Summary
Vi giver her en effektiv og pålidelig protokol til immunfarvning, Fluorescens in situ hybridisering, DNA-farvning efterfulgt af kvantitativ, høj opløsning billeddannelse i hel-mount Arabidopsis thaliana frøanlæg. Denne metode blev anvendt med succes til at analysere kromatin ændringer og nuklear arkitektur.
Abstract
I blomstrende planter, er det somatiske-til-reproduktive celle skæbne overgang præget af specifikationen af spore mor celler (SMC'er) i blomstermotiver organer i voksen plante. Den kvindelige SMC (megaspore mor celle, MMC) skelner i ovule primordium og undergår meiose. Den valgte haploide megaspore gennemgår derefter mitose at danne flercellede kvindelige gametofyt, hvilket vil give anledning til kønsceller, ægcellen og centrale celle sammen med accessoriske celler. Den begrænsede tilgængelighed af MMC, meiocyte og kvindelige gametofyt inde ovule er teknisk udfordrende for cytologiske og cytogenetiske analyser på enkelt celle niveau. Især er direkte eller indirekte immunodetektering af cellulære eller nukleare epitoper svækket af dårlig penetration af reagenser inde i plantecellen og single-cell imaging er demised af manglen på optiske klarhed i hel-mount væv.
Således har vi udviklet en effektiv metode til at analysere Nucløre organisation og kromatin modifikation ved høj opløsning på enkelt celle i hel-mount indlejrede Arabidopsis frøanlæg. Den er baseret på dissektion og indlejring af faste frøanlæg i et tyndt lag af acrylamid gel på en mikroskopisk slide. Den indlejrede frøanlæg udsættes for kemiske og enzymatiske behandlinger sigter mod at forbedre væv klarhed og permeabilitet til immunfarvning reagenser. Disse behandlinger bevare cellulære og kromatin organisation, DNA og protein-epitoper. Prøverne kan anvendes til forskellige efterfølgende cytologiske analyser, herunder kromatin immunfarvning, fluorescens in situ hybridisering (FISH), og DNA-farvning for heterochromatin analyse. Konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) billeddannelse, med høj opløsning, efterfulgt af 3D rekonstruktion giver mulighed for kvantitative målinger på enkelt-celle opløsning.
Introduction
I blomstrende planter, etablering af reproduktive slægter begynder med differentieringen af SMC'er, kvindelige MMC og mandlige mikrosporeudvikling mor celle. MMC udvikler sig fra en sub-epidermal frøkrop celle ved den distale spids af ovule primordium og mikrosporeudvikling mor cellen udvikler sig fra sporedannende væv i støvknappen locule, som er placeret dybt inde i de blomsteragtige organer 1. SMC'er undergår meiose at producere haploide sporer, som så giver anledning til gametophytes upon mitose. Den kvindelige gametofyt eller foster sæk, består af en ægcelle, en central celle, to synergids og tre antipodals. Den mandlige gametofyt eller pollen, der består af en vegetativ celle og to sædceller. Mens den mandlige gametofyt fortsat en relativt tilgængelig objekt-of-undersøgelse, er den kvindelige gametofyt indlejret i ovule, selv indesluttet i blomsten frugtblad, og dermed giver særlige udfordringer til molekylære og cytologiske analyser. For nylig, men laser-assisteretmikrodissektion tilbudt en elegant løsning, der tillader transkriptom analyser i MMC og kvindelige gametophytic celler 2-4. Ud over kandidat genekspression analyser, ved hjælp af fx RNA in situ hybridisering eller reportergenassays, cytologiske analyser tillader at undersøge dynamikken i endogene cellulære komponenter ved hjælp af specifik direkte cellulær farvning eller indirekte immunfarvning. Især cytogenetisk farvning bruge FISH og DNA-farvning, sammen med immunfarvning af kromatin ændringer eller kromatin komponenter er centrale tilgange at belyse kromatin dynamik og nukleare organisation i Arabidopsis 5.. Typisk meiose indebærer særlige kromosomfejl dynamik, der er blevet godt undersøgt i plante mandlige meiocytter 6,7; yderligere storstilede, celle-specifikke kromatin reorganisering, sandsynligvis afspejler dynamisk epigenetiske omprogrammering er blevet beskrevet under pollen udvikling 8-10. Derimod grundtil den relative utilgængelighed af den kvindelige meiocyte og gametofyt forbliver disse undersøgelser teknisk vanskeligt at anvende, og kræver ofte sektionering eller manuel dissektion og enzymatisk nedbrydning (se nedenfor). Hertil kommer, at fremherskende mangel på optisk klarhed i hel-mount er en hindring for høj opløsning billeddannelse af kønsceller i intakte frøanlæg.
En klassisk metode til cytologisk analyse af kromosom organisation i hele-mount frøanlæg bruger Feulgen s farvning 11-13. Det indebærer syrehydrolyse (ved hjælp af hypochlorsyrling) af DNA, hvilket resulterer i proteindenaturering og således forårsager ødelæggelse af kromatin. Alternativt kan kromosom organisation i kvindelige meiocytter og gametophytic celler observeret ved hjælp DAPI farvning og immunfarvning på semi-tynde sektioner eller dissekeret embryo sække og MMC (se for eksempel 14-18). Imidlertid klart, at manuel dissektion og skæring kan være arbejdskrævende oghæmmer den kvalitative og kvantitative analyse af et stort antal af kromatin epitoper.
Her giver vi en effektiv protokol til at forberede et stort antal Arabidopsis frøanlæg egnet til en række aftagere cytologisk farvning i hel-mount. Kort sagt, er blomsterknopper inkuberes i en fikseringsopløsning, der rækker af frøanlæg dissekeret fra frugtbladet og indlejret i acrylamid på dias som gjort for pollen meiocytter 19,20. Den indlejrede frøanlæg yderligere ryddet og fikseret i methanol, ethanol og xylen før cellevæg fordøjelse og permeabilisering. Mulige variationer af disse trin diskuteres. Prøverne kan derefter anvendes til DNA-farvning, immunfarvning og FISH. Præparatet tilstand er effektiv og giver mulighed for parallel forsøgsopstilling (op til 16 slides kan være forberedt på en dag for forskellige nedstrøms analyse). De beskrevne behandlinger muliggøre homogene signaler i hel-mount og velbevarede histologiske, cellulære,og nuklear organisation i reproduktive celler og omkringliggende frøkrop celler, der gavner kvalitative og kvantitative sammenligninger mellem celletyper. Kalibreret, CLSM-baserede høj opløsning billeddannelse efterfulgt af 3-dimensionel rekonstruktion muliggør meningsfyldte kvantitative målinger af fluorescerende signaler. Vi har med held brugt denne fremgangsmåde til at analysere kromatin dynamik i den differentierende MMC 21 og udvikle kvindelige gametofyt 22; vi præsenterer her repræsentative resultater af heterochromatin analyse, kromatin immunfarvning, GFP immunfarvning og FISH i hel-mount frøanlæg. Vi mener endvidere, at vores protokol vil være egnet til andre plantevæv og arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Proceduren er beskrevet i arbejdsgangen i figur 1, og opsætningen for dissektion og indlejring af væv er vist i figur 2..
1. Vævsfiksering
- Saml 20-30 Frugtbladene i et mikrocentrifugerør med frisk gjort BVO fiksativ buffer på is.
- Lave vævet 30 min med forsigtig rystning ved stuetemperatur.
- Spin rørene indeholdende frugtblade i fiksativ i en benchtop mikrocentrifuge 1 min ved 400 x g.
- Fjern omhyggeligt Fikservæsken buffer, og der tilsættes 1 ml af PBT placere rørene på is.
2.. Dissektion og Embedding
- Forbered fem Eppendorf-rør med hver 200 pi en frisk gjort, 5% acrylamid mix.
- Fremstilles fem Superfrost slides præ-vasket med 70% ethanol og mærket med en blyant.
- Tø en portion på 20% APS og 20% lur hver, på is.
- Tag 4-5 Frugtbladene med en cut-ende spids, steddem på en ren dias, fjerne overskydende væske.
- Sørg langsgående snit med en fin nål og frigøre frugtbladet vægge til at frigive rækker af frøanlæg som vist figur 2, undgå udtørring ved at dække med PBS (højst 10 ul).
- Hurtigt tilføje og bland 12 pi lur, 12 pi APS med en portion på 200 ul acrylamid mix.
- Tilsæt 30 ul af den aktiverede acrylamid på dissekerede frøanlæg.
- Dæk med en 20 x 20 mm dækglas, lad polymerisere ved stuetemperatur 45-60 min.
- Fjern dækglasset ved hjælp af et barberblad. På dette stadium, kan prøverne opbevares natten over ved 4 ° C i en Coplin beholder indeholdende PBS.
3.. Vævsbehandling
BEMÆRK: Alle trin undtagen 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 og 3.4.3 udføres i Coplin-skåle med 80 ml opløsning under den kemiske hætte ved stuetemperatur. Slides overføres med fladskærms-tip pincet.
- Tissue afklaring ogfiksering:
- Inkuber 5 min i methanol.
- Inkuber 5 min i ethanol.
- Inkuber 30 minutter i ethanol: xylen (1:1).
- Inkuber 5 min i ethanol.
- Inkuber 5 min i methanol.
- Inkuber 15 min i methanol og PBT (1:1), suppleret med 2,5% formaldehyd.
- Skyl 2 x 10 minutter i PBT. På dette stadium, kan objektglassene opbevares natten over ved 4 ° C.
- Cellevæg fordøjelse:
- Optø en alikvot af cellevæggen fordøjelse blanding på is.
- Tag et dias fra Coplin krukke, dræne det overskydende væske ved at placere den lodret på en papirserviet.
- Tilsæt 100 ul cellevæg fordøjelse mix i acrylamid pad og dække med en 23 x 46 mm dækglas. Gentag for de andre dias. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C i et fugtigt kammer (beskrevet i Materialer).
- Vask slides 2 x 5 min i PBT.
- RNase A behandling:
- Tag et dias fra Coplin krukke, dræne the overskud af væske som før.
- Inkuber hvert objektglas med 100 pi RNAseA ved 100 ug / ml i PBS med 1% Tween-20 i 1 time ved 37 ° C i et fugtigt kammer.
- Vask dias til 2 x 5 min i PBT.
- Post-fiksering og permeabilisering:
- Post-fix i 20 min i frisklavet PBT-F.
- Skyl objektglassene i 10 min i PBT.
- Permeabilisere i 2 timer i PBS med 2% Tween-20 ved 4 ° C.
- Skyl objektglassene for 2 x 5 min i PBT.
4.. Immunfarvning
BEMÆRK: I dette trin, den optimale koncentration af det primære antistof har, der skal testes ved hjælp af forskellige fortyndinger (1:200, 1:500, 1:1000) af antistofferne.
- Inkuber hvert objektglas med 100 ul primært antistof fortyndet i PBS med 0,2% Tween-20 for 12-24 timer ved 4 ° C.
- Vaskes objektglassene i PBT i 2-4 timer ved stuetemperatur under forsigtig omrystning.
- Påførsekundært antistof 1:200 i PBS + 0,2% Tween-20 i 24 timer ved 4 ° C.
- Vask objektglassene i PBT i 1 time ved stuetemperatur under forsigtig omrystning.
- Kontrastfarve med 10 ug / ml propidiumiodid i PBS i 15 minutter, og derefter skylles 15 minutter i PBS under forsigtig omrystning ved stuetemperatur.
- Mount i anti-fading væske mountant suppleret med 10 ug / ml propidiumiodid. Lad montage medium hærde i 1 time før erhverve billeder ved CLSM.
5.. Kvantitative Imaging
- Billede erhvervelse:
- Anskaf billeder i høj opløsning ved hjælp CLSM, ideelt at bruge en resonans scanning mode, som giver en bedre bevarelse af fluorescerende signaler over længere billeddannelse 23 og en 63X glycerol nedsænkning linse.
- Test erhvervelse parametre såsom laser intensitet, gain, pinhole, voxelstørrelse og zoomfaktor ved begyndelsen af forsøget for at definere en standard erhvervelse procedure til nøje at følge helealle slides for konsekvente kvantitative målinger.
- Kontroller, at fraværet af cross-talk mellem fluorokromer. Hvis nuværende oprette en sekventiel scanning. Anskaf transmission billederne hver for sig og ikke samtidig.
- Udfør seriel, tre-dimensionelle billede erhvervelse med højest mulige opløsning i x-og y dimensioner, og med 2x oversampling i z dimension (Nyquist s reglen).
- Billedbehandling:
- Rekonstruere serielle billeder i tre dimensioner ved hjælp af kommercielle eller open source software.
- Definer konturfladerne omkring hver kerne (eller celle) af interesse i 3D.
- Kvantificere fluorescens i hver kanal som summen af pixel intensitet i hvert objekt.
- Eksportere data til Excel til statistiske analyser. Normalisere antistof signaler mod fx DNA farvningsprocedurer signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi giver en robust protokol for forberedelse storstilet og behandling af Arabidopsis frøanlæg egnet til cytologisk farvning i hel-mount. Takket være indlejring, frøanlæg bevare en 3-dimensionel struktur (figur 3). Desuden vævsbehandling, herunder optisk afklaring sætter billedbehandlingsprogrammer subcellulære strukturer på høj opløsning. Figur 4 viser DNA-farvning i hel-mount ovule primordier hvor heterochromatin fremstår som lyse, veldefinerede iøjnefaldende foci (ingen deconvolution blev brugt til dette billede). Disse billeder blev anvendt til at analysere heterochromatin indhold i MMC og nucellus (figur 4) 21.
Desuden har vi med succes brugt denne protokol til kvantitativt analysere kromatin dynamik ved immunfarvning i megaspore mor celler, funktionel megaspore, udvikle kvindelige gametophytes og tidlig embryo 21, 22-24. I figur 5 Arabidopsis frøanlæg. 5A viser et eksempel på immunodetektion i ovule primordier, herunder megaspore modercellen, af eukromatin-associeret eftergivende mærke (H3K4me3) og en heterochromatin-associeret undertrykkende varemærke (H3K27me1). 5B viser et eksempel på GFP immunodetektering i en moden ovule, herunder foster sæk (i dette tilfælde, blev protokollen ændret lidt for at bruge GFP booster antistof (se diskussionen). Vi har detekteret også native kromatin proteiner såsom H3 og H1 21 viser, at proceduren bevarer kromatin proteinepitoper. Proceduren giver også mulighed for reproducerbare kvantificeringer muliggør sammenligning mellem celletyper (f.eks reproduktive vs somatiske, omkringliggende celler) 21.
Endelig skal vi også med succes anvendt denne fremgangsmåde til at udføre FISH analyser på hel-mount ovule primordia. Et eksempel er vist Figur 6 viser FISH signaler ved hjælp af en sonde mod 45S rDNA gentager definere nucleolar organisere regionerne 25. DNA-proben var direkte mærket med Alexa 488 bruge FISH-Tag 26 blev hybridisering udført i det væsentlige som beskrevet 27 med mindre ændringer, mens DNA kontrastfarvning blev udført som beskrevet i vores protokol.
Figur 1.. Workflow af immunfarvning, DNA-farvning og fluorescens in situ hybridisering i Arabidopsis frøanlæg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Opsætning til dissektion og forankring af Frugtbladene på dias. Frugtbladet væg fjernes og frugtbladet dissekeret på diaset for at frigive rækker af frøanlæg (se nærbillede af dissekerede frøanlæg i trin 3), og derefter dissekeret carpel er indlejret i aktiveret acrylamid mix, der er omfattet af 20 x 20 mm dækglas. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Protokollen gør det muligt at bevare den 3-dimensionelle struktur, samtidig med at optisk klarhed og homogen farvning. Billederne viser en splittelse snitbillede af 3D-billedet i xy, xz og yz akse som angivet. De billeddata er blevet overtaget afkonfokal laser scanning mikroskopi og rekonstrueret i 3 dimensioner ved hjælp af Imaris softwaren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Whole-mount DNA farvning af propidiumiodid i ovule primodia giver mulighed for præcis heterochromatin kvantificering. Billedet til venstre viser hel-mount DNA farvning hele en ovule primordier. En MMC kerne er markeret med en hvid kontur og et frøkrop kerne i rødt. Fremskrivninger af 3D-rekonstruerede kerner er vist til højre. Klarheden af vævet giver høj opløsning billeddannelse af heterochromatin foci markeret med en gul kontur og kvantificering af de fluorescerende signaler deri. Graferne viser den relative heterochromatin fraktion 21. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5.. Repræsentative resultater af hel-mount immunfarvning i Arabidopsis frøanlæg. A) Immunfarvning af kromatin modifikationer i unge ovule primordier afsløre eukromatin (H3K4me3) og heterochromatin (H3K27me1). Antistoffet signalet er grøn, DNA modfarvet med propidiumiodid i rødt. Et overlay af fluorescerende signaler er vist sammen med et billede i transmission lys ved hjælp kontrast differential interferens (grå). MMC er angivet med hvide konturer. Et nærbillede af MMC kernen vises som indsat i det øverste panel. Billederne er enkelt konfokal afsnit. B) Immunodetektion GFP i en moden ovule.GFP blev immunostained hjælp GFP-booster antistoffet og ovule blev modfarvet med DAPI. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6.. Whole-mount Fluorescens in situ hybridisering i Arabidopsis frøanlæg. Ovule primordium blev hybridiseret med en DNA-probe specifik for 45S rDNA gentage loci og mærket med Alexa 488 ved hjælp af FISH-Tag-teknologi, og modfarvet med DAPI 26. Overlejring af 45S rDNA med DAPI og image erhvervet i transmissionen lyskanal (grå) er også vist. Et nærbillede af MMC kernen vises som nedfældning. Klik her for at se en større udgave af denne figenure.
Figur 7.. Påvirkning af fiksering, fordøjelse og farvning procedure på DNA-signaler i hel-mount frøanlæg. A) Ældre frøanlæg blev fastsat 30 minutter enten med 4% paraformaldehyd eller BVO fiksativ og behandlet 30 min eller 1 time med cellevæg fordøje enzym mix før DNA-farvning med propidiumiodid. For et bestemt parti, længere inkubationstid påvirker mere negativt på DNA farvningsprocedurer frøanlæg, der blev fastsat med paraformaldehyd end med BVO. B) Hele-mount DNA farvning vha. Feulgen reagenset efter en påkrævet syre-hydrolyse 28 eller ved hjælp af propidiumiodid efter den ikke- denaturering protokollen beskrevet i teksten. Det øverste panel viser et enkelt plan snit gennem embryo vej, det nederste panel viser en forstørrelse over den centrale cellekernen klart viser ændring afkromatin organisation i Feulgen-farvede frøanlæg. CCN, central cellekernen, ECN, æg cellekernen, syn, synergid kerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I blomstrende planter, er den kvindelige reproduktive afstamning omgivet af flere cellelag, herunder nucellus og ovule teguments, hvilket gør cytologisk farvning i hel-mount teknisk udfordrende. Her præsenterer vi en effektiv protokol muliggør fremstilling og forarbejdning af et stort antal af frøanlæg egnet til cytologisk farvning såsom immunfarvning, DNA-farvning og fluorescens in situ hybridisering i hel-mount. Vi har med held brugt det til analyse af den kvindelige reproduktive germline i Arabidopsis 21,22. Denne metode er meget effektiv, da flere dias kan behandles parallelt i forskellige farvning. Det er også robuste og giver homogen signal distribution og giver mulighed for reproducerbare kvantitative analyser. I modsætning til den klassiske metode, såsom Feulgen farvning, der involverer denaturering af kromatin struktur vores protokol bevarer kromatin organisation og nukleare epitoper. I addition, væv afklaring muliggør billeddannelse signalerne i høj opløsning på enkelt-celle niveau.
Denne protokol kan fremskyndes ved at udelade de trin, der er beskrevet i 3.1, hvis blomsterne er blevet rettet i 4% paraformaldehyd (i PBS + 1% Tween) i stedet for BVO buffer (1.1). Mens dette kortere procedure viste sig funktionelle for flere immunfarvning 22-24, fandt vi, at det dæmper robustheden af farvningen tværs prøver, antistof og parti cellevæg fordøjelse enzym mix (se nedenfor). Desuden var vi ikke en succes for FISH hybridisering med denne korte procedure. For immunpåvisning af GFP s ved hjælp af booster-molekyler som vist figur 5B, en tilsvarende protokol som beskrevet her blev anvendt med mindre ændringer på trin 1 og 3: Frugtbladene blev fikseret i 2,5% formaldehyd i 45 min (1.1), det første skridt i vævsbehandling blev forkortet til 5-10 min methanol behandling (3.1), blev et blokerende trin introduceret (30 min i 2% BSA i PBS) før anvendelse antistof natten over som beskrevet. Ingen sekundære antistof er nødvendigt med booster.
Vi diskuterer nedenfor nogle kritiske trin:
Vævsfiksering, dissektion og forankring.
Immunfarvning og DNA farvningsteknikker signaler var konsekvent mere robust og homogent fordelt når vævet blev udtaget fra planter mindre end 5 uger (efter overførsel af kimplanter i jord). Eventuelt i vores vækstbetingelser en forlænget dyrkningsperiode kan ledsages af ændringer i den biokemiske sammensætning af cellevæggen, som påvirker igen effektiviteten af vævsbehandling. Vi anbefaler derfor, prøvetagning væv fra relativt unge planter. Desuden bør vævet forhindres i at tørre under dissektion (der fører ellers histologisk ændring og fravær af farvnings-signaler), mens et overskud af PBS udfordrer manipulation; en blid dræning af overskud af solution med spidsen omkring væv deponeret på dias anbefales derfor. Desuden bør bobler undgås i acrylamid blandingen og samtidig dække med et dækglas. Endelig Superfrost Plus slides stærkt anbefales til tilstrækkelig acrylamid friktion (standardkvalitet føre til skrøbelige og ustabile puder i vores hænder), som de ser bedre end andre for vævs-og acrylamid vedhæftning.
Fiksering, permeabilisering og cellevæg fordøjelsen.
Cellevæg fordøjelse er et afgørende skridt på vævsbehandling. Det menes, at dette trin muliggør en god penetration af farvningsreagenser homogent i hele plantevæv. Vi oplevede variation i farvning homogenitet (fra intet signal, signal i kun en del af vævet, til 100% vævsfarvning) afhængig af fordøjelse tid og den enzymatiske aktivitet (batch-specifikke beskrevet af leverandøren). Det anbefales at producere en stor mængde af stamopløsningaf enzymblanding (f.eks 100 ml) og holde 1 ml alikvoter ved -20 ° C. Hver stamopløsning skal først testes på 1-2 slides, før du bruger i stor skala. Endvidere oplevede vi, at den type fikseringsmiddel påvirker effektiviteten af DNA-farvning i kombination med forskellige behandlingstid for cellevæg fordøje: frøanlæg fikseret i 4% paraformaldehyd var negativt påvirket af forlænget inkubation med cellevæggen fordøjelse mix, mens væv fikseret med den BVO opløsning var tolerante over længere fordøjelsesperiode og tilladt bedre DNA-farvning (figur 7A). Desuden er strengt nødvendigt en RNAse (DNase gratis) behandling, hvis vævet kontrastfarves med propidiumiodid som det også binder sig til RNA-molekyler. Vi fraråder at bruge 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) på grund af sin brede fluorescerende emission spektre overlapper med andre fluorophores men også til akromatiske aberration, der nødvendiggør kanal skift korrektioner efter købet. Vi har ogsåanbefale mod Feulgen farvning, der kræver en syre-hydrolyse under vævsbehandling 28 fører til kromatin denaturering især i embryo sac (figur 7B). Alternative DNA-farvestoffer kan også anvendes 29, men deres effektivitet er ikke blevet testet her.
Immunfarvning.
For immunfarvning af kromatin ændringer, anbefaler vi at kontrollere specificiteten af det primære antistof i open source-database http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, da nogle kommercielt tilgængelige antistoffer viste krydsreaktioner for andre ændringer. For nedstrøms kvantificering analyser, er det vigtigt at kalibrere antistoffer koncentration og inkubationstid at måle signalerne i et lineært forhold til epitopen. Vi anbefaler at kalibrere antistoffortyndingen og påvisning tid ved hjælp af et antistof dilution serie af 1:200, 1:500, 1:1000 og 12-24 timers inkubation henholdsvis at identificere de betingelser, der giver robuste og homogene signaler. Den højeste fortynding og korteste inkubationstid giver reproducerbare signaler bør anvendes til kvantitative analyser. Kontrol uden primært antistof, bør udføres for at teste for specificitet. Hvis immunfarvning producerer uspecifik farvning, tilrådes det at blokere med 5% BSA + 0,1% Tween i PBS i 2 timer ved 4 ° C før anvendelse af primære antistof. Kan kontrolleres Antistof signaler på diaset før DNA kontrastfarvning at kontrollere succes af forsøget. I vores hænder, vask i PBT for 2-4 timer efter inkubation med det primære antistof, og 1 time efter det sekundære antistof muliggør lave baggrund signaler, selv uden at blokere.
Endelig er denne protokol også er sandsynligvis gældende for andre plantevæv (fx rod, blad fragment, floral meristem) og sandsynligvis til andre plantearter, proViding nogle justeringer på dissektion, cellevæggen fordøje og permeabilisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al.
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., et al. Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
