Summary
Forniamo qui un protocollo efficiente e affidabile per immunoistochimica, ibridazione in situ fluorescente, colorazione del DNA seguita da quantitativa, immagini ad alta risoluzione di tutto il montaggio di Arabidopsis thaliana ovuli. Questo metodo è stato utilizzato con successo per analizzare modificazioni della cromatina e architettura nucleare.
Abstract
In piante da fiore, la transizione destino delle cellule somatiche-to-riproduttiva è segnato dalla specificazione delle cellule madri spore (SMC) in organi floreali della pianta adulta. La femmina SMC (cellula madre megaspore, MMC) differenzia nel primordio ovulo e subisce meiosi. Il megaspore haploid selezionato poi subisce mitosi per formare il gametofito multicellulare femminile, che darà origine ai gameti, la cellula uovo e la cellula centrale, insieme a cellule accessorie. L'accessibilità limitata della MMC, meiocyte e gametofito femminile all'interno dell'ovulo è tecnicamente impegnativo per citologica e citogenetica analisi a livello di singola cellula. In particolare, immunorivelazione diretta o indiretta di epitopi cellulari o nucleari è compromessa dalla scarsa penetrazione dei reagenti all'interno della cellula vegetale e di imaging singola cellula è locato dalla mancanza di chiarezza ottica in tutto il montaggio tessuti.
Così, abbiamo sviluppato un metodo efficace per analizzare i Nuclorganizzazione orecchio e la modifica della cromatina ad alta risoluzione della singola cella in tutto il montaggio ovuli di Arabidopsis embedded. Si basa sulla dissezione e l'incorporamento di ovuli fissati in uno strato sottile di gel di acrilammide su un vetrino microscopico. Gli ovuli incorporati vengono sottoposti a trattamenti chimici ed enzimatici volti a migliorare la chiarezza tessuto e permeabilità ai reagenti di immunoistochimica. Tali trattamenti conservano organizzazione, DNA e proteine epitopi cellulari e cromatina. I campioni possono essere utilizzati per diverse analisi citologiche a valle, cromatina immunostaining, ibridazione in situ fluorescente (FISH), e colorazione del DNA per l'analisi eterocromatina. Microscopio confocale a scansione laser (CLSM) delle immagini, ad alta risoluzione, seguita dalla ricostruzione 3D permette misurazioni quantitative a risoluzione singola cellula.
Introduction
In piante da fiore, l'istituzione di linee riproduttive inizia con la differenziazione di SMC, MMC femminile e cellula madre microspora maschile. Il MMC sviluppa da una cellula nucellare sub-epidermica sulla punta distale del primordio ovulo, e la cellula madre microspore sviluppa dal tessuto sporigeni nel locule antera, che si trovano in profondità all'interno degli organi floreali 1. SMCs subiscono meiosi per produrre spore aploidi, che poi danno origine ai gametofiti su mitosi. Il gametofito femminile, o embrione sac, costituito da una cellula uovo, una cella centrale, due synergids e tre antipodals. Il gametofito maschile, o il polline, è composto da una cellula vegetativa e due cellule spermatiche. Mentre il gametofito maschile rimane uno studio oggetto d'relativamente accessibile, il gametofito femminile è incorporato all'interno dell'ovulo, si racchiuso nel carpello fiore, e pone quindi sfide specifiche per analisi molecolari e citologici. Recentemente, tuttavia, laser assistitamicrodissezione ha offerto una soluzione elegante che permette trascrittomica analizza in MMC e cellule gametofitici femminili 2-4. In aggiunta l'espressione del gene candidato analisi, ad esempio utilizzando RNA ibridazione in situ o giornalista test genetici, analisi citologiche consente indagare le dinamiche di componenti cellulari endogeni mediante specifica colorazione cellulare diretto o indiretto immunoistochimica. In particolare, la colorazione citogenetica utilizzando FISH e la colorazione del DNA, insieme con immunocolorazione delle modificazioni della cromatina o componenti della cromatina sono approcci centrali di chiarire la dinamica della cromatina e l'organizzazione nucleare in Arabidopsis 5. In genere, la meiosi comporta dinamiche cromosomiche specifiche, che è stato ben studiato in pianta maschio meiocytes 6,7; ulteriormente su larga scala, specifica delle cellule cromatina riorganizzazione, probabilmente riflettendo riprogrammazione epigenetica dinamico è stato descritto durante lo sviluppo del polline 8-10. Per contro, a causaalla relativa inaccessibilità della meiocyte femmina e gametofito, queste indagini rimangono tecnicamente difficile da applicare, e spesso richiedono dissezione sezionamento o manuale e digestione enzimatica (vedi sotto). Inoltre, la prevalente mancanza di chiarezza ottica in tutto il monte è un ostacolo alla imaging ad alta risoluzione delle cellule riproduttive in ovuli intatti.
Un metodo classico per l'analisi citologica di organizzazione cromosoma in ovuli interi montaggio utilizza la colorazione del Feulgen 11-13. Si tratta di idrolisi acida (con acido ipocloroso) del DNA che provoca la denaturazione delle proteine e provoca la distruzione della struttura della cromatina così. In alternativa, l'organizzazione dei cromosomi in meiocytes femminili e cellule gametofitici può essere osservata con colorazione DAPI e immunoistochimica su sezioni semi-sottili o sacche di embrioni sezionati e MMC (per esempio vedi 14-18). Chiaramente, però, la dissezione manuale e sezionamento possono essere laborioso eostacola l'analisi qualitativa e quantitativa di un gran numero di epitopi cromatina.
Qui forniamo un protocollo efficiente per preparare un gran numero di ovuli Arabidopsis adatti per una varietà di valle colorazione citologica in tutto il montaggio. In breve, boccioli di fiori sono incubati in una soluzione di fissativo, filari di ovuli sono sezionati dal carpello e incorporate in acrilammide sulla trasparenza come fatto per il polline meiocytes 19,20. Gli ovuli incorporati sono ulteriormente cancellate e fissate in metanolo, etanolo, e xilene prima digestione parete cellulare e permeabilizzazione. Eventuali variazioni di questi passaggi sono discussi. I campioni possono quindi essere utilizzate per la colorazione del DNA, immunoistochimica e FISH. La modalità di preparazione è efficiente e consente parallelo sperimentale set-up (fino a 16 vetrini possono essere preparati in un giorno per l'analisi a valle differente). I trattamenti descritti permettono di segnali omogenei in tutto-mount e istologici, cellulari ben conservati,e l'organizzazione nucleare in cellule riproduttive e cellule nucellare circostanti che beneficiano confronti qualitativi e quantitativi tra i tipi di cellule. Calibrato, a base di CLSM imaging ad alta risoluzione seguita da ricostruzione 3-dimensionale consente misurazioni quantitative significative di segnali fluorescenti. Abbiamo utilizzato con successo questa procedura per analizzare le dinamiche della cromatina in MMC differenziare 21 e in via di sviluppo gametofito femminile 22; Vi presentiamo qui i risultati rappresentativi di analisi heterochromatin, immunostaining cromatina, GFP immunostaining e FISH in tutto il montaggio ovuli. Siamo inoltre convinti che il nostro protocollo sarà adatto per altri tessuti vegetali e specie.
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Protocol
La procedura è descritta nel flusso di lavoro in Figura 1, e la configurazione per la dissezione e l'incorporamento di tessuti sono rappresentati nella Figura 2.
1. Tissue fissaggio
- Raccogliere 20-30 carpelli in una provetta per microcentrifuga contenente appena fatto tampone fissativo BVO sul ghiaccio.
- Fissare il tessuto 30 min con una leggera agitazione a temperatura ambiente.
- Gira le provette contenenti i carpelli in fissativo in un banco microcentrifuga 1 min a 400 x g.
- Rimuovere con cautela il buffer fissativo e aggiungere 1 ml di PBT, posizionare i tubi sul ghiaccio.
2. Dissection and Embedding
- Preparare cinque provette Eppendorf con ogni 200 ml di un appena fatto, 5% miscela di acrilamide.
- Preparare cinque vetrini Superfrost pre-puliti con il 70% di etanolo e marcate con una matita.
- Scongelare una aliquota del 20% di APS e il 20% PAN ciascuno, sul ghiaccio.
- Prendere 4-5 carpelli con una punta cut-end, postoli su un vetrino pulito, rimuovere l'eccesso di liquido.
- Effettuare tagli longitudinali con un ago sottile e staccare le pareti carpello a rilasciare file di ovuli, come mostrato figura 2, evitare la disidratazione coprendo con PBS (non superiore a 10 ml).
- Aggiungere rapidamente e mescolare 12 PAN microlitri, 12 APS microlitri con una aliquota di 200 microlitri mix acrilamide.
- Aggiungere 30 ml di acrilammide attivato sui ovuli sezionati.
- Coprire con un coprioggetto mm 20 x 20, lasciate polimerizzare a temperatura ambiente, 45-60 min.
- Rimuovere il vetrino con una lama di rasoio. In questa fase, i campioni possono essere conservati a 4 ° C in una vaschetta Coplin contenente PBS.
3. Processazione dei tessuti
NOTA: Tutte le fasi tranne 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 e 3.4.3 sono svolte in vaschette Coplin con 80 ml di soluzione sotto la cappa chimica a temperatura ambiente. I vetrini vengono trasferiti con un piatto-punta pinze.
- Tissue chiarimenti efissazione:
- Incubare 5 min in metanolo.
- Incubare 5 min in etanolo.
- Incubare 30 min in etanolo: xilene (1:1).
- Incubare 5 min in etanolo.
- Incubare 5 min in metanolo.
- Incubare 15 min in metanolo e PBT (1:1), integrato con 2,5% di formaldeide.
- Sciacquare 2 x 10 min in PBT. In questa fase, i vetrini possono essere conservati per una notte a 4 ° C.
- Digestione della parete cellulare:
- Scongelare una aliquota della miscela di digestione parete cellulare su ghiaccio.
- Prendete una diapositiva dalla vaschetta Coplin, drenare l'eccesso di liquido ponendolo verticalmente su un tovagliolo di carta.
- Aggiungere 100 ml di parete cellulare mix digestione sopra il pad acrilamide e coprire con un coprioggetto mm 23 x 46. Ripetere l'operazione per le altre diapositive. Incubare per 2 ore a 37 ° C in una camera umida (descritto in Materiali).
- Lavare il slides 2 x 5 minuti in PBT.
- RNase A Trattamento:
- Prendete una diapositiva dalla vaschetta Coplin, drenare the l'eccesso di liquido come prima.
- Incubare il vetrino con 100 ml di RNAseA a 100 pg / ml in PBS con 1% Tween-20 per 1 ora a 37 ° C in una camera umida.
- Lavare i vetrini per 2 x 5 minuti in PBT.
- Post-fissazione e permeabilizzazione:
- Post-fix per 20 minuti in appena fatto PBT-F.
- Sciacquare i vetrini per 10 minuti in PBT.
- Permeabilize per 2 h in PBS con 2% di Tween-20 a 4 ° C.
- Sciacquare i vetrini per 2 x 5 minuti in PBT.
4. Immunostaining
NOTA: Per questo passaggio, la concentrazione ottimale dell'anticorpo primario deve essere testato utilizzando diverse diluizioni (1:200, 1:500, 1:1000) degli anticorpi.
- Incubare il vetrino con 100 microlitri di anticorpo primario diluito in PBS con 0,2% di Tween-20 per 12-24 ore a 4 ° C.
- Lavare i vetrini in PBT per 2-4 ore a temperatura ambiente sotto leggera agitazione.
- Applicare il1:200 anticorpo secondario in PBS + 0,2% Tween-20 per 24 ore a 4 ° C.
- Lavare i vetrini in PBT per 1 ora a temperatura ambiente sotto leggera agitazione.
- Controcolorare con 10 ug / ml di ioduro di propidio in PBS per 15 minuti, quindi risciacquare 15 min in PBS sotto leggera agitazione, a temperatura ambiente.
- Mount anti-fading liquido di montaggio integrato con 10 mg / ml ioduro di propidio. Lasciate che il mezzo di montaggio indurire per 1 ora prima di acquisire le immagini da CLSM.
5. Imaging quantitativa
- Acquisizione delle immagini:
- Acquisire immagini ad alta risoluzione utilizzando CLSM, preferibilmente utilizzando una modalità di scansione di risonanza, che permette una migliore conservazione dei segnali fluorescenti su immagini prolungata 23, e un obiettivo ad immersione 63X glicerolo.
- Testare i parametri di acquisizione come l'intensità del laser, guadagno, pinhole, dimensione voxel e fattore di zoom all'inizio dell'esperimento definire una procedura di acquisizione standard da seguire rigorosamente tuttatutte le diapositive per le misure quantitative coerenti.
- Verificare l'assenza di cross-talk tra fluorocromi. Se presente, impostare una scansione sequenziale. Acquisire le immagini della trasmissione separatamente e non contemporaneamente.
- Eseguire seriale, l'acquisizione di immagini tridimensionali con la massima risoluzione possibile nelle dimensioni X e Y e con 2x oversampling nella dimensione z (regola di Nyquist).
- Elaborazione delle immagini:
- Ricostruire le immagini in serie in tre dimensioni utilizzando il software fonte commerciale o aperto.
- Definire superfici di contorno attorno a ciascun nucleo (o cella) di interesse in 3D.
- Quantificare fluorescenza in ciascun canale come la somma di intensità dei pixel in ciascun oggetto.
- Esportare i dati in Excel per le analisi statistiche. Normalizzare i segnali di anticorpi contro i segnali di colorazione ad esempio DNA.
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Representative Results
Forniamo un protocollo robusto per la preparazione su larga scala e l'elaborazione di ovuli di Arabidopsis adatti per la colorazione citologica in tutto-mount. Grazie alla incorporamento, gli ovuli conservano una struttura 3-dimensionale (Figura 3). Inoltre, il trattamento dei tessuti con precisazioni ottico consente strutture subcellulari di imaging ad alta risoluzione. Figura 4 mostra la colorazione del DNA in tutto il montaggio primordi dell'ovulo dove heterochromatin appare come luminoso, ben definito cospicuo foci (senza deconvoluzione è stato utilizzato per questa immagine). Queste immagini sono stati usati per l'analisi del contenuto eterocromatina nel MMC e nucellus (Figura 4) 21.
Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per analizzare quantitativamente dinamica della cromatina da immunoistochimica in cellule madri megaspore, megaspore funzionale, sviluppo gametofiti femminili e embrione precoce 21, 22-24. In figura 5 di Arabidopsis. figura 5A mostra un esempio di immunorivelazione in primordi di ovuli, tra cui la cellula madre megaspore, di un marchio permissiva euchromatin-associato (H3K4me3) e un segno repressivo eterocromatina associati (H3K27me1). Figura 5B mostra un esempio di GFP immunodetezione in un ovulo maturo, compreso il sacco embrionale (in questo caso, il protocollo è stato leggermente modificato per utilizzare l'anticorpo GFP richiamo (vedi la discussione). Abbiamo anche rilevato cromatina proteine native come H3 e H1 21, mostrando che la procedura conserva cromatina epitopi proteici. La procedura consente anche di quantificazioni riproducibili che consentano il confronto tra i tipi di cellule (es. riproduttiva vs somatiche, cellule circostanti) 21.
Infine, abbiamo anche applicato con successo questa procedura per effettuare analisi FISH su tutto il monte ovulo primordia. Un esempio è mostrato figura 6 mostra segnali FISH utilizzando una sonda contro 45S rDNA ribadisce la delimitazione delle regioni organizzativi nucleolari 25. La sonda di DNA è stato marcato direttamente con Alexa 488 utilizzando FISH-Tag 26, l'ibridazione è stata effettuata essenzialmente come descritto 27 con piccole modifiche, mentre controcolorazione DNA è stato fatto come descritto nel nostro protocollo.
Figura 1. Flusso di lavoro di immunoistochimica, la colorazione del DNA e ibridazione in situ fluorescente in ovuli di Arabidopsis. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Setup per la dissezione e l'incorporamento di carpelli sulla trasparenza. La parete carpale viene rimosso e il carpello è sezionato sulla diapositiva per sbloccare file di ovuli (vedi stretta di ovuli sezionati al punto 3), e poi il carpello sezionato è incorporato nel mix di acrilammide attivato, coperta da 20 x 20 mm coprioggetto. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Il protocollo consente, mantenendo la struttura 3-dimensionale, consentendo chiarezza ottica e colorazione omogenea. Le immagini mostra una vista in sezione divisa dell'immagine 3D in xy, asse xz e yz come indicato. I dati di immagine sono stati acquistati damicroscopio confocale a scansione laser e ricostruito in 3 dimensioni utilizzando il software Imaris. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Whole-mount colorazione DNA da ioduro di propidio in primodia ovulo permette per un preciso heterochromatin quantificazione. L'immagine a sinistra mostra colorazione del DNA intero-mount tutta l'primordi dell'ovulo. Un nucleo MMC è segnato da un contorno bianco e un nucleo nucellare in rosso. Proiezioni di nuclei 3D ricostruiti vengono visualizzati sulla destra. La chiarezza del tessuto permette di imaging ad alta risoluzione dei foci eterocromatina contrassegnati da un contorno giallo e quantificazione dei segnali fluorescenti in esso. I grafici mostrano la relativa heterochromatin frazione 21. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Rappresentante dei risultati di tutto-mount immunostaining in ovuli di Arabidopsis. A) Immunostaining delle modificazioni della cromatina nei giovani primordi ovuli di rilevamento euchromatin (H3K4me3) e eterocromatina (H3K27me1). Il segnale anticorpo è verde, il DNA counterstained da ioduro di propidio in rosso. Una sovrapposizione di segnali fluorescenti viene mostrata insieme ad una foto in luce trasmissione con contrasto di interferenza differenziale (grigio). MMC sono indicati da contorni bianchi. A close-up del nucleo MMC è mostrato come inserto nel pannello superiore. Le immagini sono solo confocale sezione. B) immunorivelazione di GFP in un ovulo maturo.La GFP è stata immunoistochimica utilizzando anticorpi GFP-booster e l'ovulo è stato di contrasto con DAPI. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Whole-mount ibridazione in situ fluorescente in ovuli di Arabidopsis. Primordio ovulo è stato ibridato con una sonda di DNA specifico per 45S rDNA ripetere loci ed etichettato con Alexa 488 utilizzando la tecnologia FISH-Tag, e di contrasto con DAPI 26. Sono inoltre indicate la sovrapposizione di 45S rDNA con DAPI e l'immagine acquisita nel canale di trasmissione della luce (grigio). A close-up del nucleo MMC viene mostrato come inserto. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figuraure.
Figura 7. Influenza della fissazione, la digestione e procedura di colorazione sui segnali di DNA in ovuli tutto-mount. Ovuli A) maturi sono stati fissati 30 minuti sia con paraformaldeide al 4% o BVO fissativo e trattati 30 minuti o 1 ora con parete cellulare digerire mix enzima prima della colorazione del DNA con ioduro di propidio. Per una data partita, più di incubazione influisce più negativamente sugli ovuli di colorazione del DNA che sono stati risolti con paraformaldeide che con OLS. B) colorazione Whole-mount DNA utilizzando il reagente Feulgen a seguito di una richiesta di acido-idrolisi 28 o con ioduro di propidio in seguito alla non- denaturazione protocollo descritto nel testo. Il pannello superiore mostra un unico piano di sezione attraverso il sacco embrionale, il pannello inferiore presenta un ingrandimento di sopra del nucleo cella centrale mostra chiaramente alterazioneorganizzazione della cromatina in ovuli Feulgen-macchiati. CCN, nucleo centrale, ECN, nucleo della cellula uovo, syn, nucleo synergid. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In piante da fiore, il lignaggio riproduttivo femminile è circondato da diversi strati di cellule, tra cui il nucellus e tegumenti ovuli, rendendo la colorazione citologica in tutto il montaggio tecnicamente impegnativo. Qui vi presentiamo un protocollo efficace che consente la preparazione e l'elaborazione di un gran numero di ovuli adatti per la colorazione citologica come immunostaining, colorazione DNA e ibridazione in situ fluorescente in tutto il montaggio. Abbiamo utilizzato con successo per l'analisi della linea germinale riproduttivo femminile in Arabidopsis 21,22. Questo metodo è molto efficace come più slitte possono essere trattati in parallelo per differente colorazione. E 'anche robusto e dà distribuzione omogenea segnale e permette analisi quantitative riproducibili. Al contrario il metodo classico come Feulgen colorazione che comporta la denaturazione della struttura della cromatina, nostro protocollo conserva organizzazione della cromatina e epitopi nucleari. In addition, chiarimenti tessuto permette l'imaging dei segnali ad alta risoluzione a livello di singola cellula.
Questo protocollo può essere accelerato omettendo i passaggi descritti in 3.1 se i fiori sono stati fissati in paraformaldeide al 4% (in PBS + 1% Tween) al posto del tampone OLS (1.1). Anche se questa procedura più breve si è rivelato funzionale per diversi immunoistochimica 22-24, abbiamo scoperto che attenua la robustezza della colorazione di tutti i campioni, anticorpi e lotto di parete cellulare mix di digestione enzimatica (vedi sotto). Inoltre, non siamo riusciti a FISH ibridazione con questa breve procedura. Per immunorivelazione di GFP di usare le molecole di richiamo come mostrato Figura 5B, un protocollo simile a quello qui descritto è stato utilizzato con lievi modifiche al passo 1 e 3: carpelli sono state fissate nel 2,5% di formaldeide per 45 min (1.1), la prima fase di trattamento dei tessuti è stato ridotto a 5-10 trattamento min metanolo (3.1), è stata introdotta una fase di blocco (30 min in 2% BSA in PBS) prima all'anticorpo applicazione notte come descritto. Nessun anticorpo secondario è necessario con il booster.
Discutiamo qui di seguito alcuni passaggi critici:
Tissue Fissazione, dissezione e l'incorporamento.
Segnali Immunostaining e colorazione del DNA erano sempre più robusto e omogeneamente distribuiti quando il tessuto è stato campionato da piante meno di 5 settimane (a seguito del trasferimento della piantina nel terreno). Eventualmente, nelle nostre condizioni di crescita, un prolungato periodo di coltivazione può essere accompagnata da cambiamenti nella composizione biochimica della parete cellulare, influenzando a sua volta l'efficienza di elaborazione tessuto. Pertanto si consiglia di campionamento dei tessuti da relativamente giovani piante. Inoltre, il tessuto deve essere impedito di essiccazione durante la dissezione (leader altrimenti alterazione istologica e assenza di segnali di colorazione) mentre un eccesso di PBS contesta la manipolazione; un drenaggio delicato del eccesso di solution con la punta di tutto il tessuto depositata sul vetrino è quindi raccomandato. Inoltre, le bolle dovrebbero essere evitati nella miscela di acrilamide e mentre copre con un vetrino. Infine, i vetrini Superfrost Plus sono fortemente raccomandati per un'adesione adeguata acrilammide (cavo standard di qualità per i rilievi fragili e instabili nelle nostre mani), come appaiono superiori agli altri per tessuti e acrilammide adesione.
Fissazione, permeabilizzazione e la digestione della parete cellulare.
Digestione parete cellulare è un passo fondamentale di trattamento dei tessuti. Si pensa che questo passaggio facilita una buona penetrazione dei reagenti di colorazione omogeneamente in tutto il tessuto vegetale. Abbiamo sperimentato variabilità omogeneità di colorazione (da assenza di segnale, il segnale solo in una parte del tessuto, al 100% colorazione dei tessuti) a seconda del tempo di digestione e l'attività enzimatica (specifica-batch, descritto dal fornitore). Si raccomanda di produrre una grande quantità di soluzionedella miscela enzimatica (ad esempio 100 ml) e mantenere aliquote da 1 ml a -20 ° C. Ogni soluzione di riserva deve essere prima testato su 1-2 vetrini prima di utilizzare su larga scala. Inoltre, abbiamo sperimentato che il tipo di fissativo influenza l'efficienza di colorazione DNA in combinazione con tempo di lavorazione diversa di parete cellulare digerire: ovuli fissati in paraformaldeide al 4% hanno risentito incubazione prolungato con la miscela di digestione parete cellulare, mentre il tessuto fissato con l' soluzione BVO erano tolleranti ai tempi di digestione più lunghi e ha permesso una migliore colorazione del DNA (Figura 7A). Inoltre, un trattamento RNasi (DNasi gratuito) è strettamente necessario se il tessuto è di contrasto con ioduro di propidio come si lega anche alle molecole di RNA. Si sconsiglia di utilizzare 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) grazie alle sue ampie spettri di emissione fluorescenti sovrapposizione con altri fluorofori, ma anche di aberrazioni acromatici che necessitano di correzioni spostamento del canale post-acquisizione. Abbiamo ancheconsiglia contro colorazione Feulgen che richiede un acido-idrolisi durante la lavorazione del tessuto 28 che porta alla denaturazione cromatina particolare nel sacco embrionale (Figura 7B). Coloranti DNA alternative possono essere utilizzati anche 29, ma la loro efficacia non e 'stato testato qui.
Immunostaining.
Per immunoistochimica di modificazioni della cromatina, si consiglia di verificare la specificità dell'anticorpo primario nel database open source http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, come alcuni anticorpi disponibili in commercio hanno mostrato reazioni crociate per altre modifiche. Per le analisi quantificazione valle, è importante calibrare la concentrazione anticorpi e incubazione tempo per misurare i segnali in una relazione lineare con l'epitopo. Si consiglia di calibrare il tempo di diluizione dell'anticorpo e rilevamento utilizzando un anticorpo dilserie ution di 1:200, 1:500, 1:1000 e 12-24 ore di incubazione, rispettivamente, di individuare le condizioni che danno segnali robusti e omogenei. La diluizione più alta e breve tempo di incubazione permettendo segnali riproducibili dovrebbero essere utilizzati per analisi quantitative. Controlli senza anticorpo primario devono essere eseguiti per verificare la specificità. Se immunostaining produce colorazione aspecifica, si consiglia di bloccare con 5% BSA + 0.1% Tween in PBS per 2 ore a 4 ° C prima di applicare l'anticorpo primario. Segnali anticorpo può essere controllata sulla diapositiva prima controcolorazione DNA per verificare il successo dell'esperimento. Nelle nostre mani, lavaggio in PBT per 2-4 ore dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, e 1 ora dopo l'anticorpo secondario consente basse segnali di fondo anche senza bloccare.
Infine, questo protocollo è anche probabile applicabile ad altri tessuti vegetali (ad esempio root, frammento di foglia, meristema floreale) e probabilmente ad altre specie di piante, prozione che fornisce qualche aggiustamento sulla dissezione, parete cellulare digerire e permeabilizzazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
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