Summary
우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.
Abstract
꽃 피는 식물에서 체세포 - 투 - 생식 세포의 운명 전환은 성인 식물의 꽃 장기에 포자 어머니 세포의 사양 (SMCS)로 표시됩니다. 여성 SMC (megaspore 어머니 세포, MMC)는 난자 primordium의 차별화 및 감수 분열을 겪는다. 선택된 반수체 megaspore는 함께 액세서리 세포, 생식 세포에 상승을 줄 것이다 다세포 여성 배우체, 난자와 중앙 셀을 형성하기 위해 유사 분열을 겪는다. 난자 내부의 MMC, meiocyte과 여성 배우체의 제한된 접근성은 세포학에 대한 기술적 도전과 세포 유전은 단일 세포 수준에서 분석한다. 특히, 세포 핵 항원의 직접 또는 간접 면역이 식물 세포 및 단일 세포 이미징 내부의 시약의 가난한 침투에 의해 손상은 전체 마운트 조직에 광학 선명도의 부족에 의해 demised된다.
따라서, 우리는 nucl을 분석 할 수있는 효율적인 방법을 개발전체 마운트 포함 된 애기 장대의 난자에 하나의 셀의 높은 해상도에서 귀 조직과 염색질 수정. 이것은 현미경 슬라이드에 아크릴 아마이드 겔의 박층의 박리 및 고정 난자의 매립에 기초한다. 내장 된 난자는 면역 염색 시약으로 조직의 명확성과 침투성을 향상을 목표로 화학 및 효소 처리를 실시하고 있습니다. 그 치료는 세포 및 염색질 조직, DNA와 단백질 항원을 유지합니다. 샘플은 염색질 면역 염색, 원위치 혼성화 (FISH) 형광 및 이질 분석을위한 DNA 염색 등 다른 하류 세포 학적 분석을 위해 사용될 수있다. 3D 재구성 다음에 높은 해상도를 가진 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 영상은, 단일 셀 해상도에서 정량 측정 할 수 있습니다.
Introduction
꽃 식물의 생식 계통의 설립은 SMCS의 차별화, 여성 MMC 및 남성 microspore 어머니 세포로 시작합니다. MMC는 난자 primordium의 원심 끝에서 하위 표피 nucellar 세포에서 개발하고 microspore 어머니 세포 깊은 꽃 기관 (1)의 내부에 위치하는 꽃밥 locule에 sporogenous 조직에서 개발하고 있습니다. SMCS는 유사 분열시 배우체로 야기 반수체 포자를 생산하는 세포의 감수 분열을 받다. 여성 배우체, 또는 배아 골목, 하나의 난자, 하나의 중앙 세포, 두 synergids 세 antipodals으로 구성되어 있습니다. 남성 배우체, 또는 꽃가루는, 하나의 식물 세포와 두 개의 정자 세포로 구성되어 있습니다. 남성 배우체가 상대적으로 접근 객체의 학습 남아있는 동안, 여성 배우체는 자체가 꽃 심피 묶인 난자 내부에 포함하고, 따라서 분자 및 세포 학적 분석에 대한 특정 문제를 제기한다. 그러나 최근에는 레이저를 이용한미세 절제는 transcriptomic는 MMC와 여성 gametophytic 세포 2-4의 분석을 허용하는 훌륭한 솔루션을 제공했다. 후보 유전자 발현뿐만 아니라 세포 학적 분석은 특정 직접 세포의 염색 또는 간접적으로 면역 염색을 사용하여 내인성 세포 구성 요소의 역학을 조사, 현장 하이브리드 또는 리포터 유전자 분석의 예 RNA를 허용하여, 분석한다. 특히, 함께 염색질 수정이나 염색질 구성 요소의 면역 염색으로, 생선, DNA 염색을 이용하여 세포 유전 학적 염색은 애기 장대 5 염색질 역학과 핵 조직을 명료하게 중심 접근 방식이다. 일반적으로 세포의 감수 분열이 아니라 6,7 meiocytes 식물 남성에서 조사 된 특정 염색체의 역 동성을 수반한다; 가능성이 동적 성적인 프로그래밍을 반영하는 더 큰 규모의 셀 특정 염색질 재구성, 꽃가루 개발 8 ~ 10시에 설명되어 있습니다. 대조적으로 인해여성 meiocyte와 배우체의 상대적 어려움에,이 조사는 적용 할 기술적으로 어려운 남아 있고, 자주 (아래 참조) 단면 또는 수동 해부 및 소화 효소를 필요로한다. 또, 전체의 실장 광학 명확성 널리 부족 그대로 난자의 생식 세포의 고해상도 영상에 장애물이다.
전체 마운트 난자의 염색체 조직의 세포 학적 분석을위한 고전적인 방법은 Feulgen의 염색 11 ~ 13을 사용합니다. 이는 단백질 변성을 초래하고, 따라서 염색질 구조의 파괴를 일으키는 DNA의 (차아 염소산을 이용하여) 산 가수 분해를 수반한다. 또한, 여성 meiocytes 및 gametophytic 세포의 염색체 조직 (예를 들어 14 ~ 18 참조) 세미 얇은 부분 또는 해부 배아 주머니와 MMC에 DAPI 염색과 면역 염색을 이용하여 관찰 할 수있다. 분명히, 그러나, 수동 해부 및 절편은 노동 집약적이 될 수 있습니다염색질 에피토프의 다수의 정성 및 정량 분석을 방해한다.
여기에서 우리는 전체 마운트 하류 세포 학적 염색의 다양한 적합한 애기 난자의 큰 숫자를 준비하는 효율적인 프로토콜을 제공합니다. 간단히, 꽃 봉오리가 정착 용액에 배양, 난자의 행은 심피에서 해부하고 꽃가루 meiocytes (19, 20)에 대해 수행으로 슬라이드에 아크릴 아미드에 포함. 내장 된 난자는 더 메탄올, 에탄올, 세포 벽 소화 permeabilization 전에 자일 렌에서 지워 고정되어 있습니다. 이 단계의 가능한 변화는 설명합니다. 샘플은 DNA 염색, 면역 염색, 물고기를 사용할 수 있습니다. 준비 모드는 효율적이며 (최대 16 슬라이드를 다른 다운 스트림 분석을 위해 하루에 제조 할 수있다) 병렬 실험 장치 할 수 있습니다. 설명 치료, 전체 마운트에 균일 한 신호를 활성화하고 잘 조직 학적, 세포의 보존세포 유형 간의 질적 및 양적 비교에 도움이 생식 세포와 주변 nucellar 세포에서 핵 조직. 보정, 3 차원 재구성 다음 CLSM 기반의 고해상도 영상은 형광 신호의 의미있는 정량적 인 측정이 가능합니다. 우리는 성공적으로 차별화 된 MMC (21)과 여성 배우체 22 개발에 염색질의 역학을 분석하기 위해이 절차를 사용; 우리는 여기에서 전체 마운트 난자의 이질 염색질 분석, 크로 마틴 면역 염색, GFP의 면역 염색과 물고기의 대표적인 결과를 제시한다. 우리는 또한 우리의 프로토콜이 다른 식물 조직 및 종에 적합 할 것이라고 믿는다.
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Protocol
절차는 그림 1에서 워크 플로에 설명하고, 해부 및 조직의 매립에 대한 설정은 그림 2에 나타내었다.
1. 조직 고정
- 얼음에 갓 만든 BVO 정착액 버퍼를 포함하는 미세 원심 분리 튜브에 20 ~ 30 심피를 수집합니다.
- 부드러운 실온에서 진탕 조직 30 분 수정.
- 400 X g에서 벤치 탑 마이크로 원심 1 분에 정착의 심피가 들어있는 튜브를 스핀.
- 주의 깊게 정착 버퍼를 제거하고 PBT 1 ㎖를 추가, 얼음에 튜브를 배치합니다.
2. 해부 및 포함
- 갓 만든, 5 %의 아크릴 아미드의 혼합 각각 200 ㎕ 씩 다섯 에펜 도르프 튜브를 준비합니다.
- 다섯 Superfrost 슬라이드를 70 % 에탄올로 미리 청소하고 연필로 표시를 준비합니다.
- 한 20 % APS의 나누어지는 얼음에 20 % 낮잠 각을 해동.
- 컷 엔드 팁, 장소 4-5 심피을깨끗한 슬라이드에 그들, 액체의 초과를 제거합니다.
- 미세 바늘 길이 상처를 확인하고 그림과 그림 2와 난자의 행을 해제 할 심피 벽을 분리, PBS (이하 10 μL)로 덮어서 건조하지.
- 빨리 12 ㎕의 낮잠, 200 ㎕의 아크릴 아미드 믹스의 나누어지는 12 μL APS를 추가하고 혼합한다.
- 해부 난자에 활성화 된 아크릴 아미드의 30 μl를 추가합니다.
- 20 X 20mm의 커버 슬립 커버, 실내 온도, 45 ~ 60 분에서 중합 할 수 있습니다.
- 면도날을 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 이 단계에서, 샘플은 PBS를 포함하는 코 플린 항아리에서 4 ° C에서 하룻밤 동안 유지 될 수있다.
3. 조직 처리
참고 : 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2과 3.4.3를 제외한 모든 단계는 상온에서 화학 후드 아래에 80 ㎖의 용액으로 코 플린 단지에서 실시된다. 슬라이드에는 평면 팁 집게로 전송됩니다.
- 조직의 설명과고정 :
- 메탄올에서 5 분 알을 품다.
- 에탄올에 5 분을 품어.
- 크실렌 (1:1) : 에탄올에 30 분 알을 품다.
- 에탄올에 5 분을 품어.
- 메탄올에서 5 분 알을 품다.
- 2.5 %의 포름 알데히드와 보완, 메탄올, PBT (1:1)에 15 분 알을 품다.
- PBT에서 2 × 10 분을 씻어. 이 단계에서, 슬라이드는 4 ℃에서 하룻밤 동안 유지 될 수있다
- 세포벽 분해 :
- 얼음 세포벽 분해 믹스의 분취 량을 해동.
- 종이 타월에 수직으로 배치하여 액체의 과잉 배출, 코 플린 항아리에서 슬라이드를 타고.
- 아크릴 아미드 패드에 세포벽 분해 혼합 100 μl를 추가하고 23 X 46mm의 coverslip을 커버. 다른 슬라이드에 대해 반복합니다. (자료 참조) 습기 챔버에서 37 ° C에서 2 시간 동안 배양한다.
- PBT에서 슬라이드 2 × 5 분을 씻으십시오.
- 치료의 RNase :
- 코 플린 항아리에서 슬라이드를 타고, 일 드레인이전과 액체의 전자 과잉.
- 1 % 트윈 20 1 시간 동안 37 ° C에서 습기 챔버와 PBS에서 100 ㎍ / ml로 RNAseA 100 ㎕ 씩 각 슬라이드를 품어.
- PBT에서 2 × 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
- 후 고정 및 permeabilization :
- 갓 만든 PBT-F에서 20 분 동안 후 고정합니다.
- PBT에서 10 분 동안 슬라이드를 씻어.
- 4 ℃에서 2 % 트윈 (20)와 PBS에서 2 시간 동안 투과
- PBT에서 2 × 5 분 동안 슬라이드를 씻어.
4. 면역 염색
NOTE :이 단계에서, 일차 항체의 최적 농도는 서로 다른 희석 항체 (1:200, 1:500, 1:1000)를 사용하여 시험해야한다.
- 4 ℃에서 12 ~ 24 시간 동안 0.2 % 트윈 (20)와 PBS에 희석 차 항체 100 ㎕ 씩 각 슬라이드를 품어
- 부드러운 흔들림에 따라 실온에서 2-4 시간 동안 PBT에서 슬라이드를 씻으십시오.
- 적용이차 항체 1:200 PBS + 0.2 % 트윈 20 ~ 24 시간 동안 4 ℃에서
- 부드러운 흔들림에 따라 실온에서 1 시간 동안 PBT에서 슬라이드를 씻으십시오.
- 15 분 동안 PBS에서 10 ㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오드화물로 Counterstain 후 실온에서 부드럽게 진탕 PBS에서 15 분간 린스.
- 반대로 퇴색 액체의 mountant 마운트는 10 ㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오드 보충. 설치 매체가 CLSM으로 이미지를 획득하기 전에 1 시간 동안 강화하자.
5. 정량 이미징
- 이미지 수집 :
- 이상적으로 더 장시간 촬상 23 이상의 형광 신호의 보존 및 63X 글리세롤 침지 렌즈를 허용 공진 스캐닝 모드를 이용하여, CLSM을 이용한 고해상도 이미지를 획득.
- 엄격히 걸쳐 따르도록 표준 획득 절차를 정의하기 위해 이러한 실험의 시작에서 레이저 강도, 게인, 핀홀, 복셀의 크기 및 줌 배율 등 획득 파라미터를 테스트일관성있는 정량적 측정을위한 모든 슬라이드.
- 형광 색소 사이의 크로스 토크 (cross-talk)이 없음을 확인합니다. 존재하는 경우, 순차적 스캔을 설정합니다. 따로 따로가 아니라 동시에 전송 이미지를 획득.
- x 및 y 차원에서 가능한 가장 높은 해상도와 Z 치수 (나이 퀴 스트의 규칙)의 2 배 오버 샘플링과 시리얼, 입체 영상 획득을 수행합니다.
- 이미지 처리 :
- 상업용 또는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 세 가지 차원에서 일련의 이미지를 재구성.
- 3D에 대한 관심의 각 핵 (또는 셀)의 주위에 윤곽 표면을 정의합니다.
- 각 개체의 픽셀 강도의 합으로 각 채널에 형광의 양을.
- 통계 분석을위한 데이터를 Excel로 내 보냅니다. 예를 들면 DNA 염색 신호에 대한 항체 신호를 정상화.
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Representative Results
우리는 전체 마운트의 세포 학적 염색에 적합한 애기 난자의 대규모 준비 및 처리를위한 강력한 프로토콜을 제공합니다. 매립 덕분에, 난자는 3 차원 구조 (그림 3)를 유지한다. 또한, 광학 설명을 포함하여 조직 처리는 높은 해상도로 영상 세포 내 구조를 가능하게한다. 4 이질 염색질이 (더 디컨 볼 루션이 그림에 사용되지 않았다)도 눈에 초점을 정의, 밝은 표시 전체 마운트 난자 원기의 DNA 염색을 보여줍니다. 이러한 이미지는 MMC와 nucellus (그림 4) 21의 이질 염색질의 내용을 분석 하였다.
또한, 우리는 성공적으로 정량적 megaspore 어머니 세포 기능 megaspore 개발, 여성 배우체와 초기 배아 21, 22 ~ 24의 면역 염색에 의해 염색질의 역학을 분석하는이 프로토콜을 사용. 그림 5에 애기 장대의 난자에 면역 염색의 대표적인 결과를 보여줍니다. 그림 (a)는 euchromatin 관련 관대 마크의 megaspore 어머니 셀 (H3K4me3)와 이질 염색질 관련 억압 마크 등의 난자 원기있는 면역의 예를 보여줍니다 (H3K27me1이).도 5b는 배아 SAC (이 경우, 프로토콜은 약간 GFP 부스터 항체를 사용하기위한 수정 된 (논의를 참조)을 포함하여 성숙한 난자에서 GFP의 면역의 일례를 나타낸다. 또한 같은 기본 염색질 단백질을 검출 H3와 H1 21 절차가 염색질 단백질 항원을 유지 것을 보여. 절차는 또한 세포 유형 (예 : 생식 대 체세포, 주변 세포) (21) 사이의 비교를 가능하게 재현 quantifications 수 있습니다.
마지막으로, 우리는 성공적으로 FISH를 수행하기 위해이 절차를 적용은 전체 마운트 난자의 P에 대한 분석rimordia. 예를 nucleolar 조직 영역 (25)을 정의 45S rDNA의 반복에 대한 프로브를 사용하여 FISH 신호를 보여주는 그림 6과 같습니다. 약간의 수정과 함께 27 한 바와 같이 우리의 프로토콜에 설명 된대로 DNA의 counterstaining이 수행되는 동안 DNA 프로브를 직접 FISH-태그 (26)를 사용하여 알렉사 488로 표지 된, 하이브리드는 본질적으로 이루어졌다.
애기 장대의 난자에 현장 하이브리드의 면역 염색, DNA 염색과 형광의 그림 1. 워크 플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
해부 및 슬라이드 심피의 매립 그림 2. 설치. 심피 벽이 제거되고 심피는 (3 단계에서 가까운 해부 난자의 최대 참조) 난자의 행을 해제하는 슬라이드에 해부 한 다음 해부 심피가 내장되어 활성화 된 아크릴 아미드의 혼합에서, 20 X 20mm의 coverslip에 의해 덮여입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 프로토콜 광학 선명도와 균일 한 염색을 허용하면서 3 차원 구조를 보존 할 수 있습니다. 이미지를 XY, 표시된 XZ 및 YZ 축에서 3D 이미지의 분할 단면 뷰를 보여줍니다. 이미지 데이터에 의해 취득 된공 초점 레이저 주사 현미경과 Imaris 소프트웨어를 사용하여 3 차원으로 재구성은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 난자 primodia에서의 propidium 요오드화에 의해 DNA 염색을 전체 마운트 정확한 이질 염색질 정량화 할 수 있습니다. 왼쪽의 이미지가 난자 원기를 통해 전체 마운트 DNA 염색을 보여줍니다. MMC의 핵은 빨간색에 흰색 윤곽선과 nucellar 핵으로 표시됩니다. 3 차원 재구성 핵 계획이 오른쪽에 표시됩니다. 조직의 선명도는 내부에 형광 신호의 노란색 윤곽 및 정량 표시 이질 염색질의 초점의 고해상도 영상을 가능하게합니다. 그래프는 상대 heterochr을 보여분수 21 omatin. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 애기 장대의 난자에서 전체 마운트 면역 염색의 대표 결과. A) euchromatin (H3K4me3)와 이질 염색질 (H3K27me1)를 검출하는 젊은 난자 원기있는 염색질 수정의 면역 염색. 항체 신호는 적색 요오드화 프로피 듐으로 대조 DNA 녹색이다. 형광 신호의 오버레이 함께 미분 간섭 대비 (회색)를 사용하여 전송 빛의 그림에 표시됩니다. MMC의 흰색 윤곽선으로 표시됩니다. 상단 패널의 확대 그림과 같이 MMC 핵의 확대가 표시됩니다. 이미지는 성숙 난자에) GFP의 면역 검출 단일 공 촛점 섹션. B입니다.GFP는 GFP - 부스터 항체를 이용한 면역 염색하고 난자가 DAPI와 대조했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 애기 난자의 현장 하이브리드 화에서 전체 마운트 형광. 난자 primordium은 45S rDNA의 반복 궤적에 특정 DNA 프로브와 하이브리드 및 FISH-태그 기술을 사용하여 알렉사 488으로 표시하고, DAPI (26)와 대조했다. DAPI 및 (그레이) 투과광 채널에서 취득한 화상 45S rDNA 염기의 오버레이도 나타낸다. MMC 핵의 근접이 삽입으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오우레.
전체 마운트 난자에있는 DNA의 신호에 고정, 소화와 염색 과정의 그림 7.에 영향을 미친다.) 성숙한 난자가 하나 4 % 파라 포름 알데히드 또는 BVO의 정착으로 30 분 고정 된 효소의 혼합을 소화 세포벽 30 분 또는 1 시간 처리 프로피 디움 요오드와 DNA 염색 전에. 주어진 배치의 경우, 더 이상 배양은 BVO보다 파라 포름 알데히드로 고정 된 DNA 염색 난자에 더 부정적인 영향을 미칩니다. B) 전체 마운트 DNA 염색을 필요 산 가수 분해 28 다음 또는 다음의 propidium 요오드를 사용하여 Feulgen 시약을 사용하여 비 변성 프로토콜은 텍스트에 설명. 상단 패널은 배아 골목을 통해 하나의 평면 섹션을 보여줍니다, 하단 패널은 명확하게 변질을 보여주는 중앙 세포 핵에 배율을 제공합니다Feulgen 염색 난자의 염색질 조직. CCN, 중앙 세포핵, ECN, 난자의 핵, SYN, synergid 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
꽃 피는 식물에서 여성의 생식 계통 따라서 기술적으로 도전적인 전체 마운트의 세포 학적 염색법을 렌더링, nucellus와 난자 teguments를 포함한 여러 세포 층에 의해 둘러싸여 있습니다. 여기에서 우리는 전체 마운트의 현장 하이브리드의 면역 염색, DNA 염색 및 형광으로 세포 학적 염색에 적합한 난자의 많은 수의 준비 및 처리를 가능하게하는 효율적인 프로토콜을 제시한다. 우리는 성공적 아라비돕시스 21,22있는 여성 생식 생식선의 분석을 위해 사용 하였다. 여러 슬라이드를 다른 염색에 대한 병렬로 처리 할 수있는이 방법은 매우 효율적입니다. 또한 강력하고 균일 한 신호 분배를 제공하고 재현성있는 정량 분석 할 수 있습니다. 이러한 크로 마틴 구조의 변성을 포함 Feulgen 염색 등의 고전적인 방법과는 대조적으로, 우리의 프로토콜은 염색질 조직과 핵 항원을 유지합니다. 추가의ition, 티슈 해명은 단일 세포 수준에서 높은 해상도로 신호를 촬상 가능하게한다.
꽃 대신 BVO 버퍼 (1.1)의 4 % 파라 포름 알데히드 (PBS + 1 % 트윈에서)에서 수정 된 경우,이 프로토콜은 3.1에 설명 된 단계를 생략하여 신속히 할 수 있습니다. 이 짧은 절차가 22-24 면역 염색 여러 기능성 입증하는 동안, 우리는 (아래 참조) 샘플, 항체 및 세포 벽 소화 효소의 혼합 배치를 통해 염색의 견고성을 감쇠 것으로 나타났습니다. 또한 우리는이 짧은 절차 FISH 하이브리드에 대한 성공하지 않았다. 심피는 조직 처리의 제 1 단계, 45 분 (1.1)에 대해 2.5 %의 포름 알데히드로 고정 하였다 : 여기에서 설명은 단계 1 및 3에서 약간의 수정과 함께 사용되었을 때 GFP의 보인도 5b, 유사한 프로토콜로 부스터 분자를 사용하여 면역 검출 용 2 %에서 5 ~ 10 분 메탄올 처리 (3.1)로 단축하고, 차단하는 단계가 도입되었다 (30 분 B설명한 바와 같이 하룻밤 응용 프로그램을 항체하기 전에 PBS에서 SA). 이차 항체는 부스터 필요가 없습니다.
우리는 몇 가지 중요한 단계 아래 토론
조직 고정, 해부 및 포함.
면역 염색 및 DNA 염색 신호는 지속적으로 더 강력했고, 조직이 (토양에서 모종의 전송 다음)보다 5 주 이전 식물에서 채취 할 때 균일하게 분산. 아마도, 우리의 성장 조건에서 재배 장기간 차례로 조직 처리의 효율에 영향을 칸막이 벽의 생화학 적 조성 변화에 의해 수반 될 수있다. 따라서 우리는 상대적으로 젊은 식물에서 샘플링 조직을 추천합니다. 또, 조직을 PBS 중에서 과량 조작 도전하면서 (그렇지 학적 변화 및 염색 신호의 유무에 선행) 박리시의 건조를 방지한다; 졸의 초과의 부드러운 배수슬라이드에 부착 된 조직 주변의 팁의 ution 따라서 권장합니다. 또한, 기포가 아크릴 아미드의 혼합물에 피와 커버 슬립으로 커버하면서해야합니다. 그들은 조직과 아크릴 접착을 위해 다른 사람에게 우수한 표시 마지막으로, Superfrost 플러스 슬라이드는 강하게, 적절한 아크릴 접착 (우리의 손에있는 연약하고 불안정한 패드에 표준 품질 리드)을 권장합니다.
고정, permeabilisation 세포 벽 소화.
세포벽 소화 조직 처리의 중요한 단계이다. 이것은이 단계 균질 식물 조직에 걸쳐 염색 시약의 양호한 침투를 용이하게하는 것이 생각된다. 우리는 소화 시간 및 효소 활성에 따라 (조직의 일부의 신호가 신호로부터 100 % 조직 염색에 이르기까지) 염색 동질성에서 다양성을 경험 (배치 특정 공급자에 의해 설명). 이것은 스톡 용액을 다량 생산하는 추천효소의 혼합 (예를 들어 100 ㎖)와 -20 ℃에서 1 ㎖ 분량 씩 계속 각각의 원액을 먼저 큰 규모로 사용하기 전에 1 ~ 2 슬라이드에 테스트해야합니다. 티슈로 수정하는 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 고정 된 난자를 부정적으로, 세포벽 분해 믹스 장기간 배양에 의해 영향을했다 : 더욱이, 우리는 정착액의 분류 소화 세포벽에 대해 다른 처리 시간과 함께 DNA 염색의 효율에 영향을 미치는 것을 경험 BVO 솔루션은 더 이상 소화 시간에 관대했다 및 더 나은 DNA 염색 (그림 7A)를 허용했다. 그것은 또한 RNA 분자 결합으로 조직은 요오드화 프로피 듐으로 대조되는 경우뿐만 아니라, 이는 RNAse (DNase의 자유) 처리는 반드시 필요하다. 우리는 때문에 다른 형광체와 중복 광범위한 형광 발광 스펙트럼을뿐만 아니라 인수 후 채널 이동 수정을 필요로 무색 수차에 '4를 사용에 대해 -1,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)를 권장합니다. 우리는 또한특히 배아 낭 (그림 7B)에서 염색질 변성을 선도 조직 처리 28 일 동안 산 가수 분해를 필요로 Feulgen 염색에 좋습니다. 대체 DNA 염료도 29을 사용할 수 있지만, 효율성은 여기에서 테스트되지 않았습니다.
면역 염색.
염색질 수정의 면역 염색을 위해, 우리는 오픈 소스 데이터베이스의 기본 항체의 특이성을 확인하는 것이 좋습니다 http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 일부 상용 항체 교차 반응에 보이는, 30 다른 수정. 하류 정량 분석의 경우, 에피토프와 선형 관계에서 신호를 측정 항체 농도와 항온 처리 시간을 조정하는 것이 중요하다. 우리는 항체 희석액을 사용하여 항체의 희석 및 탐지 시간을 조정하는 것이 좋습니다1:200, 1:500, 1:1000의 12 ~ 24 시간 배양에서의 ution 시리즈는 각각 강력하고 균일 한 신호를주는 조건을 식별합니다. 재생 가능한 신호가 정량 분석에 사용되어야 있도록 가장 높은 희석 짧은 배양 시간. 차 항체가없는 컨트롤은 특이성에 대한 테스트를 수행해야합니다. 면역 염색은 불특정 염색을 생성하는 경우, 그것은 차 항체를 적용하기 전에 4 ° C에서 2 시간 동안 PBS에서 5 % BSA + 0.1 % 트윈으로 차단하는 것이 좋습니다. DNA의 counterstaining이 실험의 성공 여부를 확인하기 전에 항체 신호는 슬라이드에 확인할 수있다. 우리 손에, 차 항체와 부화 후 2 ~ 4 시간, 및 보조 항체 후 1 시간 동안 PBT 세척도 차단하지 않고 낮은 배경 신호를 할 수 있습니다.
마지막으로,이 프로토콜은 다른 식물 조직 (예를 들어, 뿌리, 잎 조각, 꽃 분열 조직)에 적용 가능성 및 아마 다른 식물 종에, 프로입니다해부에 약간의 조정을 확립하기 세포벽 소화 permeabilization.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
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