в течение от 10 до 15 мин. Откачать супернатант с вытянутой стеклянной пипетки и позволяют немного высохнуть.
- Ресуспендируют зонд 1 мл РНК гибридизации буфера (таблица 1) в пробирку Эппендорфа. Vortex и шiefly нагрева трубки до 37 ° С и снова вихрь. Перенесите раствор зонда для 15 мл завинчивающейся полистирола трубку и заполнить до 7-10 мл с РНК-гибридизации буфера. Примечание: датчик может быть разбавлен дальше (10 раза дополнительное разбавление все еще может работать) часто приводит к низким уровнем фона, но реакции окрашивания также занять больше времени.
3. В гибридизация
- Возьмем эмбрионов, которые были сохранены в -20 ° C метанола и дают нагреться до комнатной температуры. Выполните всю процедуру в стеклянных флаконах. Если разные эмбрионы из одной группы будет посмотрел на различных зондов, не храните их в одном флаконе только перед зонды добавил, чтобы уменьшить изменчивость и труда в первый день.
- Увлажняет эмбрионов через ряд метанола, как описано в таблице 3 (см таблицу 1 для стирки рецептов) в рамках подготовки к добавлением зонда. Аккуратно вихревой ЭмбриОС после каждого изменения, чтобы гарантировать, что они не выступает в стороны или друг с другом, и рок эмбрионов путем установки флаконов на nutator. При передаче жидкости, проверьте внутреннюю часть крышки, чтобы убедиться, что эмбрионы не были в ловушке там.
- После того как в растворе зонда, гибридизацию в течение ночи эмбрионов, как описано в таблице 3.
- Удалить раствор зонда. Сохранить используемого зонда при хранении в 15 мл завинчивающейся полистирола трубки, отмеченные даты и количество раз зонд была использована, при -20 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: же зонд может быть использован повторно много раз для последующего в точке гибридизации до колориметрические реакции не начать принимать аномально много времени, чтобы достичь желаемой интенсивности.- После того, как зонд удален, подготовки эмбрионов для окрашивания антител против зонда через серии промывок, описанных в таблице 4. Изменение температуры по мере необходимости (таблица 4), перемещая тон nutator, с пузырьками эмбрионов, прикрепленных непосредственно в гибридизации печи, которые установлены до соответствующей температуры.
- Составляют соответствующий объем MAB + HTSS + BR + анти-Dig антитела (таблица 4) в то время, что эмбрионы инкубируют в МАВ + HTSS + BR блокирующего раствора таким образом, что антитело до их добавлением к эмбрионов. Сделать блокирующие растворы свежего в день использования.
- Удалить раствор антител и начинают моет, как показано в таблице 5 следующей инкубации в течение ночи с антителом. Выполнение по крайней мере, двенадцать 30 мин промывки с целью подготовки для окрашивания с щелочной фосфатазы подложки и уменьшить фон в максимально возможной степени. Используйте либо буфер МАБ или раствор ТБТ (таблица 1) на стадии отмывки.
Примечание: раствор ТБТ является TTW, который имеет 2 мг / мл BSA добавляли.- Заменить последнее промывочного раствора с БМ Фиолетовый щелочной фосфатазы подложки. Выполните окрашивание Reacции на любом комнатной температуре или 37 & deg; С.
Примечание: Окрашивание более быстро при 37 ° C, но если оставить на ночь, неприемлемы фоновое окрашивание часто может быть результатом. Реакции окрашивания будет часто требуют окрашивания в течение ночи и при комнатной температуре является самым безопасным выбором. - Если в дальнейшем окрашивание не требуется, и пурпурный раствор BM берет на себя синим цветом, замените окрашивания раствора с пресной BM Фиолетовый и поставить пробирки в 37 ° C. Если целевой мРНК очень обильным, поместить эмбрионов в окрашивающего раствора при 4 ° С в течение ночи, а затем перейти эмбрионов до комнатной температуры или 37 ° С для улучшения мониторинга реакции окрашивания.
- Тщательно отслеживать новые реакции, как время окончательного результата значительно варьируется между различными целевыми РНК. Для согласованности, остановить реакцию окрашивания (см 3.4), когда нет никаких новых сайтов выражения, возникающие с более инкубации. Важно отметить, что, если в гибридизация используется в качестве тестадля экспериментов, глядя на различных группах лечения, использовать то же самое время для цветных реакций между опытной и контрольной эмбрионов.
- Заменить последнее промывочного раствора с БМ Фиолетовый щелочной фосфатазы подложки. Выполните окрашивание Reacции на любом комнатной температуре или 37 & deg; С.
- Остановить реакцию окрашивания и подготовки эмбрионов для хранения и записи изображения путем изменения жидкости, как указано в таблице 6. Не раскачивайте эмбрионов на этой стадии, потому что удаление пятна можно представить в виде пурпурная окраска метанола вокруг эмбрионов.
Примечание: Часто эмбрионы имеют светло-голубой окраски с раствором окрашивающего и холодным метанолом может, по меньшей мере, частично удалить, что, хотя это и не является достаточным, чтобы удалить тяжелую фона или окрашивание полости. Холодным метанолом относится к метанола, который поддерживается в -20 ° C морозильнике.- Увлажняет эмбрионов и исправить пятно Mempfa (таблица 6). После того, как фиксированной, удалите Mempfa и мыть эмбрионов с 25% метанола.
- Снимите 25% метанола и добавляют отбеливающий раствор, если удаление эндогенного пигментанеобходимо. Будьте осторожны при обращении с отбеливающий раствор, как это может привести к ожогам. Обратите внимание на отбеливание тесно, как это происходит относительно быстро и степень отбеливания может варьироваться для разных эффектов (рисунок 2).
- Дегидрировать эмбрионов через метанол серии до 100% метанола для длительного хранения следующих отбеливания, или передать PBS для кратковременного хранения и последующей обработки изображений (табл 6).
4. визуализации Эмбрионы
- После того, как эмбрион завершила процесс окрашивания, изображение эмбриона, так что информация о том, где интерес ген экспрессируется в плен для более широкой аудитории. Используйте 1% агарозном в качестве фона, чтобы посмотреть непогашенные эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: агарозы дает синий / серый фон, который хорошо контрастирует с эмбриона и синего цвета реакции окрашивания. Это также помогает диффузного отвлекающие тени и отражения, которые отвлекают внимание от эмбриона.- Добавить в агарозном в воду и затем довести до кипения, пока агарозном находится в растворе, а затем дайте остыть до 50 перед заливкой в чашке Петри. Как и в раствор геля TAE, хранения раствора агарозы в 55 ° C инкубаторе в течение нескольких целей. Налейте агарозы на глубину около 2 мм в чашках Петри. При необходимости, регулировать глубину агарозы с получением слегка иначе оттенок фоне.
- После регидратации из хранилища в метаноле с водным раствором (PBS) или TTW, используя ряд метанол, поместить эмбрионов в чашке Петри с агарозном базы (табл 6). Держите решение чистым и если необходимо, использовать простой фильтрации для устранения мелких частиц вещества, которые могут нарушить чистый фон хороших изображений.
- Для изображения эмбрионы из альтернативных взглядов, например, от вентральной стороне, нарезать тонкими каналами в агарозы, чтобы соответствовать эмбриона с использованием тонких щипцов и поместите эмбрионы в этих каналов для ориентации (рис 3 ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство ступени имеют характерный позицию, что они берут на себя, когда помещали в раствор. Например, зародыши бластула-стадии, как правило, сидят на животных стороной вверх. После того, как эмбрионы начинают удлиняться, они лежали на их стороне.
- Используйте волоконно источник оптического света, чтобы осветить эмбрион из малым углом, создавая тени на эмбрион, которые обеспечивают глубину изображению и помочь распознать поверхностные структуры. Потому что отбеливание может устранить пигмент, который содержит полезные ориентиры, использовать теневое копирование для сильно обесцвеченных эмбрионов.
- Снимите эмбрионов окрашивания образа, который глубоко внутри эмбриона, например, в хорде, легких, или областей мозга, (рисунок 4). Чтобы достичь этого, не поставить эмбрионов через серию метанола до 100% в метаноле.
- После полного погружения в метаноле, передачи эмбрионов к раствору одной части бензилового спирта и две части бензил бытьnzoate (Бабб). Эмбрионы первоначально будет плавать на поверхности, но, как метанол смешивается с Babb, они будут погружаться в Babb. Выполните каждый шаг, касающийся Бабб в стеклянных флаконах или блюд; Бабб растает любого пластика или краски.
- После очистки, просматривать эмбрионов в проходящем свете, идущим снизу эмбриона. Регулировка интенсивность света, а также угол снизу, чтобы улучшить контраст и обеспечивают лучший цвет.
- При просмотре очищенные зародыши повысить стеклянную чашку Петри от основания. Сделайте это, просто используя два других чашке Петри крышки, чтобы поднять его так, что область блюдо с эмбрионами повышен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это имеет преимущество в том, базу в фокусе и ликвидации отвлекающие эффекты от несовершенства или пятна на микроскопе базы, которые могут помешать изображения.
5. Дважды в гибридизация
- Для того, чтобы одновременно видеть паттерн экспрессии TWO различных генов в одной эмбриона, синтезируют два зонда, по одному для каждого из различных генов. Синтезируют один зонд с использованием набора DIG-11-UTP в качестве метки, как описано выше. Развести продукт реакции транскрипции в РНК гибридизации буфера с получением 3-кратным более концентрированный, чем зонд для одного в точке гибридизации.
- Обобщить другой зонд интереса используя тот же протокол, для DIG меченых исследовали исключением того, что флуоресцеина-12-UTP должны быть заменены DIG-11-UTP. Развести продукт реакции транскрипции в РНК гибридизации буфера с получением 3-кратным более концентрированный, чем зонд для одного в точке гибридизации.
- Смешайте два концентрированных проб в соотношении 1: 1. Для достижения наилучших результатов используйте флуоресцеина-меченным зондом для гена, который показывает сильное выражение в один протокол гибридизация в.
- Используйте тот же протокол гибридизация в описанной для одного в месте </ EM> гибридизации, за исключением того, использовать двойной зонд (зонд, содержащий концентрированную смесь 1.5x дигоксигенином меченных и меченных флуоресцеином зонды) в конце первого дня вместо одного в гибридизация зонда.
- Следуйте один протокол гибридизации на второй день дважды протокола гибридизация в, за исключением использования антифлуоресцеин-AP Fab фрагментов в разведении 1: 4000 в месте анти-DIG-AP Fab фрагментов. Промыть избытка антитела из эмбриона, как в один протокол полевых наблюдений и провести первый цветной реакции с помощью BM-фиолетовый AP субстрата.
- После первого цветной реакции, инактивируют flourescein антитела в 0,1 М глицина, рН 2,0 в течение 40 мин, а затем на пять десять мин промывок в МАБ. Блок эмбрионов в МАБ + HTSS + BR в течение 90 мин. Добавить антитела анти-DIG при разведении 1: 2000 в MAB + HTSS + BR и инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
- На следующий день, мыть эмбрионов йoroughly в МАВ (12 промывок 30 мин), чтобы удалить избыток антитела.
- Вымойте эмбрионов в течение 10 мин в ЗС буфера (таблица 1), а затем окрашиваются БХИФ (0,5 мг / мл в АР буфера).
ПРИМЕЧАНИЕ: в сочетании месте должен дать темно синего-фиолетового пятна на первый цветной реакции и светло-голубой цветовой реакции на второй (рис 5). - Остановка окончательного цветной реакции путем удаления буфера AP и промыть три раза МАВ. Fix эмбрионов с Mempfa в течение 10 мин. Вымойте эмбрионов с 5 быстрых промывок в МАБ или ТБТ.
- С этой цветовой комбинации, использование метанола в пост окрашивания лечения уже не возможно, так как это позволит устранить одиночку цвет BCIP. Храните эмбрионов после окрашивания и фиксации в PBS с 0,02% азида натрия. Окрашивание интенсивность, может быть слабым с двойным в места нахождения имущества. Если это является проблемой, уменьшить до четырех промывок, каждое из 2 ч длительности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование тканей специфических зондов может обеспечить недостающей информации в отношении состояния развития конкретных органов. В следующих примерах, стадия эмбриона на основе промежуточной таблицы Nieuwkoop и Faber 11. Если использовать гены зонды формы, выраженные после дифференцирования, кардиального тропонина I в стадии 28-30, например (рис 1в), наличие или размер дифференцированной органа может быть оценена на любом этапе после дифференцировки. Много лет назад, эмбриологи смогли сделать такой анализ, основанный на замечательной знания гистологии эмбриона на ранней стадии 12,13, но это опыт был в значительной степени потеряли в текущем поколении эмбриологов. Хотя, потеря этого опыта можно считать прискорбно, надежность и простота использования в технике гибридизации на места делает определение конкретных тканей, доступных для любого исследователя. Ткани, которые являются относительно незаметным, тОн штриховкой железы на эмбриональной стадии 25, например (фиг 1А), можно отчетливо помечены с использованием в Situs без необходимости специфических антител или гистологических методов (рис 1c). Кроме того, использование всей горе в места нахождения имущества позволяет просмотреть весь орган в контексте всего эмбриона, а не полагаться на умозаключения от гистологических срезов (рис 2). Даже ткани, которые глубоко внутри эмбриона в том числе глазного стебля (рис 4) можно рассматривать легко и использование эмбриона очистки может обеспечить резкое разграничение границ органов.
Отбеливание эмбрионов, чтобы удалить эндогенного пигмента с помощью растворов перекиси в значительной степени устранить потребность в использовании альбиносов эмбрионов, которые не имеют пигмента. Отбеливание в течение различного времени может быть полезным. Например, если пятно является сильным, легче отбеливание, которое позволяет для некоторых пигментации следует рассматривать может быть полезно, потому что все этопотоки для лучшего постановки и ориентации эмбриона (рис 2а). Тем не менее, если пятно представляет собой область, где существуют высокие уровни пигментации, таких как почки (фиг.2В), рядом с полной ликвидации пигмента по длинной инкубации в отбеливающего раствора дает лучший результат.
Эмбрионы, как правило, занимают определенные позиции, когда в растворе. После нейруляции, они, как правило, лежать на боку. Это нормально для изображений фланга (рис 2В), но может быть проблема с другими районами. Использование агарозном базы позволяет прорезать каналы в агарозы, которые можно использовать, чтобы ориентировать эмбрионов. Например, предшественники крови локализуется в брюшной стороне зародыша (рис 2А) и в полной мере окрашивания трудно наблюдать. Позиционирование эмбриона в канале с вентральной стороной вверх, то позволяет в полной мере просмотра этой экспрессии генов шаблона (рис 3А). Использование двойной гибридизация может показать отношения между двумя паттернов экспрессии генов в пределах одного организма (рисунок 5) исключает необходимость сравнения между различными эмбрионов, которые могут иметь небольшие различия в морфологии. Возможно, самое главное, использование в гибридизация дает человеку возможность четко маркировать клетки до удаления гистологическое дифференциацию на основе экспрессии генов, которые экспрессируются в ранних предшественников в линии, такие как Pax2 что выражается во многих тканях в раннего эмбриона, до дифференциации (фиг.4А). Способность идентифицировать клетки-предшественники и тканей, которые четко не определяют на основе гистологии, такие как миелоидных предшественников клеток (рисунок 1b), позволило исследователям поставить более конкретные вопросы о состоянии развития органной и также оценить результаты экспериментальных мanipulation с целью причинить внематочной дифференциацию тканей.
Рисунок 1:. Примеры вся гора в гибридизация на эмбрионах Xenopus синий окрашивание от гибридизация эксперимента можно четко разграничить разработке структуры ранней Xenopus эмбрионов () на переднюю вид этап 26 эмбрионов выделения штриховки железы. демаркированной выражения uvs.2 14 (B) вентральный вид эмбрионов с указанием местоположения начале миелоидных клеток на стадии 20, используя выражение миелопероксидазы 15 в качестве маркера (C) раннее сердце в стадии 28.. - 30 визуализируется по выражению сердечного тропонина I 16. Явное преимущество использования этого метода является то, что всеЭти генные паттерны экспрессии были визуализированы с помощью различных зондов, но протокол, используемый одинакова во всех случаях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Различные уровни отбеливания можно использовать для визуализации окрашивание в эмбрионе () Этот синий окрашивание в нижней части этой эмбриона показана экспрессия гемоглобина в вентральной островов крови приблизительно этапе 36. Это область. Эмбрион, который только слегка пигментированных и, таким образом эмбрион не отбеливают в течение длительного времени, как можно видеть на желтовато-коричневого пигмента в глаза и вдоль боковой эмбриона. Будучи в состоянии увидеть пигментацию позволяет лучше визуализировать стадии эмбриона, Если окрашивание в области с большей естественной пигментации, таких как нервной системы и фланг эмбриона, больше отбеливание поможет смотреть на месте, как показано на B. (B) Здесь выражение pax8 17 в формующей почки , pronephric канал и задний мозг лучше всего иллюстрируется после отбеливания снял почти все эндогенного пигмента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Манипуляция агарозном базы может помочь с ориентацией эмбрионов визуализации конкретных регионах эмбриона может быть трудно, потому что они, как правило, занимают определенные позиции в блюдо () В головастика стадии эмбрион будет лежать на боку.. , По разрезака нормально канал в агарозы (черные стрелки) эмбрион можно рассматривать с вентральной стороны, здесь показывая выражение гемоглобина на стадии 36, с достаточно стабильности, чтобы захватить хорошее изображение. (B) Это вид снизу выражения Hand1 на стадии 20 излагается латеральной пластинки мезодермы 6. Эмбрион помещается в небольшое отверстие, что стабилизировала свою позицию с вентральной стороной вверх. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4:. Внутренние органы могут быть просмотрены в обоих непрозрачных неочищенных и в очищенных эмбрионов В неубранный эмбриона окрашивали Pax2 на стадии 34 (А), глазного стебля (желтая стрелка) могут быть визуализированы относительно легкокак может окрашивания вниз нервной трубки. Тем не менее, детали не острые. При очистке эмбрион (б) границы участков выражение, включая и глазного стебля (желтая стрелка) острее. Степень очистки показано способность видеть оба глаза в этом очищается эмбриона. Также обратите внимание, что некоторые окрашивание накоплен во внутренние полости (фиолетовый стрелкой), при просмотре очищенные зародыши общей проблемы.
Рисунок 5:. Представитель дважды в гибридизация на эмбрион Xenopus экспрессия боковой пластины маркера, Hand1, визуализируется светло-синим окрашиванием на стадии 26. Выражение ETV2 в развивающуюся сосудистую визуализируется темно-синий фиолетовый пятно. Выражение Hand1 обычно очень интенсивным и, таким образом, было использовано для тон слабее флуоресцеина-меченый зонд и сочетание BCIP. Использовали дигоксигенином-меченным зондом и BM-фиолетовый сочетание для слабого выражения ETV2.
| Имя | Конечная концентрация | Количество / 100 мл |
| Mempfa | 1 мМ MgSO 4 | 100 мкл 1 М MgSO 4 |
| (Магазин на 4 ° C) | 2 мМ EGTA, рН 8,0 | 10 мл 20 мМ EGTA, рН 8,0 |
| 0,1 М MOPS, рН 7,5 | 10 мл 1 М MOPS, рН 7,5 | |
| 4% параформальдегида, pH 7,5 | 50 мл 8% параформальдегидом, рН 7,5 | |
| ТТЦ | 50 мМ Трис, рН 7,4 | 5 мл 1 М Трис, рН 7,4 |
| 200 мМ NaCl | 4 мл 5 М NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 мкл Tween 20 | |
| Решение 100x Денхардта | 2% БСА | 2 г BSA |
| (Через фильтр 0,2 мкм фильтр, | 2% ПВП-40 | 2 г ПВП-40 |
| хранить при -20 ° С) | 2% Ficoll 400 | 2 г Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 М NaCl | 17,5 г NaCl |
| 300 мМ тринатрийцитрата | 8,8 г тринатрийцитрата | |
| РНК гибридизации буфера | 50% формамид | 50 мл 100% формамида |
| (Магазин на 4 ° C) | 5x SSC | 25 мл 20x SSC |
| 1 мг / мл РНК дрожжей | 4 мл 1 мг / мл дрожжевой РНК, растворенные в 50% -ном формамиде | |
| 1X раствор Денхардта | 1 мл 100x раствора Денхардта | |
| 0,1% Tween 20 | 100 мкл Tween 20 | |
| 5 мМ ЭДТА, рН 8,0 | 1 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 | |
| МАБ | 100 мМ малеиновой кислоты | 1,16 г малеиновой кислоты |
| (РН 7,5, хранить при 4 ° С) | 150 мМ NaCl | 0,88 г NaCl |
| МАБ + HTSS + BR | 100 мМ малеиновой кислоты | 96 мл МАБ |
| 4% Термическая обработка Овцы Сыворотка | 4 мл термообработке овец сыворотки (обработанные нагревом при 55 ° С в течение 30 мин и аликвоты) | |
| 2% блокирующий реагент | 2 г Roche блокирующий реагент | |
| МАБ + HTSS + BR + анти-Dig антитела | 100 мМ малеиновой кислоты | 96 мл МАБ |
| 4% тепла Трeated Овцы Сыворотка | 4 мл термически обработанных овец сыворотки | |
| 2% блокирующий реагент | 2 г Roche блокирующий реагент | |
| 1: 10000 Анти-DIG-AP, Fab фрагментов антител | 1,5 мкл Анти-дигоксигенин-AP, Fab фрагментов антител | |
| Щелочной фосфатазы (AP) буфера | 100 мМ Трис, рН 9,5 | 10 мл 1 М Трис, рН 9,5 |
| 50 мМ MgCl 2 | 5 мл 1 М MgCl 2 | |
| 100 мМ NaCl | 2,5 мл 4 М NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 мкл Tween 20 | |
| Отбеливающий раствор | 0,3% H 2 O 2 | 3,34 мл 30% -ной H 2 O 2 |
| 5% Формамид | 5 мл 100% формамида | |
| 0,5% SSC | 2,5 мл 20х SSC | |
| Очистка Решение | 1/3 бензиловый спирт | 33 мл |
| 2/3 бензилбензоат | 67 мл |
Таблица 1: Решение Рецепты
| Имя | Количество |
| Dig-NTP Mix | 5 мкл 20 мМ ОСАГО |
| (40 мкл реакции) | 5 мкл 20 мМ GTP |
| 5 мкл 20 мМ АТР | |
| 3,25 мкл 20 мМ UTP | |
| 3,5 мкл 10 мМ DIG-11-UTP | |
| 18.25 мкл дистиллированной, в автоклаве воды | |
| Зонд Синтез | х мкл матричной ДНК(В зависимости от концентрации) |
| (20 мкл реакции) | х мкл дистиллированной воды, автоклавного |
| 4 мкл Dig-NTP смеси | |
| 0,5 мкл ингибитора РНКазы | |
| 2 мкл 10X РНК-полимеразы буфера | |
| 2 мкл РНК-полимеразы |
Таблица 2: Датчик Синтез Рецепты
| Название реагента | Ориентировочный объем | Продолжительность | Температура |
| 100% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 75% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 50% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 25% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| ТТЦ | 2 мл | 10 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| ТТЦ | 2 мл | 10 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| ТТЦ | 2 мл | 10 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| Pre-теплый РНК гибридизации буфера и зонд до 65 ° C | |||
| ТТЦ | 4 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| ТТЦ | 4 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| РНК гибридизации буфера | 2 мл | 10 мин, покачиваясь | Номер Temperaturе |
| Подогретого РНК гибридизации буфера | 2 мл | 1 ч, качалки | 65 ° С |
| Зонд Решение | 1 мл | Ночь, покачиваясь | 65 ° С |
Таблица 3: Этапы Первый день в гибридизация протокола (всего около 3 ч)
| Название реагента | Ориентировочный объем | Продолжительность | Температура | ||||
| Предварительно теплой РНК гибридизации буфера и 02.x SSC до 65 ° C и 2х SSC до 37 ° С | |||||||
| Вернуться решения зонда в пробирку для повторного использования | |||||||
| РНК гибридизации буфера | 2 мл | 10 мин, покачиваясь | 65 ° С | 2X SSC | 2 мл | 20 мин, покачиваясь | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 мл | 20 мин, покачиваясь | 37 ° C | ||||
| 0.2x SSC | 4 мл | 1 ч, качалки | 65 ° С | ||||
| 0.2x SSC | 4 мл | 1 ч, качалки | 65 ° С | ||||
| МАБ + HTSS + BR | 1,5 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура | ||||
| МАБ + HTSS + BR + анти-DIG антитела | 1,5 мл | Ночь, покачиваясь | 4 ° C |
Таблица 4: Этапы Второй день в гибридизация протокола (всего около 4 ч)
| Название реагента | Ориентировочный объем | Продолжительность | Температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| МАБ | 4 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| BM Фиолетовый AP основания | 500-750 мкл | Ночь, покачиваясь (см текст) | Комнатная температура / 37 ° C (см текст) |
Таблица 5: Шаги по Третий день в гибридизация протокола (около 7 ч)
| Название реагента | Ориентировочный объем | Продолжительность | Температура |
| 25% метанол | 2 мл 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура | |
| 50% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 75% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 100% метанол (холодный) | 2 мл | 20 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 100% метанол (холодный) | 2 мл | Зависит, нет покачивание | Комнатная температура |
| 75% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 50% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 25% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| Mempfa | 2 мл | 30 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 25% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 25% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 25% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| Отбеливающий раствор | 4 мл | 40 мин-3 ч, качалки | Комнатная температура / 37 ° C (см текст) |
| Хранение эмбрионов | |||
| 25% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 50% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 75% метанол | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 100% метанол | 4 мл | Хранить при -20 ° C | |
| 1x PBS | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 1x PBS | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
| 1x PBS | 2 мл | 5 мин, покачиваясь | Комнатная температура |
Таблица 6: Шаги для остановки в гибридизация, отбеливание и хранения эмбрионов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Возможность использования в гибридизация для визуализации характер экспрессии специфических генов остается наиболее широко используемый метод для определения конкретных органов или типов клеток в эмбрионе Xenopus. Это из-за нескольких преимуществ этого метода. Экспрессия гена может определить конкретные структуры и перед любой гистологической знак дифференциации например, в случае для Nkx2.5 экспрессии в сердце предшественников до любого четкое разграничение этих клеток 18. После того, как все реагенты находятся в руке, это также очень экономически эффективным. Генерация множества отдельных зондов, которые могут быть эффективно повторно, можно с небольшим количеством дополнительного времени и затрат капиталовложений, кроме получения плазмид, кодирующих гены интерес. По нашему опыту, зонды могут быть повторно использованы в течение многих лет с минимальными потерями в деятельности, несмотря на неизбежные небольшие разведения, которые приходят с каждым использованием. Наконец, есть небольшая оптимизация requiкрасный при использовании различных зондов.
Качество синтеза зонда является ключевым фактором в успехе протокола. Есть много способов, чтобы проверить качество РНК зондом, но просто запустив РНК-зонда на геле TAE является быстрый и простой метод, который является довольно надежным. Мы регулярно использовать бромид этидия для окрашивания РНК, а это требует специальной обработки, утилизации и гелей большинстве учреждений. Нетоксичные альтернативы имеются в продаже, хотя мы специально не сравнить тех, для визуализации зондов. Зонд должен работать в виде одной полосы, хотя это будет выглядеть несколько нечетким по сравнению с ДНК на геле ТАЕ. Оценка количества РНК может быть получено: хорошая реакция будет иметь примерно 1 мкг / мкл РНК. Легко визуализировать группа будет представлять, по меньшей мере 0,5 мкг РНК и светлая полоска будет представлять более 1 мкг. Хотя, очевидно, не совсем точно и требует некоторого опыта, количественная на основе геля рэпID и надежность в процедуре месте позволяет ему хорошо работать. Если есть опасения по поводу повторяемости, можно легко использовать УФ-поглощению количественно небольшое количество реакции транскрипции, хотя мы не нашли, чтобы это было серьезной проблемой. Наконец, гель позволяет увидеть, если матричной ДНК была устранена. Если гель показывает, что нет РНК, два вероятными объяснения плохой матричной ДНК или, что буфер транскрипции не работает хорошо. Отопление буфер транскрипции 37 ° С и тщательного перемешивания перед использованием, или добавление 1 мкл свежей 100 мМ DTT в реакции транскрипции иногда может помочь с последнего. Важным компонентом реакционного буфера транскрипции спермидин и может осадить ДНК-матрицы при низких температурах делает потепление буфера важной. ДТТ в буфере также может значительно осаждения ингибируют реакцию. Если осадок видели в буфере, теплый раствор ивихрь энергично. Там нет необходимости для принятия каких-либо необычные меры предосторожности, например обработкой воды с DEPC или автоклавирования советы и труб, для предотвращения РНКазы деятельности. Наличие ингибитора рибонуклеазы коммерческого обеспечивает надежную защиту от РНКазы из окружающей среды. Следует отметить, что другие UTP этикетки могут быть использованы, например, флуоресцеин, хотя по нашему опыту, дигоксигенин-меченного UTP и комбинации анти-антитела дигоксигенин обеспечивает наиболее стабильные результаты.
Ранние протоколы для генерации пробного предположить, что щелочной гидролиз синтезированных зондов должно быть сделано 4 для того, чтобы обеспечить более проникающим зондом. Гидролиз зонда не появляется, чтобы помочь с в процессе гибридизации месте; РНК-зонды большей, чем 500 б.п., как правило, дают отличную сигнал и зондов, которые больше, чем 2 т.п.н. также хорошо работать. Более короткие зонды могут работать, если РНК-мишени в избытке, но длинные зонды даст бЭттер окрашивание. Там, кажется, не быть какого-либо четкого преимущества в использовании щелочной пищеварения, чтобы разбить длинные зонды.
Уход в начальной обработки эмбрионов очень важно. Удаление оплодотворения оболочки является особенно полезным для эмбрионов после закрытия нервной сгиба и до природного штриховкой из оплодотворения оболочки. В удлинении эмбриона внутри оболочки оплодотворения, эмбрион становится скручена и если фиксируется в этом положении, эмбрионы труднее изображения после гибридизация. Однако, если эмбрионы удал ют из оболочки оплодотворения до фиксации, они быстро выправить. Если эмбрионы были повреждены во время удаления мембраны, позволяет им залечить рану, до фиксации, поскольку поврежденных тканей может привести к ложным гибридизация сигнала в месте раны. Если мало, то раны заживают очень быстро, часто в течение нескольких минут 19. Позже шаги могут привести к повреждению эмбрионы дюпередача и таким образом, забота кольцо жидкости необходимо при изменении решения. Нанесенный в ранних стадиях, как правило, означает, что эмбрион будет сильно поврежден к концу процедуры и поврежденные области будут вызывать ложно сигналов на места в виде повреждения. Кроме того, до 30 эмбрионы могут быть проверены в одном флаконе, но с более эмбрионов есть большие шансы фоне высокой развивающихся во время колориметрической реакции, однако увеличение моет в день 3 или мытья ночь может компенсировать это.
В этом протоколе, количество шагов было уменьшено и использование нескольких обычно используемых реагентов была устранена. Следует отметить, что этот протокол исключает несколько шагов, которые используются во многих других протоколов, включая протеиназы К пищеварения и использования уксусного ангидрида, чтобы блокировать положительно заряженные группы. Эти шаги все еще может быть полезно при млекопитающих и птиц эмбрионов, но при помощи Xenopus, устраняя эти шаги не оказывает большого влияния уплотнительноеп окончательные результаты в гибридизация. В нашей лаборатории не определяется, являются ли эти же самые упрощения могут быть применены, чтобы в точке протоколов гибридизации для других видов. Протеиназа K пищеварения, в частности, могут по-прежнему требуется в других эмбрионов, таких как цыпленок или мыши, где проникающий зонд может иметь больше ограничений.
Использование BM фиолетовый подложки является удобным и надежным. Тем не менее, есть ряд других опций, доступных для осаждения, цвет щелочных субстратов, необходимых для локализации РНК-мишени в зачаточном состоянии. В частности, сочетание NBT / BCIP обычно используется 4 и работает хорошо. Некоторые цвета реагенты растворимы в метаноле, и в этом случае, использование метанола, после окрашивания устранит пятна и его следует избегать. Другие цветовые комбинации также могут быть использованы при выполнении дубль в места нахождения имущества. Использование подобной комбинации (NBT / BCIP вместо BM фиолетовый) также было показано,быть очень прочными при использовании эмбрионов мыши 20. Голубой цвет окрашивания и эндогенный пигмент зародыша часто трудно четко различать на снимках. Использование альбиносов эмбрионов также исключить пигмент, но отбеливающий раствор почти так же эффективен и гораздо более удобно, так как не требует технического обслуживания альбиносов взрослых для разведения. Если окрашивание является относительно слабым, сильным отбеливание можно подчеркнуть, что окрашивание. Если окрашивание сильна, оставляя некоторый свет пигмент может быть эффективным контраст, а также помочь с ориентации и постановки эмбриона.
После ночной гибридизации РНК зонда, протокол может отклоняться от строго ручной протокола, изложенной здесь, чтобы использование в гибридизация робота. Использование в гибридизация робота сохраняет почти полный день в качестве второй день и на третий день ручного протокола может быть уменьшено до одного дня, как робот работает в течение ночиd можете сделать все внесения соответствующих изменений температуры. Робот также очень последовательна в своих результатах и позволяет одновременное зондирование многих образцов эффективно. Остается выгодно делать в первый день вручную, как, который позволяет для повторного использования зондов и использование меньших объемов реагента. Единственное существенное неудобство использования робота является первоначальная стоимость инструмента.
Этот протокол рассматриваются некоторые способы эффективного изображения в гибридизация. Это важно сделать так, как большая часть информации может быть потеряна, если изображение неудовлетворительное. Во многих случаях, визуализация в точке, результаты эксперимента требуется то же самое время в качестве начального эксперимента. Некоторые элементы процедуры переменных, таких как степень отбеливания есть элемент личных предпочтений. Другие формирования изображения эффекты могут быть достигнуты путем помещения блюдо на цветной базы. Часто небольшие синий оттенок агара может подчеркнуть глубокое синее окрашивание в сидячейU гибридизации. Проще говоря Петри, содержащие агар, над листом из синей пластмассы, чтобы получить желаемый эффект.
Тем не менее, методы, описанные здесь, обеспечивают основу, с которой изучить возможности визуализации. Эмбрионы могут быть просмотрены либо сброшен (сделать прозрачным, чтобы лучше видеть внутренние структуры) или неубранный (если смотреть, как они появляются при нормальных условиях освещения). Некоторые решения в отношении того, как к изображению эмбрион зависит от сайта выражения. Если выражение на поверхности или вблизи поверхности зародыша, лучше всего изображения эмбрион без очистки. Есть несколько преимуществ использования непогашенные эмбрионов. Процесс очистки эмбрионов требуется много шагов и химические вещества, используемые для очистки эмбрионов трудно справиться. Кроме того, несколько полостей в зародыше позволяют осаждение щелочных субстратов фосфат, которые могут привести к ложным окрашивания полости. В частности, бластоцель ранних эмбрионов и pharynGEAL полости часто показывают окрашивания (рис 4). Это ложное окрашивание не видно в эмбрионах, которые не очищаются. По большей части, даже умеренно глубокий выражение может быть визуализированы в неразрешенных эмбрионов, в том числе мезодермальными тканей, таких как сердце, почки и сомитов, и энтодермальных stuctures таких как щитовидной железы и печени. Перемещение эмбрионов через метанол серии в любом гидрата в PBS для просмотра или положить в 100% метанола для хранения позволяет несколько раундов хранения и визуализации. Хранение метанола позволяет попробовать разные модификации визуализации в течение длительного времени.
Есть некоторые недостатки использования на месте технике гибридизации смотреть на экспрессию генов. Уровни экспрессии не являются строго количественно, хотя сравнение в зародыше и грубых изменений в экспрессии и изменения в размере домен экспрессии обычно очевидны. Как и с другими методами РНК основе, он не обеспечивает какую-либо информацию, как тO белков, кодируемых интересующим геном, который может ограничить интерпретацию результатов. Наконец, часто бывает трудно определить, что может быть фоновое окрашивание по сравнению с истинной домена экспрессии. Это особенно проблема с генами с неизвестной характером экспрессии, которые могут быть широко распространены. Часто, зонд, полученные от смысловой цепи и того же гена используется в качестве контроля для неспецифического окрашивани. Использование контроля цепи смысле может предоставить некоторую информацию о проблеме с реагентами, но это не дает окончательного доказательства того, что окрашивание на основе антисмысловой зонд абсолютно точными. Результаты на месте, как правило, заметно последовательно через эмбриона, когда несколько эмбрионы использовали, и это может быть использовано в качестве меры доверия в виде рисунка окрашивания. Кроме того, различные антисмысловые зонды, полученные от различных частей гена, в частности, нетранслируемых регионов, могут быть использованы, чтобы увидеть, если они дают один и тот же шаблон окрашивания. Если они это сделают,он также обеспечивает уверенность в наблюдаемой картины окрашивания, если оно идентично. Разбавленные зондов также можно использовать при длительном воздействии окрашивающего раствора, чтобы увидеть, если тот же самый образец окрашивание возникает. Одним из факторов, которые обычно вселяет уверенность в шаблоне окрашивание, соответствует ли эта схема в определенной эмбрионального строения. Достаточно в Situs уже было сделано с большим разнообразием генов, что новые паттерны экспрессии, вероятно, относительно редких событий. Большие базы данных в точке изображения были созданы для различных организмов, которые могут быть использованы для сравнения результатов изображения. Для эмбрионов Xenopus, Xenbase (www.xenbase.org) является прекрасным примером того, ресурс, который может быть использован, чтобы понять паттерны экспрессии. Другие модели организмов также имеют схожие, обширные базы данных изображений.
Несмотря на эти потенциальные оговорками, в гибридизация остается мощный и надежный инструмент, который является чрезвычайно полезным дляИзучение органогенеза. Это, вероятно, останется методом выбора для выявления типов клеток и изучение изменения в экспрессии генов доменов в обозримом будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
