Protocol
1. Preparação Embryo
- Se não for feito rotineiramente como parte da cultura de embriões, de-geléia os embriões com 2,5% de cisteína, pH 8,0 antes da fixação 8. Embora não seja absolutamente necessário, é útil para, em seguida, remover manualmente o envelope fertilização antes da fixação utilizando fórceps finos.
- Use pipetas de Pasteur de vidro para transferir os embriões. A pipeta não é grande o suficiente para transferir os embriões assim usar uma caneta de diamante para cortar a pipeta de vidro em um ponto grande o suficiente para pegar um embrião. Eliminar as arestas vivas das pipetas depois do corte, passando rapidamente a ponta de corte através da chama do bico de Bunsen para fundir as bordas afiadas.
NOTA: Cuidado deve ser tomado, como o vidro ainda pode ser quente o suficiente para causar queimaduras, mesmo que parece ter arrefecido por inspeção visual.
- Use pipetas de Pasteur de vidro para transferir os embriões. A pipeta não é grande o suficiente para transferir os embriões assim usar uma caneta de diamante para cortar a pipeta de vidro em um ponto grande o suficiente para pegar um embrião. Eliminar as arestas vivas das pipetas depois do corte, passando rapidamente a ponta de corte através da chama do bico de Bunsen para fundir as bordas afiadas.
- Realize a fixação do embrião nos estágios. Em primeiro lugar, preparar frascos de vidro para utilização na fixação de embriões. Use esses frascos para todas as etapas, incluindo finaisarmazenamento. Use frascos que são claras com uma boa vedação de teflon na tampa, permitindo o acompanhamento dos embriões durante todas as etapas do processo. Rotular os tubos de ensaio com informação experimental apropriado utilizando marcador permanente e, em seguida cobrir a etiqueta com fita adesiva transparente, como mesmo marcador permanente será perdida durante o decurso do processo, devido à utilização de álcoois e outros solventes.
- Use Mempfa para fixar os embriões. Fazer um stock de 8% de paraformaldeído em lotes de 50-100 ml de cada vez. Usar cerca de 75% de H 2 O e necessária de calor para 50-60 ° C, o que é necessário para obter o paraformaldeído em solução.
NOTA: Esta solução é um pouco diferente do que o Memfa utilizado em versões mais antigas protocolo publicado na medida em que utiliza paraformaldeído em vez de formaldeído. - Adicionar 2-3 gotas de NaOH 10N ou até pH é de cerca de 7,5 (o uso de papel de pH para verificar o pH). Paraformaldeído é muito tóxico, portanto, gerar a solução estoque em um exaustor. Uma vez que o paro formaldeído é em solução, filtra-se a solução através de papel Whatman para um recipiente fresco e adicionar H 2 O para o volume final. Se necessário, armazenar a solução de paraformaldeído a 4 ° C durante 1-2 semanas.
- Montar os componentes restantes da solução de fixação Mempfa (Tabela 1). Certifique-se que a concentração de trabalho final de paraformaldeído é de 4%. Guarde todos os componentes da solução de fixação a 4 ° C como ações.
- Usando uma pipeta de vidro de corte, fixar os embriões adicionando os embriões para os frascos de vidro marcados que tenham sido cheias com aproximadamente 3-4 ml de solução Mempfa (Tabela 1). Evitar que fixa mais do que 20-30 embriões por frasco. Adicionar os embriões com um mínimo de transferência de líquido a partir do meio do embrião. Fix embriões em solução Mempfa durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Para estruturas endoderme final realizar o in situs manualmente isoladas do intestino e endoderme derivados 9,10, O que permite uma boa penetração da sonda e também evita a coloração cavidade.
- Armazenar uma solução de metanol a 100% a -20 ° C. Após a fixação paraformaldeído, substituir a solução Mempfa com aproximadamente 4 ml de -20 ° C, 100% de metanol para o armazenamento dos embriões.
- Agitar os frascos, após a adição de metanol para evitar que os embriões se colem ao vidro ou outros embriões. Além disso, certifique-se os frascos são hermeticamente fechado, porque o metanol pode evaporar no congelador ao longo do tempo se solta.
NOTA: Os embriões podem ser armazenados durante pelo menos um ano, e mais provável, no metanol, antes de corar com nenhuma perda de qualidade na hibridização in situ.
- Use Mempfa para fixar os embriões. Fazer um stock de 8% de paraformaldeído em lotes de 50-100 ml de cada vez. Usar cerca de 75% de H 2 O e necessária de calor para 50-60 ° C, o que é necessário para obter o paraformaldeído em solução.
2. Preparação Probe
- Use 1-2 mg de DNA molde para fazer as sondas marcadas com digoxigenina. Cortar o plasmídeo contendo a sequência de ADN apropriada na extremidade 5 'do gene de interesse com uma enzima de restrição adequada para that vector para gerar sondas anti-sentido.
NOTA: O plasmídeo deve ter um local de ligação de polimerase de ARN adequado (por exemplo, T7, T3, ou SP6). - Permitir que o ADN, a água, de mistura de NTP e tampão de polimerase aquecer até à temperatura ambiente, antes de montar a reacção de síntese da sonda. Adicionar os componentes da reacção de síntese de ARN a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml na ordem listada na Tabela 2. Ajustar o volume de água adicionado para levar o volume total da reacção de síntese da sonda para 20 ul. Montar a reacção à temperatura ambiente, porque os componentes do tampão de polimerase pode precipitar o ADN molde quando em concentrações elevadas e frio.
- Incubar a reacção de transcrição durante 2 horas a 37 ° C.
NOTA: As incubações de pouco mais de duas horas leva à inexistência de efeitos adversos, mas também mostram pouco maior rendimento. Se incubada durante uma hora, o rendimento será reduzido, mas ainda suficiente para uma boa sonda.- Enquanto espera para a reacção de transcrição para acabamento, fazer um gel de agarose que vai ser utilizado para testar a qualidade da sonda. Melt 1 ug de agarose em 100 ml de tampão 1 x TAE (ver Tabela 1) por aquecimento da solução até ao ponto de ebulição. Remover a solução de calor, quando o pó de agarose estar completamente dissolvida.
- Adicionar 2 mL de brometo de etídio solução-mãe (10 mg / ml) até cerca de 100 ml de gel de agarose, quando a agarose foi arrefecida até cerca de 60 ° C para permitir a visualização de ARN sob luz ultravioleta (UV).
NOTA: esta solução de gel de agarose pode ser mantido numa incubadora a 60 ° C de modo que os géis futuros pode ser vertida sem derreter repetido. Tome cuidado ao manusear o brometo de etídio, devido à toxicidade potencial.
- Adicionar 1 mL DNAseI (grau livre de RNAse) para a reacção de transcrição, após a incubação de 2 horas e incubar durante mais 10 min a 37 ° C para eliminar o ADN molde.
- Retirar 1 mL da mistura de reacção paraverificar a 1% de gel de agarose-TAE e para o resto (20 mL) adicionar 80 ul de SDS a 1% em tampão TE (Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM), 10 ul de 5M de NH 4 etilo, e 220 ul etanol de frio. Vortex a mistura vigorosamente e reserve em gelo até os resultados da verificação de qualidade RNA são conhecidas.
- Executar os 1 ul de RNA removidos antes da precipitação sobre o gel a 1% de agarose-TAE. Para facilitar o carregamento do gel, adicionar 4-5 mL de água e 1 ul de corante de carregamento padrão para o RNA. Ver o RNA no gel utilizando um transiluminador de luz UV a fim de verificar a qualidade da sonda (ver discussão).
- Precipitar o RNA restante que foi posto de lado no gelo na etapa 2.5, girando em uma microcentrífuga a toda a velocidade para 10 a 15 min. Decantar o sobrenadante com uma pipeta de vidro retirado e deixa-se secar brevemente.
- Ressuspender a sonda com 1 ml de tampão de hibridação de ARN (Quadro 1) no tubo eppendorf. Vortex e briefly aquecer o tubo a 37 ° C e novamente vórtice. Transferir a solução de sonda para um parafuso 15 ml tampa do tubo de poliestireno e enche-se a 7-10 ml com tampão de hibridação de ARN. Nota: A sonda pode ser mais diluída (a 10 vezes mais diluição ainda pode trabalhar), muitas vezes resultando em baixa de fundo, mas as reações de coloração também vai demorar mais tempo.
3. Hibridação in situ
- Toma os embriões que foram armazenadas em metanol -20 ° C e deixa-se aquecer até à temperatura ambiente. Realize todo o procedimento nos frascos de vidro. Se diferentes embriões de um grupo vão ser olhado por diferentes sondas, mantê-los em um único frasco até pouco antes das sondas são adicionados para reduzir a variabilidade e de trabalho no primeiro dia.
- Reidratar os embriões por meio de uma série de metanol como indicado na Tabela 3 (ver Tabela 1 para as receitas de lavagem) em preparação para a adição da sonda. Agite suavemente o EmbryOS após cada alteração para garantir que eles não estão aderindo às paredes ou outro, e balançar os embriões montando os frascos em um nutator. Ao transferir os líquidos, verificar o interior das tampas para garantir que os embriões não foram presos lá.
- Uma vez na solução de sonda, hibridar os embriões durante a noite, como descrito na Tabela 3.
- Remover a solução de sonda. Salve a sonda usada por armazenar em um 15 ml parafuso tubo de poliestireno cap, marcado com a data eo número de vezes que a sonda tem sido usado, a -20 ° C.
NOTA: A mesma sonda pode ser reutilizado muitas vezes, para posterior hibridações in situ até que as reações colorimétricos começam a tomar um tempo anormalmente longo para chegar a intensidade desejada.- Uma vez que a sonda é removida, preparar os embriões para coloração de anticorpos contra a sonda através de uma série de lavagens descritos na Tabela 4. Mudar a temperatura, conforme necessário (Tabela 4) por t movendoele nutator, com frascos de embriões em anexo, diretamente em fornos de hibridização que estão definidos para a temperatura adequada.
- Perfaz-se o volume apropriado do MAB + HTSS + BR + anti-Dig anticorpo (Quadro 4) no momento em que os embriões são incubadas no MAB + HTSS + BR solução de bloqueio de modo a que o anticorpo é bloqueada antes da adição ao embriões. Faça as soluções de bloqueio fresco no dia da utilização.
- Remover a solução de anticorpos e começar lavagens como descrito na Tabela 5 a seguir à incubação durante a noite com anticorpo. Executar, pelo menos, doze lavagens de 30 min de modo a preparar-se para a coloração com o substrato de fosfatase alcalina e reduzir o fundo tanto quanto possível. Use um tampão MAB ou solução de TBT (Tabela 1) para as etapas de lavagem.
NOTA: solução TBT é TTW que tem de 2 mg / ml de BSA adicionado.- Substituir a última solução de lavagem com o substrato de fosfatase alcalina Roxo BM. Execute as reac coloraçãoção quer à temperatura ambiente ou a 37 ° C.
NOTA: A coloração é mais rápida a 37 ° C, mas se for deixado durante a noite, o fundo inaceitável coloração pode muitas vezes ser um resultado. As reações de coloração, muitas vezes, exigem coloração durante a noite e a temperatura ambiente é mais seguro para isso. - Se ainda mais a coloração é necessária e a solução de púrpura BM está a assumir uma cor azul, substitua a solução de coloração com frescos BM roxo e colocar os tubos em 37 ° C. Se o mRNA alvo é muito abundante, colocar os embriões na solução de coloração, a 4 ° C durante a noite e, em seguida, mover os embriões à temperatura ambiente ou a 37 ° C para permitir um melhor acompanhamento da reação de coloração.
- Monitorar novas reações com cuidado, pois o tempo para resultado final varia consideravelmente entre os diferentes RNAs alvo. Para consistência, parar a reacção de coloração (ver 3.4), quando não há novos locais de expressão resultante com mais tempo de incubação. É importante notar que se a hibridização in situ está a ser utilizado como um ensaiopara experimentos olhando para diferentes grupos de tratamento, usar o mesmo tempo para reações de cor entre embriões de tratamento e controle.
- Substituir a última solução de lavagem com o substrato de fosfatase alcalina Roxo BM. Execute as reac coloraçãoção quer à temperatura ambiente ou a 37 ° C.
- Parar a reacção de coloração e preparar os embriões para o armazenamento e gravação de imagem, alterando os líquidos como indicado na Tabela 6. Não agitar os embriões nesta fase devido à remoção de mancha pode ser visualizado como coloração púrpura do metanol em torno dos embriões.
NOTA: Muitas vezes os embriões têm uma coloração azul clara a partir da solução de coloração e o metanol frio pode remover, pelo menos parcialmente, que, apesar de este não é suficiente para remover a coloração de fundo pesado ou cavidade. Metanol frio refere-se a metanol, que é mantido num congelador a -20 ° C.- Reidratar os embriões e corrigir a mancha com Mempfa (Tabela 6). Uma vez fixo, remover a Mempfa e lavar os embriões com 25% de metanol.
- Remover o metanol a 25% e adicionar a solução de branqueamento se a remoção de pigmento endógenoé necessário. Tome cuidado ao manipular a solução branqueadora, pois pode causar queimaduras. Observar o branqueamento de perto como acontece relativamente com rapidez e o grau de branqueamento pode ser variado para diferentes efeitos (Figura 2).
- Desidratar embriões através de uma série de metanol a 100% de metanol para o armazenamento a longo prazo na sequência de branqueamento, ou para transferir PBS durante o armazenamento a curto prazo e de imagem subsequente (ver Tabela 6).
4. Imagem Embriões
- Uma vez que o embrião tenha concluído o processo de coloração, a imagem do embrião para que as informações sobre onde o gene de interesse é expressa é capturada por um público mais vasto. Use 1% agarose como pano de fundo para visualizar os embriões não apurados.
NOTA: A agarose dá um fundo azul / cinzento que contrasta com o embrião e a cor azul da reacção de coloração. Ele também ajuda a difundir sombras que distraem e reflexões que desviam a atenção do embrião.- Adicionar agarose a água e, em seguida, deixe ferver até que a agarose é em solução e, em seguida, deixe esfriar até 50 antes de derramar em placa de Petri. Tal como acontece com a solução de gel de TAE, armazenar a solução de agarose em 55 ° C incubadora para usos múltiplos. Verter a agarose até uma profundidade de cerca de 2 mm na placa de Petri. Se necessário, ajustar a profundidade de agarose para se obter um matiz ligeiramente diferente do fundo.
- Após re-hidratação do armazenamento em metanol a uma solução aquosa (PBS ou TTW), usando uma série de metanol, colocar os embriões numa placa de Petri com a base de agarose (ver Tabela 6). Manter a solução limpa e, se necessário, usar a filtragem simples para eliminar as partículas pequenas que podem prejudicar o fundo limpo de boas imagens.
- Para os embriões de imagem vistas alternativas, tais como a partir do lado ventral, cortar canais finos na agarose para encaixar o embrião utilizando um fórceps fino e colocar os embriões nos canais para orientação (Figura 3 NOTA: A maioria das fases têm uma posição característica que assumiria quando é colocada em solução. Por exemplo, os embriões blastula estágios tendem a se sentar animais para cima. Uma vez que os embriões começam a alongar, eles colocam do lado deles.
- Use a fonte de luz de fibra óptica para iluminar o embrião de um ângulo raso, criando sombras sobre o embrião, que conferem profundidade à imagem e ajudar a discernir estruturas superficiais. Porque branqueamento pode eliminar pigmento que fornece pontos de referência úteis, use sombra para os embriões fortemente branqueadas.
- Limpar os embriões para coloração de imagem que é profundamente dentro do embrião, tais como nas notocorda, pulmão, ou regiões do cérebro, (Figura 4). Para conseguir isso, colocar os embriões através de uma série de metanol até que em 100% de metanol.
- Após a imersão completa em metanol, transferir os embriões para uma solução de uma parte de álcool benzílico e duas partes de benzilo sernzoate (BABB). Os embriões inicialmente flutuar na superfície, mas como o metanol mistura com o BABB, eles irão afundar-se no BABB. Execute cada passo lidar com BABB em frascos de vidro ou pratos; BABB vai derreter qualquer plástico ou pintura.
- Depois de limpo, ver os embriões com luz transmitida vindo de baixo do embrião. Ajustar a intensidade da luz, bem como o ângulo a partir de baixo para melhorar o contraste e proporcionar a melhor cor.
- Ao ver embriões desmatadas levantar a placa de Petri de vidro para fora da base. Para fazer isso, simplesmente usando duas outras tampas prato petri para elevá-la para que a região do prato com embriões é elevado.
NOTA: Isto tem a vantagem de ter a base fora de foco e eliminar efeitos de distração de imperfeições ou manchas na base do microscópio que pode interferir com a imagem.
5. Faça duplo de hibridização in situ
- Para visualizar simultaneamente o padrão de expressão two diferentes genes de um único embrião, sintetizar duas sondas, uma para cada um dos diferentes genes. Sintetizar uma sonda utilizando DIG-UTP-11 como um rótulo como descrito acima. Dilui-se o produto da reacção de transcrição de ARN em tampão de hibridação, para se obter uma sonda de 3x mais concentrada do que a utilizada para o único hibridações in situ.
- Sintetizar a outra sonda de interesse, utilizando o mesmo protocolo como para DIG rotulados sondado excepto que fluoresceína-12-UTP deve ser substituído por DIG-11-UTP. Dilui-se o produto da reacção de transcrição de ARN em tampão de hibridação, para se obter uma sonda de 3x mais concentrada do que a utilizada para o único hibridações in situ.
- Misturar as duas sondas concentradas em uma proporção de 1: 1. Para melhores resultados, utilizar a sonda marcada com fluoresceína para o gene que mostra a expressão mais forte no único no protocolo de hibridação in situ.
- Use o mesmo protocolo na hibridização in situ descrito para única in situ </ Em> hibridações, excepto o uso da sonda dupla (contendo a sonda de 1,5x mistura concentrada de sondas marcadas com digoxigenina e marcados com fluoresceína) no final do primeiro dia em lugar de uma única sonda de hibridação in situ.
- Seguir o protocolo de hibridação único no segundo dia do protocolo duplo em hibridização in situ, excepto fragmentos utilização anti-fluoresceína-AP Fab a uma diluição de 1: 4000 no lugar de fragmentos anti-DIG-AP Fab. Lavar o excesso de anticorpos a partir do embrião como no single no protocolo situ e realizar a primeira reação de cor utilizando o substrato BM-Purple AP.
- Seguindo a reacção de cor primeiro, inactivar o anticorpo fluoresceína em glicina 0,1 M pH 2,0 durante 40 min, seguido de cinco lavagens em dez mínimo de MAB. Bloqueie os embriões no MAB + HTSS + BR por 90 min. Adicionar o anticorpo anti-DIG a uma diluição de 1: 2.000 em MAB + HTSS + BR e incubar a 4 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, lavar os embriões thoroughly em MAB (12 lavagens de 30 min) para remover o excesso de anticorpo.
- Lavar os embriões durante 10 min em tampão de AP (Tabela 1) e, em seguida, cora com BCIP (0,5 mg / ml em tampão de AP).
NOTA: O em combinação situ deve dar uma coloração azul-púrpura escuro para a primeira reacção de cor e uma reacção de cor azul claro para a segunda (Figura 5). - Parar a reacção de cor final, através da remoção do tampão de AP e lavar três vezes com MAB. Corrigir os embriões com Mempfa para 10 min. Lavar os embriões com 5 lavagens rápidas em MAB ou TBT.
- Com esta combinação de cor, o uso de metanol nos tratamentos pós de coloração já não é possível, uma vez que irá eliminar a cor BCIP sozinho. Armazenar os embriões após coloração e fixação em PBS com azida de sódio a 0,02%. Intensidade de coloração pode ser fraco com duplo em situs. Se isto é um problema, reduzir as lavagens de quatro, cada duração de 2 h.
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Representative Results
A utilização de sondas específicas de tecido podem fornecer informações de destaque no que diz respeito ao estado de desenvolvimento para órgãos específicos. Nos exemplos a seguir, a fase do embrião é baseado na tabela estadiamento Nieuwkoop e Faber a 11. Se alguém usa genes formulário sondas expressas após a diferenciação, troponina I cardíaca na fase 28-30, por exemplo (Figura 1C), a presença ou o tamanho de um órgão diferenciado pode ser avaliado em qualquer diferenciação fase post. Anos atrás, os embriologistas foram capazes de fazer essa análise com base em notável conhecimento da histologia do embrião 12,13, mas que a experiência foi em grande parte perdido para a atual geração de embriologistas. Embora, a perda desta experiência pode ser considerado lamentável, a fiabilidade e facilidade de utilização de técnicas de hibridização in situ torna a identificação de tecidos específicos disponíveis para qualquer investigador. Os tecidos que são relativamente discretos, tele incubação glândula na fase embrionária 25, por exemplo, (Figura 1A), pode ser nitidamente marcados utilizando no situs sem a necessidade de anticorpos específicos ou técnicas histológicas (Figura 1C). Além disso, a utilização de toda montagem no situs permite visualizar o órgão inteiro no contexto de todo o embrião em vez de confiar em inferências a partir das secções histológicas (Figura 2). Mesmo os tecidos que são profundas dentro do embrião, incluindo a haste óptica (Figura 4) pode ser facilmente visto e a utilização do embrião pode fornecer compensação delineação nítida dos limites de órgãos.
Branqueamento de embriões para remover o pigmento endógeno utilizando soluções de peróxido eliminou grande parte da exigência do uso de embriões albinos que não possuem pigmentos. Branqueamento em tempos diferentes pode ser útil. Por exemplo, se a mancha é forte, um branqueamento mais leve que permite alguma pigmentação para ser visto pode ser útil, pois todosows para uma melhor orientação e estadiamento do embrião (Figura 2A). No entanto, se a mancha é uma área em que existem níveis elevados de pigmentação, tais como o rim (Figura 2B), próximo a eliminação completa do pigmento por mais tempo de incubação na solução de branqueamento dá um melhor resultado.
Os embriões tendem a ocupar posições específicas, quando em solução. Após neurulação, eles tendem a colocar o plano em seus lados. Isto é muito bem para imagens de flanco (Figura 2B), mas pode ser um problema com outras áreas. A utilização de uma base de agarose permite cortar os canais em que a agarose pode ser usado para orientar os embriões. Por exemplo, precursores do sangue estão localizadas ao lado ventral do embrião (figura 2A) e a extensão completa da coloração é difícil de observar. Posicionamento do embrião em um canal com o lado ventral para cima, em seguida, permite a visualização completa do que o padrão de expressão do gene (Figura 3A). O uso de dupla hibridização in situ pode mostrar a relação entre dois padrões de expressão de genes no interior de um único organismo (Figura 5) eliminar a necessidade de comparação entre diferentes embriões que podem ter pequenas diferenças na morfologia. Talvez o mais importante, a utilização de hibridação in situ dá a possibilidade de marcar claramente células anteriores para limpar diferenciação histológica com base na expressão de genes que são expressos em células progenitoras iniciais de uma linhagem, tais como PAX2 que é expressa em muitos tecidos do embrião precoce, antes da diferenciação (Figura 4A). A capacidade de identificar progenitores e tecidos que não são claramente distinguidos com base na histologia, como precursores de células mielóides (Figura 1B), tem permitido aos pesquisadores fazer perguntas muito mais detalhadas sobre o estado de desenvolvimento de um órgão e também para avaliar os resultados das experimental manipulation concebidos para causar diferenciação ectópica de um tecido.
Figura 1:. Exemplos de todo o monte de hibridação in situ em embriões de Xenopus A coloração azul a partir de uma experiência em hibridização in situ pode delinear claramente o desenvolvimento de estruturas do embrião Xenopus (A) Uma visão anterior de um embrião de estágio 26 destacando a glândula eclosão. como demarcado pela expressão de uvs.2 14 (B) uma vista ventral de um embriões que mostram a localização de células mielóides início na fase 20, utilizando a expressão da mieloperoxidase 15 como um marcador (C) A cardíaca precoce na fase 28.. - 30 é visualizado pela expressão de troponina I 16. Uma vantagem clara deste método é que todosesses padrões de expressão gênica foram visualizadas utilizando sondas diferentes, mas o protocolo utilizado é idêntico em todos os casos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferentes níveis de branqueamento pode ser usado para visualizar a coloração no embrião (A) Esta coloração azul ao longo da parte inferior desta embrião mostra a expressão de hemoglobina nas ilhas de sangue ventrais a cerca de fase 36. Esta é uma região do. embrião que está apenas ligeiramente pigmentadas e, assim, o embrião não foi branqueado por um longo período de tempo, como pode ser visto pelo pigmento de cor acastanhada no olho e ao longo do flanco do embrião. Ser capaz de ver a pigmentação permite uma melhor visualização da fase de embrião. Se a coloração for em uma região com maior pigmentação natural, tal como o sistema nervoso e o flanco do embrião, maior branqueamento vai ajudar a visualizar in situ visto como em B. (B) aqui a expressão de PAX8 17 no rim formando , duto pronephric e hindbrain é melhor visualizado após o clareamento removeu quase todos pigmento endógeno. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Manipulação da base de agarose pode ajudar com orientação dos embriões regiões específicas de imagem do embrião pode ser difícil, porque eles tendem a ocupar posições específicas no prato (A) No girino encena o embrião vai mentir sobre seu lado.. . Por corteting uma multa canal no agarose (setas pretas) o embrião pode ser visto do lado ventral, aqui mostrando a expressão de hemoglobina no estágio 36, com estabilidade suficiente para capturar uma boa imagem. (B) Este ponto de vista ventral da expressão hand1 no estádio 20 descreve o lateral, mesoderme 6. O embrião é colocado em um pequeno buraco que estabilizou a sua posição com o lado ventral para cima. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Os órgãos internos podem ser vistos em ambos os embriões opacos, não apurados e em apuradas em um embrião uncleared coradas para PAX2 na fase 34 (A), a haste óptica (seta amarela) pode ser visualizada de forma relativamente fácilcomo pode a coloração para baixo do tubo neural. No entanto, os detalhes não são nítidas. Ao apurar o embrião (B) os limites de sites de expressão, incluindo a haste óptica (seta amarela) são mais nítidas. O grau de compensação é mostrada pela capacidade de ambos os olhos ver nesta embrião apagada. Observe também que alguma coloração acumulou nas cavidades internas (seta roxa), um problema comum ao visualizar embriões desmatadas.
Figura 5:. Um representante dupla de hibridação in situ em uma embrião de Xenopus A expressão do marcador de placa lateral, hand1, é visualizada por coloração com azul da luz no palco 26. Expressão de ETV2 dentro da vasculatura em desenvolvimento é visualizado por mancha púrpura escura azul. Expressão de hand1 é geralmente muito intensa e, portanto, utilizou-se para o tele mais fraco sonda marcada com fluoresceína e combinação BCIP. O utilizou a sonda marcada com digoxigenina e combinação BM-roxo para a expressão ETV2 mais fraca.
| Nome | Concentração final | Montante / 100 ml |
| Mempfa | 1 mM de MgSO4 | 100 ul de 1 M MgSO4 |
| (Armazenar a 4 ° C) | EGTA 2 mM, pH 8,0 | 10 ml de 20 mM de EGTA, pH 8,0 |
| MOPS 0,1 M, pH 7,5 | 10 ml de 1 M MOPS, pH 7,5 | |
| Paraformaldeído a 4%, pH 7,5 | 50 ml de 8% paraformaldeido, pH 7,5 | |
| TTW | Tris 50 mM, pH 7,4 | 5 ml de 1 M de Tris, pH 7,4 |
| 200 mM de NaCl | 4 ml de NaCl 5 M | |
| 0,1% de Tween 20 | 100 ul de Tween 20 | |
| Solução de Denhardt 100X | 2% de BSA | 2 g de BSA |
| (Filtrar através de filtro de 0,2 um, | 2% PVP-40 | 2 g de PVP-40 |
| armazenar a -20 ° C) | 2% de Ficoll 400 | 2 g de Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M de NaCl | 17,5 g de NaCl |
| 300 mM de citrato trissódico | 8,8 g Citrato trissódico | |
| Tampão de Hibridização de ARN | 50% de formamida | 50 ml de 100% de formamida |
| (Armazenar a 4 ° C) | 5x SSC | 25 ml de 20x SSC |
| 1 mg / ml de ARN de levedura | 4 ml de 1 mg / ml de ARN de levedura dissolvidos em 50% de formamida | |
| Solução de Denhardt 1X | 1 ml de solução de Denhardt 100X | |
| 0,1% de Tween 20 | 100 ul de Tween 20 | |
| EDTA 5 mM, pH 8,0 | 1 ml de 0,5 M de EDTA, pH 8,0 | |
| MAB | 100 Ácido Maleic mM | 1,16 g de Ácido Maleico |
| (PH 7,5, armazenar a 4 ° C) | 150 mM de NaCl | 0,88 g de NaCl |
| MAB + HTSS + BR | 100 Ácido Maleic mM | 96 ml de MAB |
| 4% de Soro de tratamento térmico dos carneiros | 4 ml de soro dos carneiros tratada pelo calor (um tratamento térmico a 55 ° C durante 30 min e aliquotado) | |
| 2% de Reagente de Bloqueio | 2 g de reagente de bloqueio Roche | |
| MAB + HTSS + BR + anticorpo anti-Dig | 100 Ácido Maleic mM | 96 ml de MAB |
| 4% Calor Treated soro de ovelha | 4 ml de tratada pelo calor Sheep Serum | |
| 2% de Reagente de Bloqueio | 2 g de reagente de bloqueio Roche | |
| 1: 10.000 anti-DIG-AP, fragmentos Fab de anticorpos | 1,5 ul de anti-digoxigenina-AP, fragmentos Fab de anticorpos | |
| Fosfatase alcalina (AP) Tampão | Tris 100 mM, pH 9,5 | 10 ml de 1 M de Tris, pH 9,5 |
| 50 mM de MgCl2 | 5 ml de 1 M MgCl2 | |
| 100 mM de NaCl | 2,5 mL de NaCl 4 M. | |
| 0,1% de Tween 20 | 100 ul de Tween 20 | |
| Solução de branqueamento | 0,3% H 2 O 2 | 3,34 ml de 30% de H 2 O 2 |
| 5% de formamida | 5 ml de 100% de formamida | |
| 0,5% SSC | 2,5 ml de 20x SSC | |
| Solução Clearing | Álcool benzílico 1/3 | 33 ml |
| 2/3 benzílico Benzoato | 67 ml |
Quadro 1: Receitas Solução
| Nome | Quantidade |
| Dig-NTP Mix | 5 ul de 20 mM de CTP |
| (40 ul de reacção) | 5 ul de 20 mM de GTP |
| 5 ul de ATP 20 mM | |
| 3,25 ul de 20 mM de UTP | |
| 3,5 ul de 10 mM de Dig-11-UTP | |
| 18,25 ul destilada, água autoclavada | |
| Probe Synthesis | x ul de ADN molde(Depende da concentração) |
| (20 ul de reacção) | x ul de água destilada e autoclavada |
| 4 l de mix Dig-NTP | |
| 0,5 ul de inibidor de ARNase | |
| 2 ul de tampão de polimerase de ARN 10X | |
| 2 ul de ARN-polimerase |
Tabela 2: Síntese de sondas Receitas
| Nome do reagente | Volume aproximado | Duração | Temperatura |
| 100% Metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 75% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 50% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| TTW | 2 ml | 10 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| TTW | 2 ml | 10 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| TTW | 2 ml | 10 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| Pré-quente RNA Tampão de Hibridização e Probe a 65 ° C | |||
| TTW | 4 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| TTW | 4 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| Tampão de Hibridização de ARN | 2 ml | 10 min, de balanço | Quarto Temperaturae |
| Pré-aqueceu-se ARN Tampão de Hibridização | 2 ml | 1 hr, balançando | 65 ° C |
| Solução sonda | 1 mL | Durante a noite, de balanço | 65 ° C |
Tabela 3: Etapas para o primeiro dia de Hibridização In Situ Protocol (cerca de 3 hr total)
| Nome do reagente | Volume aproximado | Duração | Temperatura | ||||
| Pré-quente RNA Tampão de Hibridização e 02.x SSC a 65 ° C e 2 x SSC a 37 ° C | |||||||
| Retorno solução sonda para tubo para uso repetido | |||||||
| Tampão de Hibridização de ARN | 2 ml | 10 min, de balanço | 65 ° C | 2X SSC | 2 ml | 20 min, de balanço | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 ml | 20 min, de balanço | 37 ° C | ||||
| 0,2x SSC | 4 ml | 1 hr, balançando | 65 ° C | ||||
| 0,2x SSC | 4 ml | 1 hr, balançando | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1,5 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente | ||||
| MAB + HTSS + BR + anticorpo anti-DIG | 1,5 ml | Durante a noite, de balanço | 4 ° C |
Tabela 4: Etapas para o segundo dia de Hibridização In Situ Protocol (cerca de 4 horas total)
| Nome do reagente | Volume aproximado | Duração | Temperatura |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| MAB | 4 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| BM roxo AP Substrato | 500-750 ul | Durante a noite, de balanço (ver texto) | Temperatura quarto / 37 ° C (ver texto) |
Tabela 5: Etapas para o terceiro dia de Hibridização In Situ Protocol (cerca de 7 hr)
| Nome do reagente | Volume aproximado | Duração | Temperatura |
| 25% de metanol | 2 ml 5 min, balançando | Temperatura Ambiente | |
| 50% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 75% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 100% de metanol (frio) | 2 ml | 20 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| 100% de metanol (frio) | 2 ml | Varia, nenhum balanço | Temperatura Ambiente |
| 75% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 50% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| Mempfa | 2 ml | 30 min, de balanço | Temperatura Ambiente |
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| Solução de branqueamento | 4 ml | 40 min-3 hr, balançando | Temperatura quarto / 37 ° C (ver texto) |
| Armazenagem de embriões | |||
| 25% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 50% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 75% de metanol | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 100% Metanol | 4 ml | Armazenar a -20 ° C | |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, balançando | Temperatura Ambiente |
Tabela 6: Passos para parar Hibridização In Situ, branqueamento e armazenagem de embriões
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Discussion
A capacidade para utilizar em hibridação in situ para visualizar o padrão de expressão de genes específicos é o método mais vulgarmente usado para identificar os órgãos ou tipos de células específicas do embrião de Xenopus. Isto é por causa de diversas vantagens oferecidas por esta técnica. A expressão de um gene pode identificar estruturas específicas bem antes de qualquer sinal histológicas de diferenciação, tais como o caso para a expressão em Nkx2.5 os progenitores do coração antes de qualquer demarcação clara destas células 18. Depois de todos os reagentes estão na mão, ele também é muito rentável. Geração de muitas sondas individuais, que podem ser reutilizados de forma eficaz, é possível, com pouco mais de tempo e custo de investimento que não seja a obtenção dos plasmídeos que codificam os genes de interesse. Em nossa experiência, as sondas podem ser reutilizados por anos com pouca perda na atividade, apesar das pequenas diluições inevitáveis que vêm com cada utilização. Finalmente, há pouco requi otimizaçãovermelho quando utilizando diferentes sondas.
A qualidade da síntese sonda é um fator chave para o sucesso do protocolo. Há muitas maneiras de verificar a qualidade da sonda de RNA, mas simplesmente executando a sonda de RNA em um gel TAE é um método rápido e fácil, que é bastante confiável. Rotineiramente usar brometo de etídio para denegrir a RNA e que requer um tratamento especial e eliminação dos géis pela maioria das instituições. Alternativas não-tóxicas estão disponíveis comercialmente, embora não tenhamos comparado especificamente os de sondas visualizando. A sonda deve ser executado como uma única banda embora possa parecer um pouco confusa em relação ao DNA em um gel TAE. Uma estimativa da quantidade de ARN pode ser obtida: uma boa reacção terá cerca de 1 ug / ul de ARN. Uma banda facilmente visualizado irá representar, pelo menos, 0,5 mg de RNA e uma banda brilhante representará mais de 1 pg. Embora claramente não completamente precisa e exige alguma experiência, quantificação baseada no gel é rapid e a robustez do procedimento em situ permite que ele funcione bem. Se houver preocupação com repetibilidade, pode-se facilmente usar absorção de UV para quantificar uma pequena quantidade da reação de transcrição, embora não se tenha encontrado esta a ser uma grande preocupação. Finalmente, o gel permite ver se o ADN molde foi eliminado. Se o gel indica que não existe RNA, as duas explicações mais prováveis são um molde de ADN ou mau que o tampão de transcrição não está a funcionar bem. O aquecimento do tampão de transcrição a 37 ° C e mistura antes da utilização, ou a adição de 1 ul de DTT 100 mM fresco para a reacção de transcrição pode ocasionalmente ajudar com o último. Um componente importante do tampão de reacção de transcrição é espermidina e pode precipitar o molde de ADN a baixas temperaturas tornando o aquecimento do tampão importante. DTT no tampão também pode precipitar significativamente inibir a reacção. Se um precipitado é visto no buffer, aquecer a solução evortex vigorosamente. Não há necessidade de tomar quaisquer precauções incomuns, como o tratamento da água com DEPC ou autoclavagem dicas e tubos, para evitar que a atividade RNAse. A presença do inibidor de ribonuclease comercial proporciona uma protecção considerável contra RNAses do ambiente. Note-se que outros rótulos UTP pode ser utilizado, tal como fluoresceína, embora na nossa experiência, a marcada com digoxigenina UTP e combinação de anticorpo anti-digoxigenina fornece os resultados mais consistentes.
Os primeiros protocolos para geração sonda sugerem que a hidrólise alcalina das sondas sintetizadas deve ser feita 4, a fim de permitir uma maior penetração da sonda. A hidrólise da sonda não parece ajudar com o processo de hibridação in situ; Sondas de RNA de mais de 500 pb, geralmente, dão um sinal excelente e sondas que são mais de 2 kb de comprimento também funcionam bem. Sondas mais curtas podem funcionar se o RNA alvo é abundante, mas sondas maiores dará bcoloração Etter. Não parece haver qualquer vantagem clara em usar a digestão alcalina para quebrar sondas mais longos.
Cuidados no tratamento inicial dos embriões é muito importante. A remoção do envelope fertilização é particularmente útil para os embriões após o encerramento vezes neural e antes da eclosão natural, fora do envelope fertilização. Durante o alongamento do embrião dentro do envelope a fertilização, o embrião fica enrolado e se fixa nessa posição, os embriões são mais difíceis de imagem depois da hibridação in situ. No entanto, se os embriões são retirados do envelope fertilização antes da fixação, eles rapidamente endireitar. Se os embriões são danificados durante a remoção da membrana, para permitir que eles curar a ferida antes da fixação porque o tecido danificado pode resultar numa falsa no sinal de hibridação in situ no local da ferida. Se pequeno, as feridas cicatrizam muito rapidamente, muitas vezes dentro de minutos 19. Etapas posteriores também podem danificar os embriões dutransferência e por isso o cuidado líquido anel é necessária quando se muda soluções. Danos nas etapas iniciais geralmente significa que o embrião vai ser muito danificado até o final do procedimento e regiões danificadas fará falso em sinais in situ com a visão de danos. Além disso, até 30 embriões podem ser sondado em um único frasco, mas com mais embriões há maiores chances de fundo elevado desenvolvimento durante a reação colorimétrica, porém aumentando as lavagens no dia 3 ou lavar roupa durante a noite pode compensar isso.
Neste protocolo, o número de passos tenha sido reduzido e a utilização de vários reagentes vulgarmente utilizados foi eliminado. Note-se que este protocolo elimina vários passos que são usados em muitos outros protocolos, incluindo uma digestão com proteinase K e o uso de anidrido acético, para bloquear os grupos carregados positivamente. Esses passos ainda pode ser útil quando se olha para os embriões de mamíferos e aves, mas em usar Xenopus, eliminando os passos tem pouco impacto on os resultados finais da hibridação in situ. O nosso laboratório não foi determinado se estes mesmos simplificações podem ser aplicadas a protocolos de hibridização in situ para as outras espécies. Digestão Proteinase K, em particular, poderá ainda ser exigida em outros embriões, como pinto ou mouse onde a penetração da sonda pode ter maiores limitações.
O uso de substrato BM púrpura é conveniente e fiável. No entanto, há um número de outras opções disponíveis para os precipitantes, substratos alcalinas cor que são necessários para localizar o alvo de ARN no embrião. Em particular, uma combinação de NBT / BCIP é comumente utilizado e 4 funciona bem. Alguns reagentes de cor são solúveis em metanol, no caso em que, o uso de metanol, após coloração vai eliminar a mancha e deve ser evitada. Outras combinações de cores também pode ser usado durante a execução de casal em situs. Também foi demonstrado o uso de uma combinação similar (NBT / BCIP em vez de BM roxo)a ser muito robusto quando o uso de embriões de rato 20. A cor azul da coloração e do pigmento endógeno do embrião são muitas vezes difíceis de distinguir claramente nas imagens. Uso de embriões albinos também vai eliminar pigmento, mas a solução de branqueamento é quase tão eficaz e é muito mais conveniente, que não requer a manutenção de adultos albinos para reprodução. Se a coloração é relativamente fraco, forte sangramento pode enfatizar que a coloração. Se a coloração é forte, deixando um pouco de luz pigmento pode ser um contraste eficaz e também ajudar com orientação e preparo do embrião.
Após a hibridação durante a noite em sonda de RNA, o protocolo pode desviar-se do protocolo estritamente manual do descrito aqui para a utilização de uma hibridação in situ do robô. O uso da hibridação in situ robô salva quase um dia completo como o Dia Dois e Três dias do protocolo manual pode ser reduzido a um dia, como o robô funciona durante a noite umad pode fazer todas as mudanças de temperatura adequadas. O robô também é muito consistente em seus resultados e permite a sondagem simultânea de muitas amostras de forma eficiente. Mantém-se vantajosa para fazer o primeiro dia por mão como que permite a reutilização de sondas e utilização de menores volumes de reagente. A única desvantagem significativa da utilização de um robô é o custo inicial do instrumento.
Este protocolo discute algumas das maneiras para efetivamente uma imagem de hibridação in situ. É importante fazê-lo como grande parte da informação pode ser perdida se a imagem é pobre. Em muitos casos, a imagiologia in situ dos resultados de uma experiência exige o mesmo tempo que o experimento inicial. Alguns elementos das variáveis de procedimentos, tais como o grau de clareamento têm um elemento de preferência pessoal. Outros efeitos da imagem latente pode ser conseguido colocando o prato numa base colorida. Muitas vezes uma ligeira sombra azul para o agar pode enfatizar a profunda coloração azul do no situ hibridação. Basta colocar a placa de petri contendo o agar sobre uma folha de plástico azul para obter o efeito desejado.
No entanto, os métodos descritos aqui fornecem uma base com a qual a explorar possibilidades de imagem. Os embriões podem ser vistos ou apagadas (transparentes para estruturas internas melhor vista) ou uncleared (visto como eles aparecem em condições normais de iluminação). Alguns de decisão em relação a como a imagem do embrião é dependente do local de expressão. Se a expressão é sobre ou perto da superfície do embrião, o melhor é o embrião imagem sem compensação. Existem várias vantagens em usar os embriões não apurados. O processo de limpar os embriões requer muitas etapas e os produtos químicos usados para limpar os embriões são difíceis de manusear. Além disso, várias cavidades no embrião permitir a precipitação de fosfato de substratos alcalinas que podem resultar em coloração cavidade falso. Em particular, o blastocele de embriões precoces e a pharyncavidade geal muitas vezes mostram a coloração (Figura 4). Esta falsa coloração não é visível em embriões que não são apagadas. Para a maior parte, ainda que moderadamente profunda expressão pode ser visualizada em embriões não apurados, incluindo tecidos mesodérmicos tais como coração, rim, e somitos e stuctures endoderme tais como tiróide e no fígado. Movendo-se os embriões através de uma série de metanol para qualquer hidrato em PBS para visualização ou colocar em 100% de metanol para armazenamento permite múltiplas rodadas de armazenamento e de imagem. O armazenamento de metanol permite experimentar diferentes modificações ao longo do tempo de imagem ampliada.
Existem algumas desvantagens de usar a técnica de hibridização in situ de olhar para a expressão do gene. Os níveis de expressão não são rigorosamente quantificável embora a comparação dentro de um embrião e alterações grosseiras na expressão e mudanças no tamanho do domínio de expressão são geralmente óbvio. Tal como acontece com outras técnicas baseados no RNA, ele não fornece qualquer informação quanto to as proteínas codificadas pelo gene de interesse, o que pode limitar a interpretação dos resultados. Finalmente, é muitas vezes difícil determinar qual poderia ser a coloração de fundo em comparação com a expressão de domínio verdadeiro. Isto é particularmente um problema com genes com um padrão de expressão desconhecido que pode ser generalizado. Muitas vezes, uma sonda gerada a partir da cadeia de sentido directo do mesmo gene é usado como um controlo para coloração não específica. Uso de uma cadeia de sentido directo de controlo podem fornecer alguma informação relativa a um problema com reagentes mas não fornece evidência definitiva de que a coloração com base na sonda de anti-sentido é completamente exactos. Os resultados de um in situ são geralmente muito consistente para embriões quando são utilizados múltiplos embriões e isso pode ser usado como uma medida de confiança de um padrão de coloração. Além disso, diferentes sondas anti-sentido, gerados a partir de partes diferentes do gene, em particular as regiões não traduzidas, pode ser utilizado para ver se eles dão o mesmo padrão de coloração. Se o fizerem,ele também fornece a confiança no padrão de coloração observada se for idêntica. Sondas diluído também pode ser utilizado com a exposição prolongada a a solução corante para ver se o mesmo padrão de coloração emerge. Um fator que normalmente inspira confiança em um padrão de coloração é se esse padrão corresponde a uma estrutura embrionária específica. Suficiente no situs agora ter sido feito com uma grande variedade de genes que novos padrões de expressão são susceptíveis de eventos relativamente raros. Foram estabelecidas em grandes bases de dados de imagens in situ para organismos diferentes, que podem ser utilizados para comparar os resultados de imagem. Para os embriões de Xenopus, Xenbase (www.xenbase.org) é um excelente exemplo de um recurso que pode ser usado para entender os padrões de expressão. Outros organismos modelo também tem extensas bases de dados semelhantes, de imagens.
Apesar destes potenciais ressalvas, a hibridação in situ permanece uma ferramenta poderosa e de confiança que é extremamente útil parao estudo de organogénese. É provável que se mantenha o método de escolha para a identificação de tipos de células e examinar a evolução em domínios de expressão de genes para o futuro previsível.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
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