Protocol
1. Embryo Forberedelse
- Hvis det ikke gøres rutinemæssigt som en del af embryo kultur, de-gelé embryonerne hjælp af 2,5% cystein, pH 8,0 før fiksering 8. Selvom det ikke er absolut nødvendigt, er det nyttigt at derefter manuelt fjerne befrugtning kuvert før fiksering ved hjælp af fine pincet.
- Brug glas Pasteur-pipetter til at overføre embryoner. Pipetten er ikke bred nok til at overføre embryoner så brug en diamant pen til at skære glaspipette ved et punkt bred nok til at afhente et foster. Eliminere de skarpe kanter af pipetter efter opskæring ved hurtigt passerer snittet spids gennem flammen af en bunsenbrænder til at smelte de skarpe kanter.
BEMÆRK: Man skal være taget, da glasset kan stadig være varm nok til at forårsage forbrændinger, selv om det synes at have afkølet ved visuel inspektion.
- Brug glas Pasteur-pipetter til at overføre embryoner. Pipetten er ikke bred nok til at overføre embryoner så brug en diamant pen til at skære glaspipette ved et punkt bred nok til at afhente et foster. Eliminere de skarpe kanter af pipetter efter opskæring ved hurtigt passerer snittet spids gennem flammen af en bunsenbrænder til at smelte de skarpe kanter.
- Udfør embryo fiksering i etaper. Først forberede hætteglas til brug i embryo fiksering. Brug disse hætteglas for alle trin, herunder endeligopbevaring. Brug hætteglas, der er klare med en god Teflon tætning i låget, der giver mulighed for overvågning af embryoner på alle trin af processen. Mærk hætteglasset med passende eksperimentelle information ved hjælp af permanent markør og derefter dække mærkningen med klar tape, som endda permanent markør vil gå tabt i løbet af proceduren som følge af anvendelsen af alkoholer og andre opløsningsmidler.
- Brug Mempfa at fastsætte embryoner. Lav et lager af 8% paraformaldehyd i partier af 50-100 ml ad gangen. Brug ca. 75% af det krævede H2O og opvarm til 50-60 ° C, hvilket er nødvendigt for at få paraformaldehyd i opløsning.
BEMÆRK: Denne løsning er lidt anderledes end den Memfa bruges i ældre offentliggjort protokol versioner, idet den udnytter paraformaldehyd stedet formaldehyd. - Tilsæt 2-3 dråber 10N NaOH eller indtil pH er ca. 7,5 (brug pH-papir for at kontrollere pH). Paraformaldehyd er meget giftigt, derfor generere stamopløsningen i et stinkskab. Når paraformaldehyd i opløsning filtreres opløsningen gennem Whatman-papir i en frisk beholder og tilsæt H2O til det endelige volumen. Hvis det er nødvendigt, opbevares paraformaldehyd opløsning ved 4 ° C i 1-2 uger.
- Saml de resterende komponenter i Mempfa fiksering opløsning (tabel 1). Sørg for, at den endelige bearbejdning koncentration paraformaldehyd er 4%. Opbevar alle dele af fiksering opløsning ved 4 ° C som lager.
- Ved hjælp af en slebet glas pipette, fastsætte embryoner ved at tilføje embryonerne til de mærkede hætteglas, der er blevet fyldt med de ca. 3-4 ml Mempfa opløsning (tabel 1). Undgå fastsættelse mere end 20-30 embryoner pr hætteglas. Tilsæt embryoner med et minimum af væskeoverførsel fra embryonet medium. Fix embryoner i Mempfa opløsning i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- For sent endoderm strukturer udfører i situs manuelt isolerede gut og endoderm derivater 9,10, Hvilket tillader god indtrængning af sonden og også undgår hulrum farvning.
- Opbevar en opløsning af 100% methanol ved -20 ° C. Efter paraformaldehydfiksering, erstatte Mempfa opløsning med ca. 4 ml af -20 ° C, 100% methanol til opbevaring af embryoner.
- Swirl hætteglassene efter tilsætning af methanol for at forhindre embryoner klistrer til glas eller andre embryoner. Sørg også hætteglassene tæt lukket, fordi methanol kan fordampe i fryseren over tid, hvis løs.
BEMÆRK: Embryoner kan opbevares i mindst et år, og sandsynligvis længere, i methanol før farvning uden tab af in situ hybridisering kvalitet.
- Brug Mempfa at fastsætte embryoner. Lav et lager af 8% paraformaldehyd i partier af 50-100 ml ad gangen. Brug ca. 75% af det krævede H2O og opvarm til 50-60 ° C, hvilket er nødvendigt for at få paraformaldehyd i opløsning.
2. Probe Forberedelse
- Brug 1-2 ug template-DNA for at gøre digoxigenin-mærkede prober. Skær plasmid indeholdende den passende DNA-sekvens i 5'-enden af genet af interesse med et restriktionsenzym egnet til that vektor at frembringe antisense-prober.
BEMÆRK: Plasmidet bør have en passende RNA-polymerase-bindingssted (f.eks T7, T3 eller SP6). - Lad DNA, vand, NTP mix og polymerase buffer til at opvarme til stuetemperatur før montering sonden syntesereaktionen. Tilsæt bestanddele af RNA-syntese reaktion på en 1,5 ml mikrocentrifugerør i den rækkefølge som anført i tabel 2. Juster den mængde vand tilsættes for at bringe det samlede volumen af sonden syntese reaktion til 20 pi. Saml reaktionen ved stuetemperatur, fordi dele af polymerase buffer kan udfælde template DNA, når i høje koncentrationer og koldt.
- Inkubér transkriptionsreaktion i 2 timer ved 37 ° C.
BEMÆRK: Inkuberinger på lidt længere end to timer fører til nogen bivirkninger, men også vise lidt forøget udbytte. Hvis inkuberet i en time, vil udbyttet blive reduceret, men stadig tilstrækkelig til at gøre en god probe.- Mens de venter transkriptionsreaktion til slut, at en agarosegel, der vil blive anvendt til at teste kvaliteten af probe. Smelt 1 ug agarose i 100 ml 1x TAE buffer (se tabel 1) ved opvarmning af opløsningen til kogepunktet. Fjern opløsningen fra varme, når agarose pulveret er fuldstændigt opløst.
- Tilsæt 2 pi ethidiumbromid stamopløsning (10 mg / ml) til ca. 100 ml agarosegel når agarose er afkølet til ca. 60 ° C for at tillade visualisering af RNA under ultraviolet (UV) lys.
BEMÆRK: Denne agarosegel opløsning kan opbevares i en 60 ° C inkubator, således at fremtidige geler kan hældes uden gentagen smeltning. Vær forsigtig ved håndtering af ethidiumbromid grundet potentielle toksicitet.
- Tilsæt 1 pi DNAseI (RNase-frit kvalitet) til transkription reaktion efter 2 timers inkubation og inkuberes i yderligere 10 minutter ved 37 ° C for at fjerne template-DNA.
- Fjern 1 pi af reaktionsblandingen tilkontrollere 1% agarose-TAE-gel og til resten (20 pi) tilsættes 80 pi 1% SDS i TE-buffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), 10 pi 5M NH4-acetat, og 220 pi kold ethanol. Vortex mix kraftigt og afsat på is indtil resultaterne af RNA kvalitetskontrol er kendt.
- Kør 1 pi RNA fjernes før udfældning på 1% agarose-TAE gel. For at lette læsning på gelen tilsættes 4-5 pi vand og 1 pi standard ladningsfarvestof til RNA. Se RNA på gelen ved hjælp af et UV-lys transilluminator for at kontrollere kvaliteten af probe (se diskussion).
- Udfældning af resterende RNA, som blev afsat på is i trin 2.5 ved spinding i en mikrocentrifuge ved fuld hastighed i 10 til 15 min. Tegn fra supernatanten med en trukket ud glaspipette og lad det kort tørre.
- Resuspender probe med 1 ml af RNA hybridiseringspuffer (tabel 1) i Eppendorf-rør. Vortex og briefly opvarme røret til 37 ° C og vortex igen. Overfør sonden løsning på en 15 ml skruelåg polystyrenrør og fyld til 7-10 ml med RNA hybridisering buffer. Bemærk: Sonden kan fortyndes yderligere (en 10 gange yderligere fortynding kan stadig arbejde) ofte resulterer i lav baggrund, men farvning reaktioner vil også tage længere tid.
3. In situ-hybridisering
- Tag embryoner, der blev gemt i -20 ° C methanol og tillade at opvarme til stuetemperatur. Udfør hele proceduren i hætteglas. Hvis der er forskellige embryoner fra den ene gruppe vil blive set på af forskellige prober, holde dem i et enkelt hætteglas indtil lige før indsættes sonder til at reducere variation og arbejdskraft på den første dag.
- Rehydrere embryoner gennem en methanol serie som vist i tabel 3 (se tabel 1 for vask opskrifter) som forberedelse til tilsætning af proben. Vend forsigtigt den Embryos efter hver ændring for at sikre, at de ikke klæber til siderne eller hinanden, og rock embryoner ved at montere hætteglassene på en nutator. Ved overførsel af væskerne, kontrollere indersiden af hætterne at sikre, at embryonerne ikke er blevet fanget der.
- Når i probeopløsning, hybridiserer embryoner natten over som beskrevet i tabel 3.
- Fjern sonden opløsning. Gem den anvendte probe ved opbevaring i et 15 ml skruelåg polystyrenrør mærket med dato og antal gange proben er blevet anvendt, ved -20 ° C.
BEMÆRK: Den samme probe kan genbruges mange gange til efterfølgende in situ hybridiseringer indtil de kolorimetriske reaktioner begynder at tage en usædvanlig lang tid at nå den ønskede intensitet.- Når sonden er fjernet, forberede embryoner til antistoffarvning mod sonden gennem rækken af vaske skitseret i tabel 4. Ændre temperaturen efter behov (tabel 4) ved at flytte than nutator, med hætteglas med embryoner, der er knyttet, direkte i hybridiserings ovne, der er indstillet til den rette temperatur.
- Der fyldes op til passende volumen af MAB + HTSS + BR + anti-Dig-antistof (tabel 4) på det tidspunkt, at embryonerne bliver inkuberes i MAB + HTSS + BR blokerende opløsning, således at antistoffet er blokeret før tilsætning til embryoner. Gør de blokerende løsninger frisk på dagen for brug.
- Fjern antistofopløsning og begynde vaske som beskrevet i tabel 5 efter inkubation natten over med antistof. Udføre mindst tolv 30 minutters vaske med henblik på at forberede sig til farvning med alkalisk phosphatase-substrat og reducere baggrunden så meget som muligt. Brug enten MAB buffer eller TBT-opløsning (tabel 1) for vasketrinene.
BEMÆRK: TBT løsning er TTW der har 2 mg / ml BSA tilsat.- Udskift den sidste vask løsning med BM Purple alkalisk phosphatase substrat. Udfør farvning reaktion ved enten stuetemperatur eller 37 ° C.
BEMÆRK: Farvning er hurtigere ved 37 ° C, men hvis venstre natten kan uacceptabel baggrundsfarvning ofte være et resultat. De farvning reaktioner vil ofte kræver indlæggelse farvning og rumtemperaturen er sikrest for dette. - Hvis yderligere farvning er påkrævet, og det BM lilla løsning tager på en blå farve, skal du udskifte farvning løsning med frisk BM Purple og sætte rør i 37 ° C. Hvis målet mRNA er meget rigelig, sætte embryonerne i farvning opløsning ved 4 ° C natten over og derefter flytte embryoner til stuetemperatur eller 37 ° C for at muliggøre en bedre overvågning af farvning reaktion.
- Overvåg nye reaktioner omhyggeligt, da tiden til slutresultatet varierer betydeligt mellem de forskellige mål-RNA'er. For konsistens, farvningen af neglene (se 3.4), når der ikke er nye steder udtryksformer opstår med længere inkubation. Vigtigere er det, hvis in situ-hybridisering anvendes som et assaytil eksperimenter ser på forskellige behandlingsgrupper, bruge den samme tid for farvereaktioner mellem behandling og kontrol embryoner.
- Udskift den sidste vask løsning med BM Purple alkalisk phosphatase substrat. Udfør farvning reaktion ved enten stuetemperatur eller 37 ° C.
- Stop farvning reaktion og forberede embryoner til opbevaring og billedoptagelse ved at ændre væsker som skitseret i tabel 6. Vrik ikke fostrene på dette tidspunkt, fordi fjernelsen af pletten kan visualiseres som lilla farvning af methanol omkring embryoner.
BEMÆRK: Ofte embryoner har en lyseblå farvning fra farvningsopløsning og kold methanol kan i det mindste delvis fjerne, at selv om dette ikke er tilstrækkeligt til at fjerne tunge baggrund eller hulrum farvning. Kold methanol refererer til methanol, der holdes i en -20 ° C fryser.- Rehydrere embryoner og fastsætte pletten med Mempfa (tabel 6). Når fast, fjernes Mempfa og vaske embryoner med 25% methanol.
- Fjern 25% methanol og tilsæt blegningsopløsningen, hvis fjernelsen af endogent pigmenter påkrævet. Vær forsigtig ved håndtering af blegning løsning, da det kan forårsage forbrændinger. Observer blegning tæt som det sker relativt hurtigt og graden af blegning kan varieres for forskellige effekter (figur 2).
- Dehydrer embryoner gennem en methanol serie til 100% methanol til langtidsopbevaring efter blegning, eller overførsel til PBS til kortvarig opbevaring og efterfølgende billeddannelse (se tabel 6).
4. Imaging Embryoner
- Når et foster har afsluttet farvning proces, image embryoet så oplysningerne om, hvor genet af interesse udtrykkes indfanges for et bredere publikum. Brug 1% agarose som baggrund for at se afstemte embryoner.
BEMÆRK: agarose giver en blå / grå baggrund, der kontrasterer godt med embryonet og den blå farve farvningsreaktion. Det hjælper også diffus distraherende skygger og refleksioner, der aflede opmærksomheden fra embryonet.- Føj agarose til vand og derefter bring i kog, indtil agarose er i opløsning, og derefter lad afkøle til 50 før hælde i petriskål. Som med TAE gelopløsning Opbevar agarose opløsning i 55 ° C inkubator til flere anvendelser. Hæld agarose til en dybde på ca. 2 mm i petriskålen. Hvis det er nødvendigt, at justere dybden af agarose til opnåelse af en lidt anderledes nuance baggrund.
- Efter rehydrering fra lager i methanol til en vandig opløsning (PBS eller TTW), anvendelse af en methanol-serien, placere embryoner i en petriskål med agarose base (se tabel 6). Opløsningen opbevares rent og om nødvendigt bruge enkle filtrering for at fjerne små partikler, der kan forstyrre den rene baggrund af gode billeder.
- Til billede embryoner fra alternative synspunkter, såsom fra den ventrale side, skæres tynde kanaler i agarose til at passe embryo med fin pincet og placere embryoner i disse kanaler til orientering (figur 3 BEMÆRK: De fleste faser har en karakteristisk stilling at de antager, når den anbringes i opløsning. For eksempel blastula-embryoer tendens til at sidde dyr opad. Når embryonerne begynder at aflang, de lå på deres side.
- Brug fiberoptiske lyskilde til at belyse embryo fra en flad vinkel, skabe skygger på embryoet, som giver dybde til billedet og hjælper skelne overfladestrukturer. Fordi blegning kan fjerne pigment, der giver nyttige vartegn, brug skygger for stærkt bleget embryoner.
- Fjern de embryoner til billedet farvning, der er dybt i embryonet, såsom i rygstrengen, lunge eller regioner af hjernen (figur 4). For at opnå dette, satte embryoner gennem en methanol serie indtil i 100% methanol.
- Efter fuldstændig nedsænkning i methanol, overføre embryoner til en opløsning af én del benzylalkohol og to dele benzyl værenzoate (Babb). Embryonerne vil i første omgang flyde på overfladen, men som methanol blander sig med Babb, vil de synke ned i Babb. Udfør hvert skridt beskæftiger sig med Babb i hætteglas eller skåle; Babb smelter enhver plast eller maling.
- Når ryddet, se embryoner med transmitteret lys, der kommer nedefra embryoet. Justere intensiteten af lyset såvel som nedefra for at forbedre kontrasten og give den bedste farve.
- Når set ryddet embryoner hæve glas petriskål ud af basen. Gør dette ved blot at bruge to andre petriskål låg til at hæve den, så den region i fad med embryoner er forhøjet.
BEMÆRK: Dette har den fordel, at bunden af fokus og fjerne distraherende effekter fra ufuldkommenheder eller pletter på mikroskopet base, der kan forstyrre billedet.
5. Dobbeltklik in situ-hybridisering
- For samtidigt at se ekspressionsmønster TWo forskellige gener i en enkelt embryo, syntetisere to prober, en for hver af de forskellige gener. Syntetisere en probe under anvendelse af DIG-11-UTP, som en etiket som beskrevet ovenfor. Fortyndes produktet af transkriptionsreaktion i RNA-hybridisering buffer til opnåelse af en 3 x mere koncentreret probe end anvendes til single in situ hybridiseringer.
- Syntetisere anden probe af interesse ved anvendelse af den samme protokol som for DIG mærkede probes bortset fra at fluorescein-12-UTP skal erstattes DIG-11-UTP. Fortyndes produktet af transkriptionsreaktion i RNA-hybridisering buffer til opnåelse af en 3 x mere koncentreret probe end anvendes til single in situ hybridiseringer.
- Bland de to koncentrerede prober i et 1: 1 forhold. For de bedste resultater, skal du bruge fluorescein-mærket probe for det gen, der viser den stærkeste udtryk i det indre in situ hybridisering protokol.
- Brug samme in situ hybridisering protokollen beskrevet for enkelt in situ </ Em> hybridiseringer, bortset bruge dobbelt probe (probe indeholdende 1.5x koncentreret blanding af digoxigenin-mærket og fluorescein-mærkede prober) ved slutningen af den første dag i stedet for en enkelt in situ-hybridiseringsprobe.
- Følg enkelt hybridisering protokol på andendagen af den dobbelte in situ hybridisering protokol, undtagen brug anti-fluorescein-AP Fab-fragmenter ved en 1: 4.000 fortynding i stedet for anti-DIG-AP Fab-fragmenter. Skyl den overskydende antistof fra embryonet som i single in situ-protokol og udføre den første farvereaktion ved hjælp af BM-Purple AP-substrat.
- Efter den første farvereaktion, inaktivere flourescein antistof i 0,1 M glycin pH 2,0 i 40 min efterfulgt af fem ti minutters vaske i MAB. Bloker embryonerne i MAB + HTSS + BR i 90 min. Tilsæt anti-DIG-antistof ved en 1: 2.000 fortynding i MAB + HTSS + BR og inkuberes ved 4 ° C natten over.
- Den følgende dag, vaske embryoner thoroughly i MAB (12 vaske af 30 min) for at fjerne overskydende antistof.
- Vask embryoner i 10 minutter i AP Buffer (tabel 1) og derefter pletten med BCIP (0,5 mg / ml i AP Buffer).
BEMÆRK: in situ kombination bør give en mørk blå-lilla plet for første farvereaktion og en lys blå farve reaktion til den anden (figur 5). - Stop endelige farvereaktion ved at fjerne AP puffer og skylles tre gange med mAb. Fastgør embryoner med Mempfa i 10 min. Vask embryoner med 5 hurtige vaske i MAB eller TBT.
- Med denne farvekombination, anvendelse af methanol i post farvning behandlinger ikke længere er muligt, da det vil fjerne BCIP alene farve. Opbevar embryoner efter farvning og fiksering i PBS med 0,02% natriumazid. Farvningsintensitet kan være svag med dobbelt i situs. Hvis dette er et problem, reducere vaskene til fire, idet hver af 2 timer varighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brugen af væv specifikke prober kan give fremragende oplysninger med hensyn til status for udviklingen for specifikke organer. I de følgende eksempler, er den fase af embryonet baseret på Nieuwkoop og Faber fasetabel 11. Hvis man bruger sonder danner gener udtrykt efter differentiering, kardial troponin I ved trin 28-30, for eksempel (figur 1C), tilstedeværelsen eller størrelsen af en differentieret organ kan vurderes på noget tidspunkt efter differentiering. År siden, embryologer kunne gøre sådan analyse baseret på bemærkelsesværdig viden om histologi af den tidlige embryo 12,13 men denne ekspertise har været stort set tabt for den nuværende generation af embryologer. Selv kan tabet af denne ekspertise anses beklageligt, pålidelighed og brugervenlighed af in situ hybridiseringsteknikker gør identifikation af specifikke væv til rådighed for enhver forsker. Væv, der er relativt upåfaldende, than klækning kirtel på fosterstadiet 25 for eksempel (figur 1A), kan tydeligt mærkes ved brug i situs uden behov for specifikke antistoffer eller histologiske teknikker (figur 1C). Også anvendelsen af hele holderen i situs gør det muligt at se hele organet i forbindelse med hele embryo snarere end at lægge følgeslutning fra histologiske sektioner (Figur 2). Selv væv, der er dybt i embryonet, herunder den optiske stilk (Figur 4) kan ses let, og anvendelsen af embryo clearing kan give skarpe afgrænsning af orgel grænser.
Blegning af embryoner til at fjerne endogene pigment hjælp peroxid-løsninger har stort set elimineret kravet om at bruge albino embryoner, der mangler pigment. Blegning til forskellige tider kan være nyttige. For eksempel, hvis pletten er stærk, en lighter blegning, der giver mulighed for nogle pigmentering ses kan være nyttigt, fordi det heleOWS for bedre iscenesættelse og orientering af embryoet (figur 2A). Men hvis pletten er et område, hvor der er høje niveauer af pigmentering, såsom nyren (figur 2B), nær fuldstændig eliminering af pigmentet efter længere inkubation i den blegende opløsning giver et bedre resultat.
Embryoner tendens til at tage op bestemte positioner, når i opløsning. Efter neurulation, har de en tendens til at lægge fladt på deres sider. Det er fint for billeder af flanken (figur 2B), men kan være et problem med andre områder. Anvendelse af en agarose basen gør det muligt at skære kanaler ind i agarose, der kan bruge til at orientere embryoner. For eksempel er blod forstadier lokaliseret til den ventrale side af embryo (figur 2A) og det fulde omfang af farvningen er svært at observere. Positionering af embryo i en kanal med den ventrale side op, så giver mulighed for fuld visning af at genekspression mønster (figur 3A). Anvendelsen af dobbelt in situ hybridisering kan vise forholdet mellem to genekspressionsmønstre inden for en enkelt organisme (figur 5) eliminerer nødvendigheden af at sammenligne mellem forskellige embryoner, som kan have små forskelle i morfologi. Måske vigtigst, anvendelsen af in situ hybridisering giver én mulighed for at klart markere celler før rydde histologisk differentiering baseret på ekspressionen af gener, som udtrykkes i tidlige stamfædre til en slægt, såsom Pax2, der udtrykkes i mange væv i tidlige embryon, før differentiering (figur 4A). Evnen til at identificere forfædre og væv, der ikke klart skelnes baseret på histologi, såsom myeloide celleforstadier (figur 1B), har gjort det muligt for forskerne at spørge meget mere detaljerede spørgsmål om tilstanden af et organ udvikling og også at vurdere resultaterne af eksperimentelle manipulation formål at forårsage ektopisk differentiering af et væv.
Figur 1:. Eksempler på hele mount in situ hybridisering på Xenopus embryoner Den blå farvning af en in situ hybridisering eksperiment kan tydeligt afgrænse udvikling af strukturer i det tidlige Xenopus embryo (A) en forreste af en fase 26 embryo fremhæve udrugning kirtel. som afgrænset ved ekspression af uvs.2 14 (B) en ventral afbildning af en embryoner, der viser placeringen af tidlige myeloide celler i trin 20 ved hjælp af ekspression af myeloperoxidase 15 som en markør (C) Den tidlige hjerte i trin 28.. - 30 visualiseres ved ekspression af kardial troponin I 16. En klar fordel ved denne metode er, at alledisse genekspressionsmønstre blev visualiseret ved hjælp af forskellige prober, men den anvendte protokol er identisk i alle tilfælde. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: Forskellige blegning kan anvendes til at visualisere farvning i embryo (A) Denne blåfarvning langs bunden af denne embryo viser ekspressionen af hæmoglobin i de ventrale blodøer ved ca. trin 36. Dette er en region af. embryo, der kun let pigmenterede og dermed embryonet blev bleget i lang tid, som det kan ses af tan farvede pigment i øjet og langs flanken af embryoet. At kunne se pigmenteringen giver mulighed for bedre visualisering af den fase af embryo. Hvis farvningen er i et område med større naturlig pigmentering, såsom nervesystemet og flanken af embryonet, vil større blegning hjælpe vist in situ, som det ses i B. (B) Her ekspressionen af pax8 17 i dannelse nyre , pronephric kanal og baghjerne bedst visualiseres efter blegning har fjernet næsten alle endogene pigment. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Manipulation af agarose basen kan hjælpe med orientering af embryonerne Imaging specifikke regioner i embryo kan være vanskeligt, fordi de har tendens til at optage bestemte positioner i skålen (A) ved haletudse faser embryonet vil ligge på sin side.. . Ved cutTing et fint kanal i agarose (sorte pile) embryonet kan ses fra den ventrale side, her viser hæmoglobin ekspression i trin 36, med tilstrækkelig stabilitet til at fange et godt image. (b) Denne ventrale visning af hand1 ekspression på trin 20 skitserer den laterale plade mesoderm 6. Den embryo er placeret i et lille hul, der stabiliserede sin position med den ventrale side op. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4:. Indre organer kan ses i både uigennemsigtige, uncleared og i ryddet embryoner I en ikke afstemte embryo farvet for Pax2 på trin 34 (A), den optiske stilk (gul pil) kan visualiseres relativt letsom kan farvningen ned neuralrøret. Men detaljer er ikke skarpe. Ved at rydde embryo (B) grænserne for udtryk sites, herunder den optiske stilk (gul pil) er skarpere. Omfanget af clearing er vist ved evnen til at se begge øjne i denne ryddet foster. Bemærk også, at nogle farvning har akkumuleret i de interne hulrum (lilla pil) et fælles problem, når du ser ryddet embryoner.
Figur 5:. Et repræsentativt dobbelt in situ hybridisering på en Xenopus embryo Ekspression af den laterale plade markering, hand1 er visualiseret ved lyseblå farvning i trin 26. Ekspression af etv2 i udviklingslandene vaskulatur visualiseres ved mørkeblå lilla plet. Ekspression af hand1 er normalt meget intens og det blev således anvendt til than svagere fluorescein-mærket probe og BCIP kombination. Den udnyttede den digoxigenin-mærkede probe og BM-lilla kombination til svagere etv2 ekspression.
| Navn | Slutkoncentration | Beløb / 100 ml |
| Mempfa | 1 mM MgSO4 | 100 pi 1 M MgSO4 |
| (Opbevares ved 4 ° C) | 2 mM EGTA, pH 8,0 | 10 ml 20 mM EGTA, pH 8,0 |
| 0,1 M MOPS, pH 7,5 | 10 ml 1 M MOPS, pH 7,5 | |
| 4% paraformaldehyd, pH 7,5 | 50 ml 8% paraformaldehyd, pH 7,5 | |
| TTW | 50 mM Tris, pH 7,4 | 5 ml 1 M Tris, pH 7,4 |
| 200 mM NaCl | 4 ml 5 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 pi Tween 20 | |
| 100X Denhardts opløsning | 2% BSA | 2 g BSA |
| (Filtreres gennem 0,2 um filter, | 2% PVP-40 | 2 g PVP-40 |
| opbevares ved -20 ° C) | 2% Ficoll 400 | 2 g Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M NaCl | 17,5 g NaCl |
| 300 mM trinatriumcitrat | 8,8 g trinatriumcitrat | |
| RNA hybridiseringsbuffer | 50% formamid | 50 ml 100% formamid |
| (Opbevares ved 4 ° C) | 5x SSC | 25 ml 20x SSC |
| 1 mg / ml gær-RNA | 4 ml 1 mg / ml gær-RNA opløst i 50% formamid | |
| 1X Denhardts opløsning | 1 ml 100x Denhardts opløsning | |
| 0,1% Tween 20 | 100 pi Tween 20 | |
| 5 mM EDTA, pH 8,0 | 1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 | |
| MAB | 100 mM maleinsyre | 1,16 g maleinsyre |
| (PH 7,5, opbevares ved 4 ° C) | 150 mM NaCl | 0,88 g NaCl |
| MAB + HTSS + BR | 100 mM maleinsyre | 96 ml MAB |
| 4% varmebehandlet fåreserum | 4 ml af varmebehandlede fåreserum (varmebehandlet ved 55 ° C i 30 minutter og alikvoteret) | |
| 2% blokeringsreagens | 2 g Roche Blokering Reagent | |
| MAB + HTSS + BR + anti-Dig-antistof | 100 mM maleinsyre | 96 ml MAB |
| 4% Heat Treated fåreserum | 4 ml af varmebehandlede fåreserum | |
| 2% blokeringsreagens | 2 g Roche Blokering Reagent | |
| 1: 10.000 Anti-Dig-AP, Fab-fragmenter Antibody | 1,5 pi Anti-digoxygenin-AP, Fab-fragmenter Antibody | |
| Alkalisk phosphatase (AP) Buffer | 100 mM Tris, pH 9,5 | 10 ml 1 M Tris, pH 9,5 |
| 50 mM MgCl2 | 5 ml 1 M MgCl2 | |
| 100 mM NaCI | 2,5 ml 4 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 pi Tween 20 | |
| Blegende opløsning | 0,3% H 2 O 2 | 3,34 ml 30% H 2 O 2 |
| 5% formamid | 5 ml 100% formamid | |
| 0,5% SSC | 2,5 ml 20x SSC | |
| Clearing Solution | 1/3 Benzylalkohol | 33 ml |
| 2/3 benzylbenzoat | 67 ml |
Tabel 1: Solution Opskrifter
| Navn | Beløb |
| Dig-NTP Mix | 5 pi 20 mM CTP |
| (40 pi reaktion) | 5 pi 20 mM GTP |
| 5 pi af 20 mM ATP | |
| 3,25 pi 20 mM UTP | |
| 3,5 pi 10 mM Dig-11-UTP | |
| 18,25 pi destilleret, autoklaveret vand | |
| Probesyntese | x pi template-DNA(Afhængig af koncentrationen) |
| (20 pi reaktion) | x pi destilleret, autoklaveret vand |
| 4 pi Dig-NTP mix | |
| 0,5 pi RNAse inhibitor | |
| 2 pi 10X RNA-polymerase-buffer | |
| 2 pi af RNA-polymerase |
Tabel 2: probesyntese Opskrifter
| Navnet paa reagenset | Anslået Volume | Varighed | Temperatur |
| 100% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 50% methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, vuggende | Stuetemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, vuggende | Stuetemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, vuggende | Stuetemperatur |
| Pre-varm RNA hybridiseringsbuffer og probe til 65 ° C | |||
| TTW | 4 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| TTW | 4 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| RNA hybridiseringsbuffer | 2 ml | 10 min, vuggende | Room Temperature |
| Forvarmet RNA hybridiseringsbuffer | 2 ml | 1 time, vuggende | 65 ° C |
| Probeopløsning | 1 ml | Overnight, vuggende | 65 ° C |
Tabel 3: Skridt til første dag i in situ-hybridisering Protocol (ca. 3 timer i alt)
| Navnet paa reagenset | Anslået Volume | Varighed | Temperatur | ||||
| Pre-varm RNA hybridiseringsbuffer og 02.x SSC til 65 ° C og 2 x SSC til 37 ° C | |||||||
| Sonde løsning Retur til rør til gentagen brug | |||||||
| RNA hybridiseringsbuffer | 2 ml | 10 min, vuggende | 65 ° C | 2X SSC | 2 ml | 20 min, vuggende | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 ml | 20 min, vuggende | 37 ° C | ||||
| 0,2X SSC | 4 ml | 1 time, vuggende | 65 ° C | ||||
| 0,2X SSC | 4 ml | 1 time, vuggende | 65 ° C | ||||
| MAB + HTSS + BR | 1,5 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur | ||||
| MAB + HTSS + BR + anti-DIG-antistof | 1,5 ml | Overnight, vuggende | 4 ° C |
Tabel 4: Trin for anden dag i in situ-hybridisering Protocol (omkring 4 timer i alt)
| Navnet paa reagenset | Anslået Volume | Varighed | Temperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| BM Purple AP Substrat | 500-750 pi | Overnight, vuggende (se tekst) | Stuetemperatur / 37 ° C (se tekst) |
Tabel 5: Trin for tredje dag i in situ-hybridisering Protocol (ca. 7 timer)
| Navnet paa reagenset | Anslået Volume | Varighed | Temperatur |
| 25% Methanol | 2 ml 5 min, vuggende | Stuetemperatur | |
| 50% methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 100% Methanol (kold) | 2 ml | 20 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 100% Methanol (kold) | 2 ml | Varierer, ingen rocking | Stuetemperatur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 50% methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| Mempfa | 2 ml | 30 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| Blegende opløsning | 4 ml | 40 min-3 timer, vuggende | Stuetemperatur / 37 ° C (se tekst) |
| Opbevaring af embryoner | |||
| 25% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 50% methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 75% Methanol | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 100% Methanol | 4 ml | Opbevares ved -20 ° C | |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
| 1x PBS | 2 ml | 5 min, vuggende | Stuetemperatur |
Tabel 6: Trin til Stop in situ hybridisering Blegning og opbevaring af embryoner
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til at anvende in situ-hybridisering til at visualisere ekspressionsmønster af specifikke gener er den mest almindeligt anvendte metode til at identificere specifikke organer eller celletyper i Xenopus embryo. Dette er på grund af en række fordele, der tilbydes ved denne teknik. Ekspressionen af et gen kan identificere specifikke strukturer længe før nogen histologiske tegn på differentiering, såsom tilfældet for Nkx2.5 ekspression i hjertet stamfædre før nogen klar afgrænsning af de celler 18. Når alle reagenserne er i hånden, er det også meget omkostningseffektiv. Generering af mange individuelle prober, som effektivt kan genbruges, er muligt med lidt ekstra tid og omkostninger investeringer end opnåelse af plasmider, der koder for gener af interesse. Det er vores erfaring, kan prober genbruges i årevis med lille tab i aktivitet på trods af de uundgåelige små fortyndinger, der kommer med hver brug. Endelig er der ikke meget optimering vandskravenerød, når man bruger forskellige prober.
Kvaliteten af sonden syntese er en afgørende faktor for succes af protokollen. Der er mange måder at kontrollere kvaliteten af RNA-proben, men blot kører RNA-probe på en TAE gel er en hurtig og nem metode, der er helt pålidelige. Vi bruger rutinemæssigt ethidiumbromid til at farve RNA og det kræver særlig håndtering og bortskaffelse af gelerne, som de fleste institutioner. Ikke-toksiske alternativer er kommercielt tilgængelige, selv om vi ikke specifikt har sammenlignet dem til visualisering prober. Sonden skal køre som et enkelt bånd selv om det vil være lidt fuzzy sammenlignet med DNA på en TAE gel. Et estimat af den mængde RNA kan opnås: en god reaktion vil have ca. 1 pg / pl af RNA. En let visualiseret bånd vil udgøre mindst 0,5 ug af RNA og en lys band vil repræsentere over 1 ug. Selvom klart ikke helt præcis og kræver nogen erfaring, kvantificering baseret på gelen rapid og robustheden af den in situ procedure gør det muligt at fungere godt. Hvis der er bekymring repeterbarhed, kan man nemt bruge UV-absorbans at kvantificere en lille mængde af transkription reaktion, selv om vi ikke har fundet dette som et stort problem. Endelig gelen gør det muligt at se, om template DNA er blevet elimineret. Hvis gelen viser, at der ikke er RNA, de to sandsynlige forklaringer er en dårlig DNA-template, eller at transcription buffer ikke fungerer godt. Opvarmning af transskription buffer til 37 ° C og grundig blanding før brug, eller tilsætning af 1 ml af frisk 100 mM DTT til transkription reaktion kan lejlighedsvis hjælpe med sidstnævnte. En vigtig komponent i transkription reaktionsbuffer er spermidin og det kan præcipitere DNA-template ved lave temperaturer gør opvarmning af bufferen vigtig. DTT i bufferen kan også udfældes væsentligt inhibere reaktionen. Hvis et præcipitat ses i bufferen, opvarme opløsningen ogvortex kraftigt. Der er ikke behov for at tage usædvanlige forholdsregler, såsom at behandle vandet med DEPC eller autoklavering tips og slanger, for at forhindre RNase-aktivitet. Tilstedeværelsen af den kommercielle ribonucleaseinhibitor giver betydelig beskyttelse mod RNAser fra miljøet. Bemærk, at andre UTP etiketter kan anvendes, såsom fluorescein, selv i vores erfaring, digoxigenin-mærket UTP og anti-digoxigenin antistof kombination giver de mest ensartede resultater.
Tidlige protokoller for probe generation tyder på, at basisk hydrolyse af de syntetiserede prober bør gøres 4 med henblik på at give mulighed for større probe penetration. Hydrolyse af probe ikke synes at hjælpe med in situ hybridisering proces; RNA-prober større end 500 bp normalt giver en fremragende signal og prober, der er længere end 2 kb i længde også fungerer godt. Kortere prober kan fungere, hvis mål-RNA er rigeligt, men længere prober vil give Bafter farvning. Der synes ikke at være nogen klar fordel ved at anvende alkalisk fordøjelse at bryde op længere prober.
Pleje i den indledende behandling af embryonerne er meget vigtigt. Fjernelse af befrugtning kuvert er specielt nyttigt for embryoner efter neural fold lukning og forud for naturlig skravering ud af befrugtning kuvert. Under forlængelse af embryonet inden i befrugtning kuvert, bliver fosteret krøllet og hvis fast i denne position, embryonerne er sværere at billede efter in situ hybridisering. Men hvis embryonerne fjernes fra befrugtning konvolutten, før fiksering, de hurtigt ordne. Hvis embryoner beskadiges under fjernelsen membran tillader dem at helbrede sår før fiksering fordi beskadiget væv kan resultere i en falsk in situ hybridiseringssignal på sårstedet. Hvis små, sårene heler meget hurtigt, ofte inden for få minutter 19. Senere trin kan også skade embryonerne DUDer er behov ring flydende overførsel og så forsigtig, når skiftende løsninger. Skader i tidlige trin betyder normalt, at embryoet vil blive stærkt beskadiget ved udgangen af proceduren og beskadigede områder vil forårsage falsk in situ signaler ved synet af skader. Desuden kan op til 30 embryoner probes i et enkelt hætteglas, men med flere embryoner der er større chancer for høj baggrund i udvikling i den kolorimetriske reaktion imidlertid øge vaskene på dag 3 eller vask natten kan kompensere for dette.
I denne protokol, er antallet af trin blevet reduceret, og brugen af flere almindeligt anvendte reagenser er blevet elimineret. Bemærk, at denne protokol eliminerer flere trin, der anvendes i mange andre protokoller, herunder en proteinase K-fordøjelse og anvendelse af eddikesyreanhydrid for at blokere positivt ladede grupper. Disse trin kan stadig være nyttige, når man ser på pattedyr og fugle embryoner, men i at bruge Xenopus, fjerne disse skridt har ringe effekt on de endelige resultater af in situ hybridisering. Vores laboratorium har ikke bestemt, om disse samme forenklinger kan anvendes til in situ-hybridisering protokoller for andre arter. Proteinase K fordøjelse især kan stadig være nødvendigt i andre embryoner som chick eller mus, hvor probe på markedet kan få større begrænsninger.
Anvendelsen af BM lilla substrat er praktisk og pålidelig. Der er imidlertid en række andre muligheder for fældningen, farve alkaliske substrater, der er nødvendige for at lokalisere target-RNA i embryoet. Især er en kombination af NBT / BCIP almindeligt anvendt 4 og fungerer godt. Visse farver reagenser er opløselige i methanol, i hvilket tilfælde, vil anvendelsen af methanol efter farvning fjerne pletten og skal undgås. Andre farvekombinationer kan også bruges, når du udfører dobbelt i situs. Har også vist Anvendelsen af en lignende kombination (NBT / BCIP i stedet BM lilla)til at være meget robust ved brug musefostre 20. Den blå farve farvning og den endogene pigment af embryoet er ofte vanskeligt klart at skelne billeder. Anvendelse af albino embryoner vil også fjerne pigment men blegning løsning er næsten lige så effektivt og er meget mere praktisk, da det ikke kræver vedligeholdelse af albino voksne til avl. Hvis farvningen er forholdsvis svag, kan stærke blegning understrege, at farvning. Hvis farvningen er stærk, kan efterlade nogle lys pigment være en effektiv kontrast og også hjælpe med at orientere og iscenesættelse embryoet.
Efter hybridisering natten over i RNA-probe kan protokollen afviger fra strengt manuel protokollen beskrevet her til anvendelse af en in situ hybridisering robot. Brugen af in situ hybridisering robot sparer næsten en hel dag som dag to og dag tre af den manuelle protokol kan reduceres til én dag som robotten arbejder gennem natten end kan gøre alle de nødvendige temperaturændringer. Robotten er også meget konsekvent i sine resultater, og giver mulighed for samtidig sondering af mange prøver effektivt. Det er fordelagtigt at gøre den første dag med hånden som giver mulighed for genbrug af prober og anvendelse af mindre mængder af reagens. Den eneste væsentlige ulempe ved at bruge en robot er den oprindelige pris af instrumentet.
Denne protokol diskuterer nogle af de måder til effektivt billede en in situ hybridisering. Det er vigtigt at gøre det så mange af de oplysninger kan gå tabt, hvis billedet er dårligt. I mange tilfælde billeddannelse af in situ resultaterne af et eksperiment kræver den samme tid som det indledende forsøg. Nogle elementer i variablerne procedure som graden af blegning har et element af personlig præference. Andre billeddannende effekter kan opnås ved at placere skålen på en farvet base. Ofte en svag blå nuance til agaren kan fremhæve den dybblå farvning af i sitU hybridisering. Sagt petriskålen indeholdende agar over et ark af blå plastik for at få den ønskede effekt.
Men metoderne her som grundlag med at udforske billeddiagnostiske muligheder. Embryoner kan ses enten ryddes (lavet transparent for interne strukturer bedre visning) eller uncleared (set som de ser ud under normale lysforhold). Nogle af beslutningen med hensyn til, hvordan billedet fosteret afhænger af stedet for udtrykket. Hvis udtrykket er på eller nær overfladen af embryonet, er det bedst at afbilde embryo uden clearing. Der er flere fordele ved at bruge de afstemte embryoner. Processen med at rydde embryonerne kræver mange trin og de kemikalier, der anvendes til at rydde embryoner er vanskelige at håndtere. Også flere hulrum i embryo tillade udfældning af alkaliske fosfat substrater, der kan resultere i falsk hulrum farvning. Især blastocoel af tidlige embryoner og pharynGEAL hulrum viser ofte farvning (figur 4). Denne falske farvning er ikke synlig i embryoner, der ikke er ryddet. For det meste, selv moderat dybe ekspression kan visualiseres i afstemte embryoner, herunder mesodermale væv, såsom hjerte, nyre og somitter og endodermale stuctures såsom skjoldbruskkirtlen og leveren. Flytning af embryoner gennem en methanol serie til enten hydrat i PBS til visning eller taget i 100% methanol til opbevaring giver mulighed for flere runder af opbevaring og billeddannelse. Den methanol opbevaring gør det muligt at prøve forskellige modifikationer til billeddannelse over længere tid.
Der er nogle ulemper ved hjælp af in situ hybridisering teknik til at se på genekspression. Niveauer af udtryk er ikke strengt kvantificerbare selvom sammenligning indenfor et foster og grove ændringer i ekspression og ændringer i udtrykket domæne størrelse er normalt indlysende. Som med andre RNA-baserede teknikker, betyder det ikke give nogen oplysninger som to proteinerne kodet af genet af interesse, hvilket kan begrænse fortolkning af resultaterne. Endelig er det ofte vanskeligt at afgøre, hvad der kunne være baggrundsfarvning i forhold til den sande udtryk domæne. Dette er især et problem med gener med ukendt ekspressionsmønster, der kan være udbredt. Ofte er en probe genereret fra sense-strengen af det samme gen anvendt som en kontrol for ikke-specifik farvning. Anvendelse af en sense-streng kontrol kan give nogle oplysninger om et problem med reagenser, men det giver ikke endelige beviser for, at farvning baseret på antisense-proben er helt præcis. Resultater fra en in situ er normalt bemærkelsesværdigt ensartet tværs embryoner, når der anvendes flere embryoner, og det kan bruges som et mål for tillid til et farvningsmønster. Ligeledes kan forskellige antisense-prober, der stammer fra forskellige dele af genet, især utranslaterede regioner, bruges til at se, hvis de giver samme farvningsmønster. Hvis de gør det,det giver også tillid til observerede farvningsmønster hvis den er identisk. Fortyndede prober kan også anvendes med langvarig udsættelse for farvningsopløsning at se, om den samme farvningsmønster opstår. En faktor, som sædvanligvis skaber tillid i et farvningsmønster, om dette mønster svarer til en bestemt embryonisk struktur. Nok situs er nu blevet gjort med et stort udvalg af gener, der hidtil ukendte ekspressionsmønstre sandsynligvis relativt sjældne begivenheder. Store databaser in situ billeder er blevet fastlagt for forskellige organismer, der kan anvendes til at sammenligne billedet resultater. For Xenopus embryoner Xenbase (www.xenbase.org) er et glimrende eksempel på en ressource, der kan bruges til at forstå ekspressionsmønstre. Andre modelorganismer også har lignende, omfattende databaser for billeder.
Trods disse potentielle forbehold, in situ-hybridisering er en kraftig og pålidelig værktøj, der er yderst anvendelig tilstudiet af organogenesen. Det er sandsynligt, at forblive den foretrukne metode til at identificere celletyper og undersøge ændringer i genekspression domæner for en overskuelig fremtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
