Summary
نحن نقدم هنا بروتوكول فعالة وموثوق بها لالمناعية، مضان التهجين في الموقع، وتلطيخ DNA تليها الكمية، التصوير ذات الدقة العالية في نبات الأرابيدوبسيس البويضات thaliana كله جبل. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لتحليل التعديلات لونين والهندسة المعمارية النووية.
Abstract
في النباتات المزهرة، ويتم وضع علامة على مصير الخلية الجسدية التي تمر بمرحلة انتقالية، لالإنجابية بحلول مواصفات الخلايا الأم بوغ (SMCS) في أجهزة الأزهار من نبات الكبار. وSMC الإناث (الخلية الأم للأبواغ الضخمة، MMC) يفرق في منشم بويضة ويخضع الانقسام الاختزالي. وأبواغ الضخمة فرداني اختيارها ثم يخضع الانقسام لتشكل الأمشاج الإناث متعددة الخلايا، والتي سوف تؤدي إلى الأمشاج، وخلية بويضة وخلية المركزية، جنبا إلى جنب مع الخلايا التبعي. إمكانية الوصول المحدودة للMMC، meiocyte ومنشئات الأمشاج الإناث داخل بويضة يمثل تحديا تقنيا للالخلوي والتحليلات الوراثية الخلوية على مستوى خلية واحدة. بشكل خاص، هو ضعف مناعي مباشر أو غير مباشر من الحواتم الخلوية أو النووية عن سوء تغلغل الكواشف داخل الخلية النباتية والتصوير وحيدة الخلية والمؤجرة من قبل عدم وضوح بصري في كامل جبل الأنسجة.
وبالتالي، قمنا بتطوير وسيلة فعالة لتحليل nuclمنظمة الأذن وتعديل لونين بدقة عالية من خلية واحدة في كامل جبل البويضات نبات الأرابيدوبسيس المضمنة. لأنه يقوم على تشريح والتضمين من البويضات ثابتة في طبقة رقيقة من الجل مادة الأكريلاميد على شريحة مجهرية. التي يتعرض لها جزءا لا يتجزأ من البويضات للعلاجات الكيميائية والأنزيمية التي تهدف إلى تحسين وضوح الأنسجة والنفاذية إلى الكواشف المناعية. تلك العلاجات الحفاظ على التنظيم، والحمض النووي والبروتينات الخلوية والحواتم لونين. العينات يمكن استخدامها لمختلف التحليلات الخلوي المصب، بما في ذلك المناعية لونين، مضان التهجين في الموقع (FISH) في، وتلطيخ DNA لتحليل المغاير. متحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري (CLSM) التصوير، مع ارتفاع القرار، تليها إعادة الإعمار 3D يسمح لقياس الكمي في قرار وحيد الخلية.
Introduction
في النباتات المزهرة، وإنشاء الأنساب الإنجابية تبدأ مع تمايز SMCS، MMC الإناث والخلية الأم للأبواغ الصغيرة الذكور. في MMC يتطور من خلية nucellar البشرة الفرعي في الطرف البعيد من منشم بويضة، والخلية الأم للأبواغ الصغيرة يطور من الأنسجة تبوغية في locule العضو الذكري، والتي تقع في عمق الأجهزة الأزهار 1. SMCS الخضوع الانقسام الاختزالي لإنتاج أبواغ فرداني، ثم التي تؤدي إلى منشئات الأمشاج على الانقسام. الأمشاج الأنثوية، أو كيس الجنين، ويتكون من خلية واحدة بيضة، خلية مركزية واحدة، واثنين وثلاثة synergids antipodals. تتكون الأمشاج من الذكور، أو غبار الطلع، من الخلايا الخضرية واحد واثنين خلايا الحيوانات المنوية. بينما يبقى النبات العروسي الذكور دراسة الكائن من الوصول إليها نسبيا، وجزءا لا يتجزأ من الأمشاج الأنثوية داخل بويضة، في حد ذاته المغلقة في خباء زهرة، وبالتالي يطرح تحديات محددة لالتحليلات الجزيئية والخلوية. في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، بمساعدة الليزرعرضت تسليخ مجهري حل أنيق يسمح يحلل transcriptomic في MMC والخلايا gametophytic الإناث 2-4. بالإضافة إلى مرشح التعبير الجيني التحليلات، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي مثل الموقع التهجين أو فحوصات الجينات مراسل في، تحليلات الخلوي يسمح التحقيق في ديناميات المكونات الخلوية الذاتية باستخدام تلطيخ الخلوية المباشر معينة أو المناعية غير المباشرة. وخاصة، وتلطيخ الوراثية الخلوية باستخدام FISH وتلطيخ DNA، جنبا إلى جنب مع المناعية من التعديلات لونين أو مكونات لونين من النهج المركزي لتوضيح ديناميات وتنظيم الكروماتين النووي في نبات الأرابيدوبسيس 5. عادة، الانقسام الاختزالي يستتبع ديناميات كروموسوم معين والتي تم التحقيق فيها بشكل جيد في مصنع الذكور meiocytes 6،7؛ وقد وصفت كذلك على نطاق واسع، خلية محددة لونين إعادة التنظيم، إعادة برمجة جينية المرجح يعكس ديناميكية أثناء تطوير لقاح 8-10. على النقيض من ذلك، ويرجع ذلكلصعوبة الوصول النسبي للإناث meiocyte ومنشئات الأمشاج، لا تزال هذه التحقيقات صعبة تقنيا أن تطبق، وغالبا ما تتطلب تشريح باجتزاء أو دليل والهضم الأنزيمي (انظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك، عدم وضوح بصري انتشارا في جبل لالجامع هو عقبة أمام التصوير ذات الدقة العالية من الخلايا التناسلية في البويضات سليمة.
وهناك طريقة الكلاسيكية للتحليل الخلوي الصبغي التنظيم في البويضات كله يشن يستخدم تلطيخ فولغين 11-13. أنها تنطوي على التحلل حمض (حمض تحت الكلور باستخدام) من الحمض النووي الذي ينتج البروتين تمسخ وبالتالي يسبب تدمير بنية الكروماتين. بدلا من ذلك، تنظيم كروموسوم في meiocytes الإناث والخلايا gametophytic يمكن ملاحظتها باستخدام تلطيخ دابي والمناعية على المقاطع شبه رقيقة أو الحويصلات الجنين تشريح وMMC (على سبيل المثال نرى 14-18). بوضوح، ومع ذلك، وتشريح دليل باجتزاء يمكن أن تكون كثيفة العمالة ويعوق على التحليل النوعي والكمي لعدد كبير من الحواتم لونين.
هنا نقدم بروتوكول فعالة لإعداد عدد كبير من البويضات نبات الأرابيدوبسيس مناسبة لمجموعة متنوعة من المصب تلطيخ الخلوي في جبل لالجامع. باختصار، يتم تحضين براعم الزهور في محلول تثبيتي، يتم تشريح صفوف من البويضات من خباء وجزءا لا يتجزأ من مادة الأكريلاميد على الشريحة كما فعلت لmeiocytes حبوب اللقاح 19،20. وكذلك مسح البويضات جزءا لا يتجزأ من وثابت في الميثانول والإيثانول والزيلين وقبل الهضم جدار الخلية وpermeabilization. وتناقش الاختلافات المحتملة لهذه الخطوات. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم عينات الحمض النووي لتلطيخ، المناعية، والأسماك. وضع إعداد غير فعالة، ويتيح موازية التجريبية مجموعة المتابعة (ما يصل إلى 16 الشرائح يمكن أن تكون على استعداد في يوم واحد لمختلف تحليل المصب). العلاجات الموصوفة تمكين إشارات متجانسة كليا جبل والحفاظ عليها جيدا النسيجية الخلوية،وتنظيم النووي في الخلايا التناسلية والخلايا المحيطة nucellar التي تستفيد المقارنات الكمية والنوعية بين أنواع الخلايا. معايرة، استنادا CLSM عالية الدقة التصوير تليها إعادة الإعمار 3 الأبعاد تمكن القياسات الكمية مغزى الإشارات الفلورسنت. استخدمنا بنجاح هذا الإجراء لتحليل ديناميات ونين في MMC التفريق 21 وتطوير منشئات الأمشاج الإناث 22؛ نقدم هنا نتائج ممثل التحليل المغاير، المناعية لونين، GFP المناعية وFISH في كامل جبل البويضات. ونحن نعتقد أيضا أن بروتوكول لدينا سوف تكون مناسبة للأنسجة النباتية الأخرى والأنواع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يوصف الإجراء في سير العمل في الشكل 1، ويتم عرض الإعداد للتشريح والتضمين من الأنسجة في الشكل 2.
1. تثبيت الأنسجة
- جمع 20-30 الكرابل في أنبوب microfuge تحتوي تقدم طازجة BVO تثبيتي عازلة على الجليد.
- إصلاح الأنسجة دقيقة 30 مع طيف تهتز في درجة حرارة الغرفة.
- تدور الأنابيب التي تحتوي على الكرابل في تثبيتي في الفوق ميكروسنتريفوج 1 دقيقة في ز × 400.
- إزالة بعناية عازلة تثبيتي، وإضافة 1 مل من PBT، ووضع أنابيب على الجليد.
2. تشريح وتضمينها
- إعداد خمسة أنابيب إيبندورف مع كل 200 ميكرولتر من تقدم طازجة، 5٪ مزيج الأكريلاميد.
- إعداد خمس شرائح Superfrost تنظيفها قبل مع الايثانول 70٪ والمسمى مع قلم رصاص.
- ذوبان الجليد قسامة واحدة من 20٪ و 20٪ وكالة الأنباء الجزائرية قيلولة كل منهما، على الجليد.
- يستغرق 4-5 الكرابل مع طرف قطع نهاية، ومكانمنهم على شريحة نظيفة، وإزالة الزائدة من السائل.
- إجراء تخفيضات طولية مع إبرة رفيعة وفصل الجدران خباء للافراج عن صفوف من البويضات كما هو موضح الشكل 2، وتجنب التجفيف من خلال تغطية مع برنامج تلفزيوني (لا يزيد عن 10 ميكرولتر).
- إضافة بسرعة ومزيج 12 ميكرولتر القيلولة، 12 APS ميكرولتر مع قسامة من 200 ميكرولتر مزيج الأكريلاميد.
- إضافة 30 ميكرولتر من الأكريلاميد تفعيلها على البويضات تشريح.
- تغطية مع 20 × 20 مم ساترة، والسماح تتبلمر في درجة حرارة الغرفة، 45-60 دقيقة.
- إزالة ساترة باستخدام شفرة حلاقة. في هذه المرحلة، ويمكن أن تظل عينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في جرة Coplin تحتوي على برنامج تلفزيوني.
3. معالجة الأنسجة
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات باستثناء 3.2.1، 3.2.3، 3.3.2 و3.4.3 في الجرار Coplin مع 80 مل من محلول تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية في درجة حرارة الغرفة. يتم نقل الشرائح مع ملقط غيض مسطحة.
- توضيح الأنسجة والتثبيت:
- احتضان 5 دقائق في الميثانول.
- احتضان 5 دقائق في الايثانول.
- احتضان 30 دقيقة في الإيثانول: الزيلين (1:1).
- احتضان 5 دقائق في الايثانول.
- احتضان 5 دقائق في الميثانول.
- احتضان 15 دقيقة في الميثانول وPBT (1:1)، وتستكمل مع 2.5٪ الفورمالديهايد.
- شطف 2 × 10 دقيقة في PBT. في هذه المرحلة، والشرائح يمكن أن تبقى بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- جدار الخلية الهضم:
- ذوبان الجليد قسامة من مزيج الهضم جدار الخلية على الجليد.
- تأخذ شريحة من جرة Coplin، واستنزاف الفائض من السوائل عن طريق وضعه عموديا على منشفة ورقية.
- إضافة 100 ميكرولتر من جدار الخلية مزيج الهضم أكثر من لوحة الأكريلاميد، وتغطي مع 23 × 46 مم ساترة. تكرار للشرائح الأخرى. احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية في غرفة رطبة (الموصوفة في المواد).
- تغسل الشرائح 2 × 5 دقائق في PBT.
- ريبونوكلياز والعلاج:
- تأخذ شريحة من جرة Coplin، واستنزاف اله الزائدة من السوائل كما كان من قبل.
- احتضان كل شريحة مع 100 ميكرولتر من RNAseA في 100 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني مع 1٪ توين 20 لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
- تغسل الشرائح لمدة 2 × 5 دقائق في PBT.
- بعد تثبيت وpermeabilization:
- بعد إصلاح لمدة 20 دقيقة في تقدم طازجة PBT-F.
- شطف الشرائح لمدة 10 دقيقة في PBT.
- Permeabilize لمدة 2 ساعة في برنامج تلفزيوني مع 2٪ توين 20 في 4 درجات مئوية.
- شطف الشرائح لمدة 2 × 5 دقائق في PBT.
4. المناعية
ملاحظة: للحصول على هذه الخطوة، والتركيز الأمثل من الأجسام المضادة الأولية لابد من اختبارها باستخدام التخفيفات مختلفة (1:200، 1:500، 1:1000) من الأجسام المضادة.
- احتضان كل شريحة مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ توين 20 لمدة 12-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- تغسل الشرائح في PBT لمدة 2-4 ساعة في درجة حرارة الغرفة تحت الهز لطيف.
- تطبيق1:200 الضد الثانوية في برنامج تلفزيوني + 0.2٪ توين 20 لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
- تغسل الشرائح في PBT لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة تحت الهز لطيف.
- مباين مع 10 ميكروغرام / مل يوديد propidium في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة، ثم يشطف 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني تحت الهز لطيف، في درجة حرارة الغرفة.
- جبل في مكافحة يتلاشى مرس السائل تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل يوديد propidium. السماح للتصاعد التشدد المتوسطة لمدة 1 ساعة قبل الحصول على الصور من قبل CLSM.
5. التصوير الكمي
- الحصول على الصور:
- الحصول على صور عالية الدقة باستخدام CLSM، من الناحية المثالية باستخدام وضع المسح بالرنين، والذي يسمح الحفاظ بشكل أفضل على إشارات الفلورسنت على التصوير لفترة طويلة 23، وعدسة الغمر 63X الجلسرين.
- اختبار المعلمات اقتناء مثل كثافة الليزر، وزيادة، ذات الثقب، وحجم فوكسل وعامل التكبير في بداية التجربة لتحديد الإجراء اقتناء القياسية لتتبع بدقة في جميع أنحاءكافة الشرائح لقياس الكمي متسقة.
- التحقق من عدم وجود عبر الحديث بين fluorochromes. إذا كان موجودا، إعداد المسح المتتابع. الحصول على صور نقل بشكل منفصل وليس في وقت واحد.
- أداء المسلسل الحصول على الصور، ثلاثي الأبعاد مع أعلى دقة ممكنة في x و y و الأبعاد مع الإفراط في 2X البعد ض (القاعدة في نيكويست).
- معالجة الصور:
- إعادة بناء الصور المسلسل في ثلاثة أبعاد باستخدام برمجيات المصدر المفتوح أو التجارية.
- تحديد السطوح كفاف حول كل نواة (أو خلايا) من الفائدة في 3D.
- قياس مضان في كل قناة كمجموع شدة بكسل في كل كائن.
- تصدير البيانات إلى Excel للتحليل الإحصائي. تطبيع إشارات الأجسام المضادة ضد إشارات تلطيخ مثل الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن نقدم بروتوكول قوية لإعداد واسعة النطاق وتجهيز البويضات نبات الأرابيدوبسيس مناسبة لتلطيخ الخلوي في جبل لالجامع. بفضل التضمين، والبويضات الاحتفاظ بنية 3 الأبعاد (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، فإن معالجة الأنسجة بما في ذلك توضيح البصرية تمكن التصوير الهياكل التحت خلوية في ارتفاع القرار. الشكل 4 يبين تلطيخ DNA في براعم بويضة كله يشن حيث يظهر المغاير كما مشرق، واضحة المعالم البؤر واضح (تم استخدام أي deconvolution لهذه الصورة). واستخدمت هذه الصور لتحليل المحتوى المغاير في MMC وnucellus (الشكل 4) 21.
بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لتحليل ديناميات كميا لونين من قبل المناعية في الخلايا الأم للأبواغ الضخمة، أبواغ الضخمة وظيفية، وتطوير منشئات الأمشاج الإناث والجنين في وقت مبكر 21، 22-24. في الشكل 5 نبات الأرابيدوبسيس. ويبين الشكل 5A مثالا للمناعي في براعم بويضة، بما في ذلك الخلية الأم للأبواغ الضخمة، من علامة الإباحية المرتبطة كروماتين حقيقي (H3K4me3) وعلامة القمعية المرتبطة المغاير (H3K27me1). ويبين الشكل 5B مثالا مناعي GFP في بويضة ناضجة، بما في ذلك الكيس الجنين (في هذه الحالة، تم تعديل بروتوكول قليلا لاستخدام الأجسام المضادة GFP معززة (انظر المناقشة). اكتشفنا أيضا البروتينات لونين المحلية مثل H3 H1 21 وتبين أن الإجراء يحافظ على لونين الحواتم البروتين. يسمح هذا الإجراء أيضا لquantifications استنساخه تمكين المقارنة بين أنواع الخلايا (على سبيل المثال الإنجابية مقابل الجسدية، والخلايا المحيطة بها) 21.
أخيرا، ونحن أيضا تطبيق هذا الإجراء بنجاح لتنفيذ FISH يحلل على كامل جبل بويضة عrimordia. ويرد مثال الشكل 6 إشارات FISH باستخدام مسبار ضد 45S rDNA يكرر تحديد المناطق التنظيمية نويي 25. وصفت لجنة التحقيق الحمض النووي مباشرة مع اليكسا 488 باستخدام FISH الوسم 26، وقد تم تهجين أساسا كما هو موضح 27 مع تعديلات طفيفة، في حين تم counterstaining DNA كما هو موضح في بروتوكول لدينا.
الشكل 1. سير العمل من المناعية، وتلطيخ DNA ومضان التهجين في الموقع البويضات في نبات الأرابيدوبسيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الإعداد للتشريح والتضمين من الكرابل على الشريحة. تتم إزالة الجدار خباء ويتم تشريح خباء على الشريحة لإطلاق سراح صفوف من البويضات (انظر قرب البويضات تشريح في الخطوة 3)، ومن ثم يتم تضمين خباء تشريح في تنشيط مزيج الأكريلاميد، من خلال 20 × 20 مم ساترة تغطيتها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. يتيح بروتوكول الحفاظ على هيكل 3 الابعاد مع السماح ضوح بصري وتلطيخ متجانسة. الصور يظهر عرض القسم انقسام صورة 3D في س ص، محور XZ YZ وكما هو مبين. وقد تم الحصول على بيانات الصورة من قبلمتحد البؤر المجهر الليزر وأعيد بناؤها في 3 أبعاد باستخدام برنامج Imaris. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
يسمح الشكل 4. الجامع جبل تلطيخ الحمض النووي عن طريق يوديد propidium في primodia بويضة لدقيقة الكمي المغاير. والصورة على اليسار يظهر كله جبل الحمض النووي تلطيخ جميع أنحاء لبراعم بويضة. وتتميز نواة MMC قبل كفاف الأبيض ونواة nucellar باللون الأحمر. وتظهر التوقعات من نوى بناؤها 3D على اليمين. وضوح الأنسجة تمكن التصوير ذات الدقة العالية من بؤر المغاير تميزت كفاف الأصفر والكمي للإشارات الفلورسنت فيه. تظهر الرسوم البيانية وheterochr النسبيةomatin جزء 21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. نتائج ممثل كله جبل المناعية في البويضات نبات الأرابيدوبسيس. A) المناعية من التعديلات لونين في بويضة براعم الشباب كشف كروماتين حقيقي (H3K4me3) والمغاير (H3K27me1). إشارة الضد هو أخضر، والحمض النووي counterstained بواسطة يوديد propidium باللون الأحمر. يظهر تراكب الإشارات الفلورسنت جنبا إلى جنب مع صورة في ضوء انتقال باستخدام النقيض تدخل الفرق (الرمادي). يشار إلى المركبه التي كتبها ملامح بيضاء. ويرد قرب النواة MMC كما أقحم في لوحة العلوي. الصور هي احد متحد البؤر القسم باء) مناعي من GFP في بويضة ناضجة.تم immunostained في GFP باستخدام GFP-معززة الأجسام المضادة وكان counterstained بويضة مع دابي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. جبل لالجامع الإسفار في الموقع التهجين البويضات في نبات الأرابيدوبسيس. تم تهجين ومنشم بويضة مع لجنة التحقيق الحمض النووي محددة ل45S rDNA تكرار مواضع والمسمى مع اليكسا 488 باستخدام تقنية FISH الوسم، و counterstained مع دابي 26. وترد أيضا تراكب من 45S rDNA مع دابي والصورة المكتسبة في ضوء انتقال قناة (الرمادي). ويرد قرب النواة MMC كما أقحم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الشكللدى عودتهم.
الرقم 7. تأثير التثبيت، والهضم والإجراء تلطيخ على إشارات الحمض النووي في البويضات كله جبل. كانت ثابتة البويضات A) الناضجة 30 دقيقة إما مع بارافورمالدهيد 4٪ أو BVO تثبيتي، ومعالجة 30 دقيقة أو 1 ساعة مع جدار الخلية هضم مزيج انزيم قبل تلطيخ DNA مع يوديد propidium. لدفعة معينة، يؤثر تعد الحضانة أكثر سلبا على البويضات تلطيخ DNA التي تم إصلاحها مع بارافورمالدهيد مع من BVO. B) جبل لالجامع الحمض النووي تلطيخ باستخدام كاشف فولغين عقب المطلوبة حمض المائي 28 أو استخدام يوديد propidium بعد غير بروتوكول تغيير طبيعة وصفها في النص. يظهر اللوحة العليا قسم طائرة واحدة من خلال كيس الجنين، ويعرض لوحة أقل التكبير على نواة الخلية المركزية تظهر بوضوح تغييرتنظيم الكروماتين في البويضات فولغين الملون. CCN، نواة الخلية المركزية، ECN، نواة خلية بويضة، SYN، نواة synergid. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في النباتات المزهرة، وتحيط النسب التناسلي للأنثى من خلال عدة طبقات الخلية بما في ذلك nucellus وteguments بويضة، مما يجعل تلطيخ الخلوي في كامل جبل تحديا تقنيا. هنا نقدم بروتوكول كفاءة تمكين إعداد وتجهيز عدد كبير من البويضات مناسبة لتلطيخ الخلوي مثل المناعية، وتلطيخ DNA ومضان التهجين في الموقع بأكمله في جبل. استخدمنا بنجاح ذلك لتحليل سلالة الجرثومية التناسلي للأنثى في نبات الأرابيدوبسيس 21،22. هذا الأسلوب هو كفاءة عالية إلى العديد من الشرائح يمكن علاجها بشكل متواز لتلطيخ مختلفة. بل هو أيضا قوية ويعطي إشارة توزيع متجانس ويسمح لتحليلات كمية استنساخه. على النقيض من ذلك إلى الطريقة الكلاسيكية مثل فولغين تلطيخ الذي ينطوي على تمسخ هيكل لونين، لدينا بروتوكول يحافظ على تنظيم الكروماتين والحواتم النووية. الوظيفةition، وتوضيح الأنسجة تمكن التصوير الإشارات بدقة عالية على مستوى خلية واحدة.
هذا البروتوكول يمكن التعجيل بحذف الخطوات الموضحة في 3.1 إذا كان قد تم إصلاح الزهور في بارافورمالدهيد 4٪ (في برنامج تلفزيوني + 1٪ توين) بدلا من BVO العازلة (1.1). في حين أثبت هذا الإجراء أقصر وظيفية لعدة المناعية 22-24، وجدنا أنه خفف من متانة تلطيخ عبر العينات، والضد دفعة من جدار الخلية مزيج انزيم الهضم (انظر أدناه). علاوة على ذلك فإننا لم تكن ناجحة لFISH التهجين مع هذا الإجراء قصيرة. لمناعي لفي GFP باستخدام جزيئات معززة كما هو موضح الشكل 5B، بروتوكول مماثلة كما هو موضح هنا استخدمت مع تعديلات طفيفة في الخطوة 1 و 3: تم إصلاح الكرابل في 2.5٪ الفورمالدهيد لمدة 45 دقيقة (1.1)، فإن الخطوة الأولى لمعالجة الأنسجة تم اختصارها إلى 5-10 دقيقة العلاج الميثانول (3.1)، وقدم خطوة حجب (30 دقيقة في 2٪ BSA في برنامج تلفزيوني) قبل تطبيق الضد بين عشية وضحاها كما هو موضح. لا الضد الثانوية أمر ضروري مع التعزيز.
نناقش فيما يلي بعض الخطوات الحاسمة:
تثبيت الأنسجة، تشريح والتضمين.
والمناعية وتلطيخ DNA إشارات باستمرار أكثر قوة وتوزيع متجانس عندما تم أخذ عينات الأنسجة من النباتات أقل من 5 أسابيع من العمر (بعد نقل الشتلات في التربة). ربما، في ظروف النمو لدينا، فترة طويلة من زراعة يجوز أن يرافقه تغيرات في تكوين البيوكيميائية من جدار الخلية، والتأثير بدوره كفاءة معالجة الأنسجة. وبالتالي فإننا نوصي الأنسجة أخذ العينات من النباتات الصغيرة نسبيا. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي منع الأنسجة من الجفاف خلال تشريح (مما يؤدي إلا إلى تغيير النسيجي وعدم وجود إشارات تلطيخ)، في حين وجود فائض من برنامج تلفزيوني يتحدى التلاعب؛ لطيف تجفيف الفائض من سولوهكذا أوصى ution مع طرف مختلف أنحاء الأنسجة تترسب على الشريحة. علاوة على ذلك، ينبغي تجنب فقاعات في الخليط مادة الأكريلاميد وبينما تغطي مع ساترة. أخيرا، ينصح الشرائح Superfrost زائد بقوة للالتصاق مادة الأكريلاميد كافية (الرصاص معايير الجودة لمنصات هشة وغير مستقرة في أيدينا)، كما تظهر متفوقة على غيرها للأنسجة والأكريلاميد الالتصاق.
التثبيت، permeabilisation وجدار الخلية الهضم.
جدار الخلية الهضم هو خطوة حاسمة لمعالجة الأنسجة. ويعتقد أن هذه الخطوة تسهل اختراق جيد من الكواشف تلطيخ متجانس في جميع أنحاء الأنسجة النباتية. عانينا من التباين في التجانس تلطيخ (تتراوح من أي إشارة، إشارة في جزء فقط من الأنسجة، إلى 100٪ تلوين الأنسجة) اعتمادا على الوقت الهضم والنشاط الأنزيمي (دفعة محددة، وصفت من قبل مزود). فمن المستحسن لإنتاج كمية كبيرة من محلول المخزونمن مزيج انزيم (على سبيل المثال 100 مل) والحفاظ على 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية. ينبغي أولا أن يتم اختبار كل حل على الأسهم 1-2 قبل استخدام الشرائح في نطاق واسع. وعلاوة على ذلك، ونحن من ذوي الخبرة أن هذا النوع من تثبيتي يؤثر على كفاءة تلطيخ DNA في تركيبة مع زمنية مختلفة لجدار الخلية تجهيز الهضم: البويضات ثابتة في بارافورمالدهيد 4٪ تأثروا سلبا من الحضانة لفترات طويلة مع مزيج الهضم جدار الخلية، في حين الأنسجة الثابتة مع الحل BVO كانت متسامحة إلى العصور الهضم أطول وأفضل يسمح تلطيخ DNA (الشكل 7A). بالإضافة إلى ذلك، العلاج ريبونوكلياز (الدناز الحرة) هو الضرورة القصوى إذا تم counterstained الأنسجة مع يوديد propidium كما يربط أيضا إلى جزيئات الحمض النووي الريبي. ونحن ننصح بعدم استخدام 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) بسبب الانبعاثات الأطياف الواسعة الفلورسنت متداخلة مع fluorophores الأخرى ولكن أيضا لالوني الانحرافات التي تستلزم قناة التصحيحات التحول بعد الحيازة. نحن أيضايوصي ضد فولغين تلطيخ الذي يتطلب التحلل الحامض أثناء معالجة الأنسجة مما يؤدي إلى تمسخ 28 لونين لا سيما في كيس الجنين (الشكل 7B). ويمكن أيضا الأصباغ الحمض النووي بديلة يمكن استخدامها 29، ولكن لم يتم اختباره كفاءتها هنا.
المناعية.
لالمناعية من التعديلات لونين، ونحن نوصي للتحقق من خصوصية الأجسام المضادة الأولية في قاعدة بيانات المصدر المفتوح http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30، كما أظهرت بعض الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ردود الفعل عبر ل تعديلات أخرى. ليحلل الكمي المصب، فمن المهم لمعايرة تركيز الأجسام المضادة والحضانة الوقت لقياس إشارات في وجود علاقة خطية مع حاتمة. نوصي لمعايرة الأجسام المضادة والتخفيف كشف في الوقت باستخدام الأجسام المضادة ديلسلسلة ution 1:200، 1:500، 1:1،000 و12-24 ساعة الحضانة، على التوالي، لتحديد ظروف إشارات قوية ومتجانسة. أعلى تخفيف وأقصر فترة حضانة السماح ينبغي أن تستخدم إشارات استنساخه للتحليلات الكمية. يجب أن يتم تنفيذ الضوابط دون الأجسام المضادة الأولية لاختبار لخصوصية. إذا المناعية تنتج تلطيخ غير محددة، وينصح لمنع مع 5٪ BSA + 0.1٪ توين في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية قبل تطبيق الأجسام المضادة الأولية. ويمكن التحقق من إشارات الجسم المضاد على الشريحة قبل counterstaining الحمض النووي للتحقق من نجاح التجربة. في أيدينا، والغسيل في PBT لمدة 2-4 ساعة بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، و1 ساعة بعد الضد الثانوية يسمح للإشارات خلفية منخفضة حتى دون عرقلة.
أخيرا، وهذا هو البروتوكول المرجح أيضا ينطبق على الأنسجة النباتية الأخرى (مثل جذر، ورقة جزء، النسيج الإنشائي الأزهار) وربما إلى الأنواع النباتية الأخرى، والمؤيدviding بعض التعديل على تشريح، جدار الخلية الهضم وpermeabilization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al.
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., et al. Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
