Protocol
1. העובר הכנה
- אם לא נעשה באופן שגרתי כחלק מתרבות עובר, דה-הג'לי עובר באמצעות ציסטאין 2.5%, pH 8.0 לפני קיבוע 8. למרות שזה לא הכרחי, הוא שימושי וללאחר מכן להסיר באופן ידני את מעטפת ההפריה לפני הקיבוע באמצעות מלקחיים בסדר.
- השתמש בטפטפות פסטר זכוכית להעביר את העוברים. פיפטה אינה רחבה מספיק כדי להעביר עוברים כך להשתמש בעט יהלום לחתוך טפטפת הזכוכית בנקודה רחבה מספיק כדי להרים את עובר. לחסל את הקצוות החדים של טפטפות לאחר החיתוך על ידי העברה במהירות את הקצה לחתוך דרך הלהבה של מבער בונזן כדי להמס את הקצוות החדים.
הערה: טיפול צריך לקחת, כמו הזכוכית עדיין יכולה להיות חמה מספיק כדי לגרום לכוויות למרות שזה נראה שמקורר על ידי בדיקה ויזואלית.
- השתמש בטפטפות פסטר זכוכית להעביר את העוברים. פיפטה אינה רחבה מספיק כדי להעביר עוברים כך להשתמש בעט יהלום לחתוך טפטפת הזכוכית בנקודה רחבה מספיק כדי להרים את עובר. לחסל את הקצוות החדים של טפטפות לאחר החיתוך על ידי העברה במהירות את הקצה לחתוך דרך הלהבה של מבער בונזן כדי להמס את הקצוות החדים.
- בצע את קיבעון העובר בשלבים. ראשית, להכין צלוחיות זכוכית לשימוש בקיבעון עובר. השתמש בבקבוקונים הללו לכל השלבים כולל סופיאחסון. השתמש בבקבוקונים שברורים עם חותם טפלון טוב במכסה, המאפשרים לניטור עוברי במהלך כל השלבים של התהליך. תווית הצלוחיות עם מידע ניסיוני מתאים באמצעות סמן קבוע ולאחר מכן לכסות את התווית עם סרט ברור, כמו גם סמן קבוע יאבד במהלך ההליך בשל השימוש באלכוהול וממסים אחרים.
- השתמש Mempfa לתקן את העוברים. הפוך מניות של paraformaldehyde 8% בקבוצות של 50-100 מיליליטר בכל פעם. השתמש בכ -75% מH 2 O הנדרש וחום 50-60 מעלות צלזיוס, אשר נדרשה כדי לקבל את paraformaldehyde לפתרון.
הערה: פתרון זה הוא מעט שונה מMemfa שימש בגרסות פרוטוקול שפורסמו מבוגרות בכך שהוא מנצל paraformaldehyde במקום פורמלדהיד. - להוסיף 2-3 טיפות של NaOH 10N או עד pH הוא כ 7.5 (נייר pH שימוש כדי לבדוק pH). Paraformaldehyde הוא מאוד רעיל, ולכן ליצור פתרון המניות במנדף. ברגע שפסקפורמלדהיד הוא בפתרון, לסנן את הפתרון באמצעות נייר Whatman לתוך מיכל טרי ולהוסיף H 2 O לנפח הסופי. במידת הצורך, לאחסן פתרון paraformaldehyde ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות.
- להרכיב את הרכיבים הנותרים של פתרון Mempfa קיבעון (טבלת 1). ודא שריכוז העבודה הסופי של paraformaldehyde הוא 4%. אחסן את כל הרכיבים של פתרון הקיבעון על 4 מעלות צלזיוס במניות.
- בעזרת פיפטה קריסטל, לתקן את העוברים על ידי הוספת העוברים לבקבוקוני זכוכית שכותרתו כי כבר מלאים במ"ל כ 3-4 פתרון Mempfa (טבלת 1). הימנע מתיקון יותר מ 20-30 עוברים לכל בקבוקון. הוסף את העוברים עם מינימום של העברת נוזל ממדיום העובר. תקן את העוברים בפתרון Mempfa לשעת 2 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C.
- למבנים האנדודרם מאוחר לבצע במנח על מכשירים נגזרים בטן והאנדודרם מבודדים באופן ידני 9,10, המאפשר לחדירה טובה של החללית וגם ימנע כתמי חלל.
- אחסן פתרון של מתנול 100% ב -20 ° C. לאחר קיבוע paraformaldehyde, להחליף את פתרון Mempfa עם כ 4 מיליליטר של -20 ° C, מתנול 100% לאחסון של העוברים.
- לערבל את הבקבוקונים לאחר תוספת של מתנול כדי למנוע את העוברים יידבקו לזכוכית או עוברים אחרים. כמו כן, ודא הבקבוקונים בחוזקה אטומים כי מתנול יכול להתאדות במקפיא לאורך זמן אם רופף.
הערה: ניתן לאחסן עוברים לשנה לפחות, וסביר יותר, במתנול לפני מכתים ללא איבוד איכות הכלאה באתר.
- השתמש Mempfa לתקן את העוברים. הפוך מניות של paraformaldehyde 8% בקבוצות של 50-100 מיליליטר בכל פעם. השתמש בכ -75% מH 2 O הנדרש וחום 50-60 מעלות צלזיוס, אשר נדרשה כדי לקבל את paraformaldehyde לפתרון.
2. בדיקה הכנה
- השתמש 1-2 מיקרוגרם של תבנית ה- DNA על מנת להפוך את הבדיקות שכותרתו digoxigenin. פלסמיד Cut המכיל את רצף ה- DNA המתאים בסוף '5 של הגן של עניין עם הגבלת האנזים מתאים לthaוקטור t ליצור בדיקות antisense.
הערה: פלסמיד צריך אתר קישור RNA פולימראז המתאים (למשל T7, T3, או SP6). - לאפשר את ה- DNA, מים, NTP לערבב וחיץ פולימראז כדי לחמם לטמפרטורת חדר לפני הרכבת תגובת סינתזת בדיקה. מוסיף את הרכיבים של סינתזת התגובה RNA לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר בצו כמפורט בטבלה 2. התאם את נפח מים הוסיף להביא את הנפח הכולל של סינתזת תגובת בדיקה עד 20 μl. להרכיב את התגובה בטמפרטורת חדר, כי רכיבים של חיץ פולימראז יכולים להאיץ את ה- DNA התבנית כאשר בריכוזים גבוהים וקרים.
- דגירה תגובת השעתוק עבור שעת 2 ב 37 ° C.
הערה: incubations של מעט יותר משעתיים מובילה לשום תופעות לוואי, אלא גם להראות קצת גדלה תשואה. אם טופח במשך שעה אחת, התשואה תקטן, אבל עדיין מספיק כדי להפוך את בדיקה טובה.- בזמן ההמתנה לתגובת השעתוק ועד סופו, להפוך את הג'ל agarose אשר ישמש כדי לבדוק את האיכות של החללית. להמס 1 מיקרוגרם של agarose בשל חיץ 1x טה 100 מיליליטר (ראה טבלה 1) על ידי חימום הפתרון לנקודת הרתיחה. הסר את הפתרון מחום כאשר אבקת agarose נמסה לגמרי.
- הוסף 2 μl ethidium ברומיד פתרון מניות (10 מ"ג / מיליליטר) לכ -100 מיליליטר של ג'ל agarose כאשר agarose התקרר לכ -60 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר ויזואליזציה של RNA באור אולטרה סגול (UV).
הערה: פתרון agarose ג'ל זה יכול להיות כל הזמן בחממה C ° 60, כך שיכול להיות שפכו ג'לי עתיד ללא המסה חוזרת ונשנית. תשמרו על עצמך בטיפול ברומיד ethidium בשל רעילות אפשרית.
- להוסיף μl 1 DNAseI (כיתה חופשית RNAse) לתגובת השעתוק לאחר הדגירה שעה 2 ודגירה נוספת 10 דקות ב 37 ° C לחסל תבנית ה- DNA.
- הסר 1 μl של תמהיל התגובה ללבדוק 1% ג'ל agarose-טה והשאר (20 μl) להוסיף 80 μl של 1% SDS במאגר TE (10 מ"מ טריס pH 8.0, 1 mM EDTA), 10 μl של 5M NH 4 Acetate, ו- 220 μl אתנול קר של. וורטקס התמהיל נמרץ ומניח בצד על קרח עד לתוצאות בדיקת איכות RNA ידועות.
- הפעל את μl 1 של RNA להסיר לפני הממטרים ב1% ג'ל agarose-טה. כדי להקל על העמסה על הג'ל, להוסיף 4-5 μl מים וμl 1 של צבע טעינה הסטנדרטי לRNA. צפה RNA על הג'ל באמצעות transilluminator אור UV כדי לבדוק את איכות הבדיקה (ראה דיון).
- לזרז את הרנ"א שנותר ששמר בצד על קרח בשלב 2.5 על ידי ספינינג בmicrocentrifuge במלוא מהירות במשך 10 עד 15 דקות. לצייר את supernatant עם טפטפת זכוכית נמשך החוצה ולאפשר לו להתייבש בקצרה.
- Resuspend הבדיקה עם 1 מיליליטר של חיץ הכלאת RNA (טבלת 1) בצינור Eppendorf. וורטקס וbriefly לחמם את הצינור עד 37 מעלות צלזיוס ומערבולת שוב. מעביר את פתרון הבדיקה כדי 15 מיליליטר בורג צינור קלקר כובע ולמלא ל7-10 מיליליטר עם חיץ הכלאת RNA. הערה: הבדיקה יכולה להיות מדוללת נוספת (דילול נוסף של 10 לקפל עדיין יכול לעבוד) ופעמים רבות תוצאה רקע נמוך אבל התגובות מכתים גם להימשך זמן רב יותר.
3. הכלאה באתר
- קח את העוברים שאוחסנו במתנול -20 ° C ולאפשר כדי לחמם לטמפרטורת חדר. בצע את ההליך כולו בבקבוקוני הזכוכית. אם עוברים שונים מקבוצה אחת הולכים להיות הסתכלו על ידי בדיקות שונות, לשמור אותם בבקבוקון אחד עד ממש לפני הבדיקות נוספות כדי להפחית את השונות ועבודה ביום הראשון.
- רעננותם עובר דרך סדרת מתנול כפי שמתואר בטבלה 3 (ראה טבלה 1 למתכונים לשטוף) בהכנה לתוספת של הבדיקה. מערבולת בעדינות את אמברימערכת ההפעלה לאחר כל שינוי כדי להבטיח שהם לא נשמרים לצדדים או אחד את השני, ולטלטל את העוברים על ידי הרכבה הבקבוקונים על nutator. בעת העברת הנוזלים, לבדוק את החלק הפנימי של הכובעים כדי להבטיח שעוברים לא היו לכודים שם.
- פעם אחת בפתרון הבדיקה, להכליא את עוברי לילה כפי שמתואר בטבלה 3.
- הסר את פתרון הבדיקה. שמור את הבדיקה בשימוש על ידי אחסון 15 מיליליטר בורג צינור כובע קלקר, מסומן בתאריך ומספר הפעמים שהבדיקה נעשתה שימוש, ב -20 ° C.
הערה: אותו הבדיקה ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות שללאחר מכן בהכלאות באתר עד תגובות colorimetric להתחיל לקחת זמן רב באופן חריג להגיע עוצמה רצויה.- ברגע שהבדיקה היא שהוסר, להכין את העוברים למכתים נוגדן נגד הבדיקה באמצעות הסדרה של שוטף המפורטים בטבלה 4. שינוי הטמפרטורה כנדרש (לוח 4) על ידי הזזת tהוא nutator, עם בקבוקונים של עוברים המצורפים, ישירות לתוך תנורי הכלאה שמוגדרים לטמפרטורה המתאימה.
- מרכיבים את הנפח המתאים של MAB + HTSS + BR + אנטי-Dig נוגדן (לוח 4) בזמן שהעוברים שטופחו על ידי MAB + HTSS + BR פתרון חסימה כך שהנוגדן חסום לפני הוספה ל עוברים. הפוך את פתרונות החסימה טריים ביום של שימוש.
- הסר את פתרון הנוגדן ולהתחיל שטיפות כפי שמתואר בטבלה הבאה 5 דגירה הלילה עם נוגדן. לבצע לפחות עשר 30 שטיפות דקות כדי להתכונן לצביעה עם מצע phosphatase אלקליין ולהפחית את הרקע ככל האפשר. השתמש באחת חיץ MAB או פתרון TBT (טבלת 1) לשלבי הכביסה.
הערה: פתרון TBT הוא TTw כי יש 2 מ"ג / מיליליטר של BSA הוסיף.- החלף את הפתרון לשטוף האחרון עם מצע phosphatase אלקליין הסגול BM. בצע את reac מכתיםtion באו טמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס.
הערה: מכתים הוא יותר מהיר ב- C ° 37, אבל אם נשאר כל הלילה, מכתים רקע מקובל לעתים קרובות יכול להיות תוצאה. התגובות מכתים לעתים קרובות דורשות צביעת הלילה וטמפרטורת חדר היא הבטוחה ביותר לכך. - אם נדרש צביעה נוספת והפתרון הסגול BM הוא לוקח על צבע כחול, להחליף את הפתרון מכתים עם טרי BM הסגול ולשים את הצינורות לתוך 37 מעלות צלזיוס. אם mRNA היעד הוא מאוד עשיר, לשים את העוברים בפתרון מכתים ב 4 ° C למשך לילה ולאחר מכן להעביר את העוברים לטמפרטורת חדר או 37 ° C כדי לאפשר ניטור טוב יותר של התגובה מכתים.
- צג תגובות חדשות בזהירות, כזמן תוצאה סופית משתנה במידה ניכרת בין RNAs היעד שונה. לשם עקביות, לעצור את התגובה מכתים (ראה 3.4) כאשר אין אתרים חדשים של ביטוי נובע עם דגירה ארוכה יותר. חשוב לציין, אם הכלאה באתר נמצא בשימוש כassayלניסויים מסתכלים על קבוצות טיפול שונות, להשתמש באותו הזמן לתגובות צבע בין עוברי טיפול ושליטה.
- החלף את הפתרון לשטוף האחרון עם מצע phosphatase אלקליין הסגול BM. בצע את reac מכתיםtion באו טמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס.
- לעצור את התגובה מכתים ולהכין את העוברים לאחסון והקלטת תמונה על ידי שינוי הנוזלים כפי שמתואר בטבלה 6. לא לטלטל את העוברים בשלב זה, כי הסרת הכתם יכולה להיות דמיין כצביעה סגולה של מתנול סביב העוברים.
הערה: לעתים קרובות יש לי עוברים צביעה בצבע תכלת מהפתרון מכתים ומתנול הקר לפחות באופן חלקי יכולה להסיר את זה, למרות שזה אינו מספיק כדי להסיר את הרקע כבד או כתמי חלל. מתנול קר מתייחס למתנול שנשמר ב-20 ° C במקפיא.- רעננותם את העוברים ולתקן את הכתם עם Mempfa (לוח 6). ברגע קבוע, להסיר את Mempfa ולשטוף את העוברים עם מתנול 25%.
- הסר את מתנול 25% ולהוסיף את פתרון ההלבנה אם ההסרה של פיגמנט אנדוגנינדרש. תשמור על עצמך בטיפול בפתרון ההלבנה כפי שהוא יכול לגרום לכוויות. שים לב להלבנה מקרוב כפי שזה קורה במהירות יחסית ואת מידת ההלבנה יכולה להיות מגוונת לאפקטים שונים (איור 2).
- ליבש עוברים דרך סדרת מתנול מתנול 100% עבור אחסון לטווח ארוך הבאה הלבנה, או להעביר לPBS עבור אחסון לטווח קצר וההדמיה הבאה (ראה טבלה 6).
4. עוברים הדמיה
- ברגע שעובר השלים את תהליך הצביעה, תמונת העובר, כך שהמידע על איפה הגן של העניין מתבטא הוא נתפס לקהל רחב יותר. השתמש 1% agarose כרקע לצפייה בעוברים הבלתי מסולקת.
הערה: agarose נותן רקע כחול / אפור שעומד בניגוד היטב עם העובר והצבע הכחול של התגובה מכתים. זה גם עוזר לפזר צללים והשתקפויות שלהסיט את תשומת לב מן העובר מסיחים את דעת.- להוסיף agarose למים ולאחר מכן מביא לרתיחה עד agarose הוא בפתרון ולאחר מכן לתת מגניב עד 50 לפני שנשפכים לתוך צלחת פטרי. כמו במקרה של פתרון ג'ל טה, לאחסן פתרון agarose ב -55 מעלות צלזיוס חממה לשימושים מרובים. יוצקים את agarose עד לעומק של כ -2 מ"מ בצלחת פטרי. במידת הצורך, להתאים את עומק agarose להניב מעט שונה צל הרקע.
- בעקבות התייבשות מהאחסון במתנול לתמיסה מימית (PBS או TTw), באמצעות סדרת מתנול, מניח את העוברים בצלחת פטרי עם בסיס agarose (ראה לוח 6). שמור את הפתרון נקי ואם נדרש, להשתמש בסינון פשוט לחסל חומר חלקיקים קטן שיכול לשבש את הרקע הנקי של תמונות טובות.
- לתמונה עובר מהשקפות חלופיות, כגון מהצד הגחון, לחתוך דקים ערוצים בagarose כדי להתאים את העובר באמצעות מלקחיים עדינים ומניח את העוברים באותם ערוצים לכיוון (איור 3 הערה: רוב השלבים עמדה אופיינית שהם מניחים כאשר הניחו פתרון. לדוגמא, עובר blastula השלבים נוטים לשבת בצד עד לבעלי חיים. ברגע שעובר מתחיל להאריך, הם שכבו בצד שלהם.
- השתמש במקור האור האופטי סיבים כדי להאיר את העובר מזווית רדודה, יצירת צללים על העובר המספקים עומק לתמונה ולעזור להבחין מבני משטח. משום הלבנה יכולה לחסל פיגמנט המספק ציוני דרך שימושיות, להשתמש בהצללה לעוברים מאוד מולבנים.
- נקה את העוברים לצביעת תמונה שהוא עמוק בתוך העובר, כגון בnotochord, הריאות, או באזורים של המוח, (איור 4). כדי להשיג זאת, לשים את העוברים דרך סדרת מתנול עד 100% מתנול.
- לאחר טבילה מלאה במתנול, להעביר את העוברים לנזיל אלכוהול פתרון של חלק אחד ושני חלקים בנזיל להיותnzoate (באב). עובר אשר יצוף על פני השטח, אלא כמתנול מתערבב עם באב, הם ישקעו באב. לבצע כל צעד העוסק באב בבקבוקוני זכוכית או כלים; באב יתמוסס כל פלסטיק או צבע.
- ברגע שפינה, להציג את העוברים עם אור מועבר מגיע מלמטה העובר. התאם את עוצמת האור, כמו גם את הזווית מלמטה כדי לשפר את הניגודיות ומספק את הצבע הטוב ביותר.
- כאשר עוברים פינו צפייה להעלות את צלחת פטרי מזכוכית משל הבסיס. לעשות את זה פשוט על ידי השימוש בשני מכסים בצלחת פטרי אחרים כדי לגייס אותו כך שהאזור של המנה עם עוברים הוא גבוה.
הערה: זו יש את היתרון של לקחת את הבסיס מחוץ לפוקוס וביטול השפעות מסיחות את הדעת מפגמים או כתמים על בסיס מיקרוסקופ שיכול להפריע לתמונה.
הכלאה באתר 5. זוגי ב
- כדי בו זמנית כדי להציג את דפוס הביטוי של two גנים שונים בעובר יחיד, לסנתז שתי בדיקות, אחת לכל אחד מהגנים השונים. לסנתז בדיקה אחת באמצעות DIG-11-UTP כתווית כפי שתואר לעיל. לדלל את המוצר של תגובת השעתוק במאגר הכלאה RNA להניב בדיקה מרוכזת יותר מאשר 3x משמש ליחיד בהכלאות באתר.
- לסנתז בדיקה נוספת של ריבית תוך שימוש באותו הפרוטוקול כלDIG שכותרתו חקר פרט לכך שההעמסה-12-UTP חייב להיות תחליף לDIG-11-UTP. לדלל את המוצר של תגובת השעתוק במאגר הכלאה RNA להניב בדיקה מרוכזת יותר מאשר 3x משמש ליחיד בהכלאות באתר.
- מערבבים את שתי בדיקות מרוכזות ביחס של 1: 1. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בבדיקה שכותרתו והעמסת לגן המציג את הביטוי החזק ביותר באחד בפרוטוקול הכלאה באתר.
- השתמש באותו בפרוטוקול הכלאה באתר תאר לאחד באתרו </ Em> הכלאות, למעט שימוש בבדיקה הכפולה (בדיקה המכילה תערובת 1.5x מרוכזת של בדיקות שכותרתו digoxigenin ושכותרתו והעמסת) בסופו של היום הראשון במקום יחיד בבדיקת הכלאה באתר.
- בצע את פרוטוקול הכלאה אחת ביום השני של כפול בפרוטוקול הכלאה באתר, פרט לברי שימוש אנטי-והעמסת-AP Fab בדילול 1: 4,000 במקום של שברים אנטי DIG-AP Fab. לשטוף את הנוגדן העודף מהעובר כמו באחת בפרוטוקול באתר ולבצע את תגובת הצבע הראשונה באמצעות מצע BM-הסגול AP.
- בעקבות תגובת הצבע הראשונה, להשבית את נוגדן flourescein ב 0.1 M pH גליצין 2.0 במשך 40 דקות ואחריו חמש עשר דקות בשוטף MAB. חסום את העוברים בMAB + HTSS + BR למשך 90 דקות. הוסף את הנוגדן אנטי DIG בדילול 1: 2,000 בMAB + HTSS + BR דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, לשטוף את העוברים הoroughly בMAB (12 שטיפות של 30 דקות) כדי להסיר את הנוגדן העודף.
- לשטוף את העוברים במשך 10 דקות בAP הצפת (טבלה 1) ולאחר מכן כתם עם BCIP (0.5mg / מיליליטר בAP Buffer).
הערה: באתרו שילוב צריך לתת כתם כחול-סגול כהה לתגובת הצבע הראשונה ותגובת צבע תכלת לשנייה (איור 5). - לעצור את תגובת הצבע הסופית על ידי הסרת חיץ AP ולשטוף שלוש פעמים עם MAB. תקן את העוברים עם Mempfa במשך 10 דקות. לשטוף את העוברים עם 5 שוטף מהיר בMAB או TBT.
- עם שילוב הצבעים הזה, השימוש במתנול בטיפולים שלאחר הצביעה הוא כבר לא אפשרי, כפי שהוא יבטל את הצבע לבד BCIP. אחסן את העוברים לאחר מכתים וקיבעון בPBS עם 0.02% אזיד הנתרן. מכתים עוצמה יכולה להיות חלש עם כפול במנח. אם מדובר בבעיה, להפחית את שטיפות לארבעה, כל אחד מ2 משך שעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השימוש בבדיקות רקמות ספציפיות יכול לספק מידע מצטיין בכל הקשור למצב של פיתוח לאיברים ספציפיים. בדוגמאות הבאות, שלבו של העובר מבוסס על שולחן בימוי Nieuwkoop וFaber 11. אם האדם משתמש בגני טופס בדיקות ביטאו לאחר בידול, טרופונין אני לב בשלב 28-30, למשל (איור 1 ג), נוכחות או גודל של איבר מובחן ניתן להעריך בכל שלב שלאחר התמיינות. לפני שנים, embryologists היו מסוגל לעשות ניתוח כזה המבוסס על ידע מדהים של היסטולוגיה של העובר המוקדם 12,13 אבל המומחיות שאבדה במידה רבה לדור הנוכחי של embryologists. אמנם, אובדן מומחיות זה יכול להיחשב מצער, האמינות וקלות שימוש של בטכניקות הכלאה באתר עושה זיהוי של רקמות ספציפיות זמינות לכל חוקר. רקמות שיחסית לא בולטים, tהוא בקיעת בלוטה בשלב עוברי 25 למשל (איור 1 א), ניתן לסמן בבהירות באמצעות במנח ללא הצורך בנוגדנים ספציפיים או טכניקות היסטולוגית (איור 1 ג). כמו כן, השימוש בכל ההר במנח מאפשר לאדם לראות את כל האיבר בהקשר של כל העובר ולא להסתמך על מסקנה מסעיפים היסטולוגית (איור 2). ניתן לראות גם רקמות שנמצאות עמוקים בתוך העובר כולל הגבעול האופטי (איור 4) בקלות ובשימוש בסליקת עובר יכול לספק תיחום חד של גבולות האיבר.
הלבנה של עוברים כדי להסיר פיגמנט אנדוגני באמצעות פתרונות חמצן במידה רבה בטלה את הדרישה לשימוש בעוברים לבקן שחסר פיגמנט. הלבנת לזמנים שונים יכולה להיות שימושית. לדוגמא, אם הכתם הוא חזק, הלבנה קלה המאפשר לכמה פיגמנטציה להיראות יכולה להיות שימושית כי זה כלOWS להיערכות טובה יותר ולכיוון של העובר (איור 2 א). עם זאת, אם הכתם הוא אזור שבו יש רמות גבוהות של פיגמנטציה, כגון הכליות (איור 2), ליד חיסול של הפיגמנט שלם על ידי דגירה כבר פתרון ההלבנה נותן תוצאה טובה יותר.
עוברים נוטים לתפוס עמדות מסוימות כאשר בפתרון. לאחר neurulation, הם נוטים שכבו על צדם. זה טוב ויפה לתמונות של האגף (איור 2), אבל יכול להיות בעיה עם תחומים אחרים. שימוש בבסיס agarose מאפשר לחתוך ערוצים לagarose שניתן להשתמש בו כדי לכוון את העוברים. לדוגמא, מבשרי דם מקומיים לצד הגחוני של העובר (איור 2 א) ואת מלוא ההיקף מכתים קשה לצפות. מיקום של העובר בערוץ עם הצד הגחוני למעלה, ולאחר מכן מאפשר צפייה מלאה שבדפוס ביטוי גנים (איור 3 א). השימוש בכפל בכלאה באתר יכול להראות את הקשר בין שני דפוסי ביטוי גנים בתוך אורגניזם יחיד (איור 5) ומבטל את הצורך בהשוואה בין עוברים שונים שעשויים להיות הבדלים קטנים במורפולוגיה. ואולי הכי חשוב, את השימוש בכלאה באתר נותן אחד את היכולת לסמן תאים לפני לנקות בידול היסטולוגית מבוסס על הביטוי של גנים שבאים לידי ביטוי באבות המוקדמים של שושלת, כגון pax2 שבאו לידי ביטוי ברקמות רבות באופן ברור עובר מוקדם, לפני ההתמיינות (איור 4 א). היכולת לזהות אבות ורקמות שאינם להבחין בבירור מבוססים על היסטולוגיה, כגון מבשרי תא מיאלואידית (איור 1), אפשרה לחוקרים לשאול שאלות הרבה יותר מפורטות על מצב הפיתוח של איבר וגם להעריך את התוצאות של ניסוי מ 'anipulation נועד לגרום לבידול מחוץ לרחם של רקמה.
איור 1:. דוגמאות להר השלם הכלאה באתר בעוברי Xenopus כתמי כחולים בניסוי הכלאה באתר יכול בבירור להתוות פיתוח מבנים של עובר Xenopus המוקדם () תצוגה קדמית של עובר בשלב 26 מדגיש את בלוטת הבקיעה. כמוגדר על ידי הביטוי של uvs.2 14 (ב) תצוגת הגחון של עוברים המראים את מיקומם של תאי מיאלואידית המוקדמים בשלב 20 באמצעות הביטוי של Myeloperoxidase 15 כסמן הלב המוקדם (C) בשלב 28.. - 30 הוא מדמיין על ידי הביטוי של טרופונין הלבבי אני 16. יתרון ברור של שימוש בשיטה זו הוא שכלדפוסי ביטוי גנים אלה היו דמיינו באמצעות בדיקות שונות, אך הפרוטוקול המשמש הוא זהה בכל המקרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: רמות שונות של הלבנה יכול לשמש כדי לחזות צביעה בעובר כתמי כחולים זה בחלק התחתון של עובר זה (א) מראה הביטוי של המוגלובין בדם איי הגחון בשלב על 36. זה אזור של. עובר שפיגמנט באורח קל בלבד ובכך את העובר לא מולבן במשך זמן רב כפי שניתן לראות על ידי פיגמנט בצבע השזוף בעיניים ולאורך האגף של העובר. היכולת לראות את הפיגמנטציה מאפשרת ראיה טובה יותר של השלב של העובר. אם הכתמים הוא באזור עם פיגמנטציה טבעית גדולה יותר, כגון מערכת עצבים ואת האגף של העובר, הלבנה גדולה יותר תעזור להציג באתר כפי שניתן לראות בב (ב) הנה הביטוי של pax8 17 בכליות ויוצרות , צינור והמוח האחורי pronephric היא דמיינו הטובה ביותר לאחר ההלבנה הסירה כמעט את כל פיגמנט אנדוגני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: מניפולציה של בסיס agarose יכול לעזור עם כיוון של עוברי אזורים ספציפיים הדמיה של העובר יכולים להיות קשים, כי הם נוטים לתפוס עמדות מסוימות בצלחת (א) בראשן שלבי העובר יהיה לשכב על הצד שלה.. . על ידי קיצוץטינג ערוץ קנס בagarose (חיצים שחורים) ניתן לראות את העובר מהצד הגחון, כאן מראה ביטוי המוגלובין בשלב 36, עם מספיק יציבות כדי ללכוד תמונה טובה. (ב) יכול לצפות בגחון זה של ביטוי hand1 בשלב 20 מתאר את המזודרם צלחת רוחב 6. העובר ממוקם בחור קטן שהתייצב מצבו עם הצד הגחוני למעלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. ניתן לצפות באיברים פנימיים בשני עוברים אטומים, הבלתי מסולקת ובפינו בעובר הבלתי מסולקת המוכתם עבור pax2 בשלב 34 (א), הגבעול האופטי (חץ צהוב) ניתן דמיין בקלות יחסיתכיכול מכתים את הצינור העצבי. עם זאת, פרטים אינם חדים. על ידי ניקוי העובר (B) את הגבולות של אתרי ביטוי, כולל גבעול האופטי (החץ הצהוב) יהיו חדים יותר. סליקת המידה מוצגת על ידי היכולת לראות את שני העיניים בעובר פינה זה. כמו כן שימו לב שחלק מהכתמים צברו בחללים הפנימיים (חץ סגול), בעיה נפוצה בעת הצגת עוברים פינו.
איור 5:. כפול נציג הכלאה באתר על עובר Xenopus ביטוי של סמן צלחת לרוחב, hand1, היא דמיינה על ידי הצביעה בצבע התכלת בשלב 26. ביטוי של etv2 בתוך כלי הדם מתפתחים היא דמיינה על ידי כתם סגול כחול כהה. ביטוי של hand1 הוא בדרך כלל מאוד אינטנסיבי ולכן היא נוצלה לtהוא חלש בדיקה שכותרתו והעמסת ושילוב BCIP. ניצל את הבדיקה שכותרתו digoxigenin ושילוב BM-סגול לביטוי החלש etv2.
| שם | ריכוז סופי | הסכום / 100 מיליליטר |
| Mempfa | 1 מ"מ MgSO 4 | של 1 M MgSO 4 100 μl |
| (חנות ב 4 ° C) | 2 מ"מ EGTA, pH 8.0 | 10 מיליליטר של 20 מ"מ EGTA, pH 8.0 |
| 0.1 M מגבים, pH 7.5 | 10 מיליליטר של 1 M מגבים, pH 7.5 | |
| 4% Paraformaldehyde, pH 7.5 | 50 מיליליטר של Paraformaldehyde 8%, pH 7.5 | |
| TTw | 50 מ"מ טריס, pH 7.4 | 5 מיליליטר של 1 M טריס, pH 7.4 |
| 200 מ"מ NaCl | 4 מיליליטר של 5 M NaCl | |
| 0.1% Tween 20 | של Tween 20 100 μl | |
| הפתרון של 100X Denhardt | 2% BSA | 2 גרם BSA |
| (לסנן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר, | PVP-40 2% | PVP-40 2 g |
| חנות ב -20 ° C) | 2% Ficoll 400 | 2 g Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M NaCl | 17.5 גרם NaCl |
| 300 מ"מ Trisodium ציטראט | 8.8 g Trisodium ציטראט | |
| RNA הכלאה הצפת | פוראמיד 50% | 50 מיליליטר של פוראמיד 100% |
| (חנות ב 4 ° C) | 5x SSC | 25 מיליליטר של 20x SSC |
| 1 מ"ג שמרי RNA / מיליליטר | 4 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר השמרים RNA מומס בפוראמיד 50% | |
| הפתרון של 1X Denhardt | 1 מיליליטר של 100x הפתרון של Denhardt | |
| 0.1% Tween 20 | של Tween 20 100 μl | |
| 5 מ"מ EDTA, pH 8.0 | 1 מיליליטר של 0.5 M EDTA, pH 8.0 | |
| MAB | 100 מ"מ Maleic חומצה | 1.16 גרם של חומצת Maleic |
| (PH 7.5, חנות ב 4 ° C.) | 150 מ"מ NaCl | 0.88 גרם של NaCl |
| MAB + HTSS + BR | 100 מ"מ Maleic חומצה | 96 מיליליטר של MAB |
| 4% סרום כבשים טיפול בחום | 4 מיליליטר של סרום כבשים טיפול בחום (טיפול בחום על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וaliquoted) | |
| 2% מגיב חסימה | 2 גרם של מגיב חסימת רוש | |
| MAB + HTSS + BR + אנטי-Dig נוגדן | 100 מ"מ Maleic חומצה | 96 מיליליטר של MAB |
| 4% החום Trסרום כבשים eated | 4 מיליליטר של סרום כבשים טיפול בחום | |
| 2% מגיב חסימה | 2 גרם של מגיב חסימת רוש | |
| 1: 10,000 Anti-Dig-AP, Fab שברים הנוגדן | 1.5 μl של Anti-Digoxygenin-AP, Fab שברים נוגדן | |
| אלקליין phosphatase (AP) Buffer | 100 מ"מ טריס, pH 9.5 | 10 מיליליטר של 1 M טריס, pH 9.5 |
| 50 מ"מ MgCl 2 | 5 מיליליטר של 1 M MgCl 2 | |
| 100 מ"מ NaCl | 2.5 מיליליטר של 4 M NaCl | |
| 0.1% Tween 20 | של Tween 20 100 μl | |
| פתרון הלבנה | H 0.3% 2 O 2 | 3.34 מיליליטר של H 30% 2 O 2 |
| Formamide 5% | 5 מיליליטר של Formamide 100% | |
| 0.5% SSC | 2.5 מיליליטר של 20x SSC | |
| פתרון סליקה | 1/3 בנזיל אלכוהול | 33 מיליליטר |
| 2/3 בנזיל בנזואט | 67 מיליליטר |
טבלת 1: מתכוני פתרון
| שם | הסכום |
| Dig-NTP Mix | 5 μl של 20 מ"מ CTP |
| (תגובת μl 40) | 5 μl של 20 מ"מ GTP |
| 5 μl של 20 מ"מ ATP | |
| 3.25 μl של UTP 20mm | |
| 3.5 μl של 10mm Dig-11-UTP | |
| 18.25 μl מים מזוקקים, autoclaved | |
| בדיקה סינתזה | x μl של תבנית ה- DNA(תלוי בריכוז) |
| (20 תגובת μl) | x μl של מים מזוקקים, autoclaved |
| 4 μl של תמהיל Dig-NTP | |
| 0.5 μl של מעכב RNAse | |
| 2 μl של חיץ פולימראז 10X RNA | |
| 2 μl של RNA פולימראז |
טבלה 2: מתכוני הסינתזה Probe
| שם מגיב | נפח משוער | משך | טמפרטורה |
| מתנול 100% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 75% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 50% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 25% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| TTw | 2 מיליליטר | 10 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| TTw | 2 מיליליטר | 10 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| TTw | 2 מיליליטר | 10 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| לטרום חם RNA הכלאה הצפת וProbe 65 ° C | |||
| TTw | 4 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| TTw | 4 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| RNA הכלאה הצפת | 2 מיליליטר | 10 דקות, נדנדה | חדר Temperaturדואר |
| טרום חימם RNA הכלאה הצפת | 2 מיליליטר | 1 שעה, נדנדה | 65 ° C |
| בדיקה פתרון | 1 מיליליטר | הלילה, נדנדה | 65 ° C |
טבלה 3: צעדים ליום ראשון של In Situ הכלאת הפרוטוקול (סה"כ שעות על 3)
| שם מגיב | נפח משוער | משך | טמפרטורה | ||||
| טרום חמה RNA הכלאה הצפת ו02.x SSC עד 65 מעלות צלזיוס ו2x SSC עד 37 מעלות צלזיוס | |||||||
| חזור פתרון בדיקה לצינור לשימוש חוזר | |||||||
| RNA הכלאה הצפת | 2 מיליליטר | 10 דקות, נדנדה | 65 ° C | 2X SSC | 2 מיליליטר | 20 דקות, נדנדה | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 מיליליטר | 20 דקות, נדנדה | 37 ° C | ||||
| 0.2X SSC | 4 מיליליטר | 1 שעה, נדנדה | 65 ° C | ||||
| 0.2X SSC | 4 מיליליטר | 1 שעה, נדנדה | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1.5 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר | ||||
| MAB + HTSS + BR + אנטי DIG נוגדן | 1.5 מיליליטר | הלילה, נדנדה | 4 ° C |
לוח 4: צעדים ליום שני של In Situ הכלאת הפרוטוקול (סה"כ כ -4 שעות)
| שם מגיב | נפח משוער | משך | טמפרטורה |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| MAB | 4 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מצע BM הסגול AP | 500-750 μl | לילה, נדנדה (ראה טקסט) | טמפרטורת חדר / 37 ° C (ראה טקסט) |
לוח 5: צעדים ליום שלישי של In Situ הכלאה Protocol (כ -7 שעות)
| שם מגיב | נפח משוער | משך | טמפרטורה |
| מתנול 25% | 2 מיליליטר 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר | |
| מתנול 50% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 75% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 100% (קר) | 2 מיליליטר | 20 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 100% (קר) | 2 מיליליטר | משתנה, לא נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 75% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 50% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 25% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| Mempfa | 2 מיליליטר | 30 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 25% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 25% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 25% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| פתרון הלבנה | 4 מיליליטר | 40 דקות 3 שעות, נדנדה | טמפרטורת חדר / 37 ° C (ראה טקסט) |
| אחסון עוברים | |||
| מתנול 25% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 50% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 75% | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| מתנול 100% | 4 מיליליטר | חנות ב -20 ° C | |
| 1x PBS | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| 1x PBS | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
| 1x PBS | 2 מיליליטר | 5 דקות, נדנדה | טמפרטורת חדר |
לוח 6: צעדים להפסקה ב הכלאה באתר, הלבנה ואחסון של עוברים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היכולת להשתמש בכלאה באתר כדי להמחיש את דפוס הביטוי של גנים מסוימים נשארת השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לזיהוי איברים ספציפיים או סוגי תאים בעובר Xenopus. סיבה לכך הוא מספר יתרונות המוצעים על ידי טכניקה זו. הביטוי של גן יכול לזהות מבנים ספציפיים היטב לפני כל סימן היסטולוגית של בידול כגון במקרה של ביטוי nkx2.5 באבות הלב לפני כל תיחום ברור של תאים אלה 18. לאחר שכל חומרים כימיים נמצאים ביד, זה גם מאוד חסכוני. דור של רבים בדיקות בודדות, שניתן לעשות שימוש חוזר ביעילות, אפשר עם תוספת זמן קטן והשקעת העלות אחרת מאשר קבלת פלסמידים המקודדים את הגנים של עניין. מניסיוננו, ניתן לעשות שימוש חוזר בדיקות במשך שנים עם הפסד קטן בפעילות למרות דילולים הקטנים בלתי נמנעים שמגיעים עם כל שימוש. לבסוף, יש requi אופטימיזציה הקטןאדום כאשר ניצול בדיקות שונות.
האיכות של סינתזת הבדיקה היא גורם מפתח בהצלחתה של הפרוטוקול. ישנן דרכים רבות כדי לבדוק את האיכות של חללית RNA אלא פשוט מפעילה את הבדיקה RNA על ג'ל טה היא שיטה מהירה וקלה שהיא די אמין. אנו משתמשים באופן שיגרתי ברומיד ethidium להכתים את RNA וזה דורש טיפול מיוחד ורשותו של ג 'על ידי רוב המוסדות. חלופות שאינן רעילות זמינות מסחרי למרות שאנחנו לא בהשוואה במיוחד אלה לבדיקות הדמיה. הבדיקה צריכה לרוץ כלהקה אחת למרות שזה יופיע מטושטש במקצת בהשוואה ל- DNA על ג'ל טה. ניתן להשיג אומדן כמות RNA: תגובה טובה תהיה על 1 מיקרוגרם / μl של RNA. להקה דמיין בקלות תייצג לפחות 0.5 מיקרוגרם של RNA ולהקה בהירה תייצג מעל 1 מיקרוגרם. למרות שברור שלא לגמרי מדויק ודורש קצת ניסיון, כימות מבוסס על ג'ל הוא ראפid וחוסנו של הליך באתרו מאפשר לו לעבוד היטב. אם קיים חשש לגבי הדירות, אפשר בקלות להשתמש ספיגת UV לכמת כמות קטנה של תגובת השעתוק, אם כי לא מצאו את זה כדי להיות דאגה העיקרית. לבסוף, ג'ל מאפשר לאדם לראות אם תבנית ה- DNA כבר בוטל. אם הג'ל מציין כי אין RNA, שני ההסברים הסביר ביותר הם תבנית ה- DNA רעה או שחיץ השעתוק לא עובד טוב. חימום חיץ השעתוק עד 37 מעלות צלזיוס וערבוב יסודי לפני השימוש, או תוספת של 1 μl של טרי 100 מ"מ DTT לתגובת השעתוק יכול לעתים לעזור בזה האחרון. מרכיב חשוב של חיץ תגובת השעתוק הוא spermidine וזה יכול לזרז את תבנית ה- DNA בטמפרטורות נמוכות מה שהופך את ההתחממות של החיץ החשוב. DTT במאגר יכול גם לזרז באופן משמעותי מעכב את התגובה. אם משקע נראה בחיץ, לחמם את הפתרון ומערבולת במרץ. אין צורך בנקיטה כל אמצעי זהירות יוצאת דופן, כגון טיפול במים עם טיפים DEPC או מעוקר וצינורות, כדי למנוע פעילות RNAse. הנוכחות של המעכב ריבונוקלאז המסחרי מספקת הגנה משמעותית נגד RNAses מהסביבה. שימו לב שניתן להשתמש בם תוויות UTP אחרות, כגון והעמסת, למרות הניסיון שלנו, UTP שכותרת digoxigenin ושילוב נוגדן אנטי digoxigenin מספק תוצאות עקביות ביותר.
פרוטוקולים מוקדמים לדור בדיקה מצביעים על כך שהידרוליזה בסיסית של הבדיקות המסונתזת צריכה להיעשות 4 על מנת לאפשר לחדירת בדיקה גדולה יותר. הידרוליזה של החללית אינה מופיעה כדי לעזור עם בתהליך הכלאה באתר; בדיקות RNA של יותר מ -500 נ"ב בדרך כלל לתת אות ובדיקות שהם יותר מ 2 קילו באורך גם לעבוד היטב מצוינות. בדיקות קצרות יותר יכולות לעבוד אם RNA היעד הוא בשפע, אך בדיקות כבר תיתן לי בצביעת אטר. יש לא נראה כל יתרון ברור בשימוש בעיכול בסיסי כדי לשבור את הבדיקות ארוכות יותר.
אכפת לי בטיפול הראשוני של העוברים הוא מאוד חשוב. הסרת מעטפת ההפריה היא מועילה במיוחד עבור עוברים לאחר סגירה לקפל עצבית ולפני הבקיעה טבעית ממעטפת ההפריה. במהלך התארכות של העובר בתוך מעטפת ההפריה, העובר הופך מסולסל ואם קבוע בעמדה ש, עובר קשה יותר לתמונה לאחר הכלאה באתר. עם זאת, אם את העוברים יוסרו ממעטפת ההפריה לפני הקיבעון, הם במהירות ליישר את. אם עוברים פגומים במהלך הסרת קרום, לאפשר להם לרפא את הפצע לפני הקיבעון כי רקמה פגומה עלולה לגרום כוזב באות הכלאה באתר באתר הפצע. אם קטן, לרפא את הפצעים במהירות רב, לעתים קרובות תוך דקות 19. מאוחר יותר צעדים יכול גם להזיק לעוברים duיש צורך בטיפול העברה ולכן נוזל טבעת כאשר שינוי פתרונות. נזק בשלבים מוקדמים בדרך כלל אומר שהעובר יהיה נפגע קשה בסוף ההליך ואזורים פגועים יגרמו כוזבים באותות באתר למראה הנזק. יתר על כן, יכולים להיות נחקרים עד 30 עוברים בבקבוקון אחד אבל עם יותר עוברים יש סיכוי גדול יותר של רקע גבוה לפתח במהלך תגובת colorimetric, אך להגדיל את שטיפות ביום 3 או שטיפת לילה יכול לפצות על זה.
בפרוטוקול זה, את מספר הצעדים צומצם והשימוש בכמה חומרים כימיים נפוצים כבר בוטל. שים לב כי פרוטוקול זה מבטל מספר צעדים שנמצאים בשימוש בפרוטוקולים רבים נוספים כולל עיכול K proteinase ושימוש באנהידריד אצטית לחסום קבוצות טעונות חיובי. צעדים אלה, עדיין עשויים להיות שימושיים כאשר מסתכלים על עוברי יונקים ועופות אך בשימוש Xenopus, יש ביטול צעדים אלה השפעה מועטת on התוצאות הסופיות של הכלאה באתר. המעבדה שלנו לא קבעה אם ניתן ליישם אותו ההפשטות הללו בפרוטוקולי הכלאה באתר למינים אחרים. עיכול proteinase K בפרט, עדיין עשוי להידרש בעוברים אחרים כגון חומוס או עכבר שבו חדירת בדיקה עלולה להיות מגבלות רבות יותר.
השימוש במצע סגול BM הוא נוח ואמין. עם זאת, יש מספר אפשרויות אחרות זמינים עבור מזרזים, מצעי אלקליין צבע הנדרשים לתהליך הלוקליזציה של RNA היעד בעובר. בפרט, שילוב של NBT / BCIP משמש בדרך כלל 4 ועובד היטב. ריאגנטים צבע חלקם מסיסים במתנול, ובמקרה זה, השימוש במתנול לאחר הצביעה יבטל את הכתם ויש להימנע. שילובי צבעים אחרים יכולים לשמש גם בעת ביצוע כפול במנח. השימוש בשילוב דומה (NBT / BCIP במקום BM סגול) גם הוכחלהיות מאוד חזק בעת שימוש בעוברי עכברים 20. הצבע הכחול של הצביעה ופיגמנט אנדוגני של העובר הם לעתים קרובות קשים להבחין בתמונות באופן ברור. שימוש בעוברים לבקן גם יבטלו פיגמנט אבל פתרון ההלבנה יעיל כמעט באותה, והוא הרבה יותר נוח כפי שהוא אינו דורש התחזוקה של מבוגרים לבקן לרבייה. אם הכתמים הוא חלשים יחסית, הלבנה חזקה יכולה להדגיש מכתים ש. אם הכתמים הוא חזקים, והותיר חלק מפיגמנט אור יכול להיות ניגוד יעיל וגם לעזור עם מכוון וביים את העובר.
לאחר ההכלאה בין לילה בבדיקת RNA, הפרוטוקול יכול לסטות מהפרוטוקול הידני בהחלט המתואר כאן לשימוש ברובוט בכלאה באתר. השימוש ברובוט בכלאה באתר חוסך כמעט יום שלם כימים שני ויום שלישי לפרוטוקול הידני יכול להיות מופחת ליום אחד כרובוט עובד כל הלילהד יכול לעשות את כל שינויי הטמפרטורה המתאימים. הרובוט גם הוא מאוד עקבי בתוצאותיה ובו זמנית מאפשר חיטוט של דגימות רבות ביעילות. הוא נשאר יתרון לעשות ביום הראשון בעבודת יד כמו שמאפשר לשימוש חוזר של בדיקות ושימוש בכמויות קטנות יותר של מגיב. החסרון המשמעותי היחיד של שימוש ברובוט הוא את העלות הראשונית של המכשיר.
פרוטוקול זה דן בכמה הדרכים יעילות תמונת הכלאה באתר. חשוב לעשות זאת כמה שיותר המידע יכול ללכת לאיבוד אם התמונה היא עניה. במקרים רבים, הדמיה של באתר התוצאות של ניסוי דורשת באותו זמן כמו הניסוי הראשוני. יש כמה אלמנטים של משתני ההליך כגון מידת הלבנת אלמנט של העדפה אישית. ניתן להשיג אפקטי הדמיה אחרים על ידי הצבת את המנה על בסיס צבע. לעתים קרובות צל כחול קל לאגר יכול להדגיש את הכתמים הכחולים העמוקים של בכפיפותהכלאה u. במילים פשוטות צלחת פטרי המכילה אגר על יריעת פלסטיק הכחול כדי לקבל את האפקט הרצוי.
עם זאת, השיטות שתוארו כאן לספק בסיס שעם לחקור אפשרויות הדמיה. ניתן לצפות בעוברים או פינו (שנעשה שקוף למבנים פנימיים לראות טובים יותר) או הבלתי מסולקת (נצפה כפי שהם מופיעים בתנאי תאורה רגילים). חלק מההחלטות בכל הקשור לאיך תמונת העובר תלוי באתר של ביטוי. אם הביטוי הוא על או בקרבת פני השטח של העובר, דרך טובה ביותר הוא תמונת העובר ללא סליקה. ישנם מספר יתרונות לשימוש בעוברים הבלתי מסולקת. התהליך של ניקוי העוברים דורש צעדים רבים והכימיקלים המשמשים כדי לנקות את העוברים הם קשה להתמודד. כמו כן, כמה חללים בעובר יאפשר משקעים של מצעי פוספט אלקליין שיכול לגרום לצביעת חלל שווא. בפרט, blastocoel של עוברים מוקדמים וpharynחלל גאל מציג לעתים קרובות מכתים (איור 4). הכתמת שווא זה לא נראה לעין בעוברים שאינם מסומנות. על פי רוב, אפילו מתון ביטוי עמוק יכול להיות דמיין בעוברים הבלתי מסולקת, כולל רקמות mesodermal כגון לב, כליות, וsomites, וMetall מטבל endodermal כגון בלוטת התריס וכבד. העברת העוברים דרך סדרת מתנול לאו מימה בPBS לצפייה או מתנול להכניס 100% לאחסון מאפשרת לסבבים רבים של אחסון והדמיה. אחסון מתנול מאפשר לנסות שינויים שונים להדמיה לאורך זמן ממושך.
יש כמה חסרונות לשימוש בטכניקת הכלאה באתר להסתכל על ביטוי גנים. רמות ביטוי אינן ניתנות לכימות בקפדנות אם כי השוואה בתוך עובר ושינויי ברוטו בהבעה ושינויים בגודל תחום ביטוי הן בדרך כלל ברורה. כמו בטכניקות מבוססות RNA אחרים, הוא אינו מספק כל מידע כto החלבונים המקודדים על ידי הגן של עניין, אשר יכול להגביל את הפרשנות של תוצאות. לבסוף, הוא לעתים קרובות קשה לקבוע מה יכול להיות מכתים רקע בהשוואה לתחום הביטוי האמיתי. הדבר נכון במיוחד בעיה עם גנים עם דפוס ביטוי ידוע שיכול להיות נפוצה. לעתים קרובות, בדיקה שנוצרה מגדיל התחושה של אותו הגן משמשת כביקורת מכתים שאינו ספציפי. שימוש בשליטת גדיל תחושה יכולה לספק קצת מידע לגבי בעיה עם ריאגנטים אבל זה אינו מספק ראיות מוחלטות שמכתים מבוססים על הבדיקה antisense הוא מדויק לחלוטין. תוצאות באתר הן בדרך כלל להפליא עקביות על פני עוברים כאשר עוברים מרובים משמשים וזה יכול לשמש כמדד לאמון בדפוס מכתים. כמו כן, בדיקות antisense שונות, שנוצרו מחלקים שונים של הגן, במיוחד אזורים מתורגמים, ניתן להשתמש בו כדי לראות אם הם נותנים את אותו דפוס מכתים. אם הם עושים זאת,הוא גם מספק ביטחון בדפוס מכתים ציין אם הוא זהה. גם בדיקות מדוללים ניתן להשתמש עם חשיפה ממושכת לפתרון מכתים כדי לראות אם אותו הדפוס מכתים עולה. גורם אחד שבדרך כלל מעורר אמון בדפוס מכתים הוא האם הדפוס שמתאים למבנה עוברי ספציפי. מספיק במנח עכשיו נעשה עם מגוון גדול של גנים שדפוסי ביטוי רומן צפויים אירועים נדירים יחסית. מסדי נתונים גדולים של בתמונות באתר כבר הקימו לאורגניזמים שונים שיכול לשמש כדי להשוות את תוצאות תמונה. לעוברי צפרדעים, Xenbase (www.xenbase.org) היא דוגמא מצוינת למשאב שניתן להשתמש כדי להבין דפוסי ביטוי. אורגניזמים מודל אחרים יש גם מאגרים דומים, נרחבים של תמונות.
למרות אזהרות הפוטנציאליות אלה, באתר הכלאה נשארה כלי רב עוצמה ואמין שהוא מאוד שימושי עבורהמחקר של organogenesis. זה צפוי להישאר שיטת הבחירה לזיהוי סוגי תאים ובחינת שינוי בתחומים ביטוי גנים לעתיד הנראה לעין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
