Summary
Nós fornecemos aqui um protocolo eficiente e confiável para a imunocoloração, hibridação in situ fluorescente, a coloração do DNA seguido de quantitativo, imagem de alta resolução em Arabidopsis thaliana óvulos inteiros de montagem. Este método foi utilizado com sucesso para analisar as modificações da cromatina e arquitectura nuclear.
Abstract
Em plantas com flores, a transição destino de células somáticas-to-reprodutiva é marcada pela especificação de células-mãe de esporos (PMEs) em órgãos florais da planta adulta. O SMC feminino (célula mãe de megásporo, MMC) diferencia no primórdio óvulo e sofre meiose. O megásporo haplóide selecionado então sofre mitose para formar o gametófito multicelular feminino, o que dará origem aos gametas, o óvulo ea célula central, juntamente com células acessórias. A acessibilidade limitada do MMC, meiocyte e gametófito feminino no interior do óvulo é tecnicamente desafiador para citológico e análises citogenéticas em nível de célula única. Particularmente, imunodetecção directa ou indirecta de epítopos celulares ou nucleares é prejudicada pela falta de penetração dos reagentes no interior da célula vegetal e de uma única célula de imagem é demised pela falta de claridade óptica em todo-montagem tecidos.
Assim, desenvolvemos um método eficiente para analisar os nuclorganização orelha e modificação da cromatina em alta resolução de uma única célula em Todo-mount óvulos Arabidopsis incorporados. Ele baseia-se na incorporação de dissecção e óvulos fixos em uma fina camada de gel de acrilamida a uma lâmina de microscópio. Os óvulos embarcados são submetidos a tratamentos químicos e enzimáticos com o objetivo de melhorar a clareza do tecido e permeabilidade aos reagentes de positividade. Esses tratamentos preservar organização, DNA e proteínas epítopos celulares e cromatina. As amostras podem ser utilizadas para diferentes análises citológicas a jusante, incluindo a imunocoloração da cromatina, hibridação in situ fluorescente (FISH), e a coloração de ADN para análise de heterocromatina. Microscopia confocal a laser (CLSM) de imagem, com alta resolução, seguido de reconstrução 3D permite medições quantitativas na resolução de uma única célula.
Introduction
Em plantas com flores, o estabelecimento de linhagens de reprodução inicia-se com a diferenciação de células musculares lisas, MMC feminino e célula-mãe microspore masculino. A MMC desenvolve a partir de uma célula nucelar sub-epidérmica na ponta distal do primórdio óvulo, e a célula mãe micrósporos se desenvolve a partir de tecido esporogênico na antera lóculo, que estão localizados no fundo dos órgãos florais 1. SMCs sofrer meiose para produzir esporos haplóides, que depois dão origem aos gametófitos sobre mitose. O gametófito feminino ou saco embrionário, consiste de uma célula-ovo, uma célula central, dois sinérgides e três antípodas. O gametófito masculino, ou o pólen, é composto de uma célula vegetativa e duas células espermáticas. Enquanto o gametófito masculino continua a ser um objeto de estudo-de-relativamente acessível, o gametófito feminino é incorporado dentro do óvulo, por sua vez incluído no carpelo flor, e, assim, coloca desafios específicos para análises moleculares e citológicas. Recentemente, no entanto, de laser assistidamicrodissection ofereceu uma solução elegante que permite análises transcriptomic no MMC e células gametófitos femininos 2-4. Em adição à expressão do gene candidato analisa, por exemplo, utilizando ARN de hibridação in situ ou ensaios de gene repórter, análises citológicas permite investigar a dinâmica de componentes celulares endógenas utilizando coloração celular directa específica ou imunocoloração indirecta. Particularmente, coloração citogenética utilizando FISH e coloração do DNA, juntamente com imunocoloração de modificações da cromatina ou componentes de cromatina são abordagens centrais para elucidar a dinâmica da cromatina e organização nuclear em Arabidopsis 5. Normalmente, a meiose implica dinâmica cromossômicas específicas que tem sido bem investigados em planta macho meiócitos 6,7; ainda em grande escala, específico de célula cromatina reorganização, provavelmente refletindo a reprogramação epigenética dinâmica foi descrito durante o desenvolvimento do pólen 8-10. Por outro lado, devidoà relativa inacessibilidade do meiocyte fêmea e gametófito, estas investigações continuam tecnicamente difíceis de aplicar, e exigem muitas vezes a dissecção de corte ou manual e digestão enzimática (ver abaixo). Além disso, o prevalente falta de clareza óptica em todo o monte é um obstáculo para imagens de alta resolução de células reprodutivas em óvulos intactas.
Um método clássico para a análise citológica da organização cromossômica em óvulos inteiros de montagem usa coloração de Feulgen 11-13. Trata-se hidrólise ácida (utilizando um ácido hipocloroso) do ADN o que resulta em desnaturação das proteínas e, assim, causa a destruição da estrutura da cromatina. Alternativamente, organização cromossomo em meiócitos femininos e células gametófitos podem ser observados por meio da coloração DAPI e imunocoloração em seções semi-finas ou sacos de embriões dissecados e MMC (por exemplo ver 14-18). Claramente, no entanto, a dissecção manual e corte pode ser de trabalho intensivo eimpede a análise qualitativa e quantitativa de um grande número de epítopos de cromatina.
Aqui nós fornecemos um protocolo eficiente para preparar um grande número de óvulos Arabidopsis adequados para uma variedade de coloração citológica jusante em todo-mount. Em breve, botões de flores são incubadas numa solução fixadora, linhas de óvulos são dissecados do carpelo e incorporado em acrilamida na corrediça, como feito para meiócitos pólen 19,20. Os óvulos são incorporados mais afastada e fixadas em metanol, etanol, e xileno, antes da digestão da parede celular e permeabilização. São discutidas possíveis variações destes passos. As amostras podem em seguida ser utilizado para a coloração de ADN, a imunocoloração, e FISH. O modo de preparação é eficiente e permite a paralela conjunto experimental (até 16 lâminas pode ser preparado de um dia para análise a jusante diferente). Os tratamentos descritos permitem sinais homogêneas em todo-mount e bem preservado histológico, celular,e organização nuclear em células reprodutivas e células nucelares vizinhas que beneficiam comparações qualitativas e quantitativas entre os tipos de células. Calibrado, imagens de alta resolução baseado em CLSM seguido de reconstrução em 3 dimensões permite medições quantitativas significativas de sinais fluorescentes. Temos utilizado com sucesso este procedimento para analisar a dinâmica da cromatina no MMC diferenciando 21 e desenvolvendo gametófito feminino 22; Apresentamos aqui resultados representativos de análise heterochromatin, immunostaining cromatina, GFP imunocoloração e peixes em todo-montagem óvulos. Além disso, acreditamos que o nosso protocolo irá ser adequado para outros tecidos e espécies vegetais.
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Protocol
O procedimento é descrito no fluxo de trabalho na Figura 1, e a configuração para a dissecção e a incorporação de tecidos são apresentados na Figura 2.
1. Fixação do tecido
- Recolher 20-30 carpelos em um tubo de microcentrífuga contendo feita recentemente tampão fixador BVO em gelo.
- Fixar o tecido 30 min com agitação suave à temperatura ambiente.
- Girar os tubos contendo as carpelos em fixador em uma microcentrífuga de bancada 1 min a 400 x g.
- Retire cuidadosamente o tampão fixador e adicionar 1 ml de PBT, colocar os tubos no gelo.
2. Dissection and Embedding
- Preparar cinco tubos de Eppendorf com 200 ul de cada uma feita recentemente, 5% de mistura de acrilamida.
- Prepare cinco lâminas Superfrost pré-limpos com etanol 70% e marcadas com um lápis.
- Descongelar uma alíquota de 20% de EPA e 20% NaPS cada, em gelo.
- Toma 4-5 carpelos com uma ponta de corte-end, lugarlos numa lâmina de limpeza, remover o excesso de líquido.
- Faça cortes longitudinais com uma agulha fina e retire as paredes carpelo para liberar fileiras de óvulos como mostra a Figura 2, evitar a secagem cobrindo com PBS (não mais de 10 mL).
- Adicione rapidamente e misturar 12 ml, 12 NaPS APS ul com uma alíquota de 200 mL da mistura de acrilamida.
- Adicionar 30 ul da acrilamida activado para os óvulos dissecados.
- Cubra com uma lamela mm 20 x 20, vamos polimerização à temperatura ambiente, 45-60 min.
- Retirar as lamelas usando uma lâmina de barbear. Nesta fase, as amostras podem ser mantidas durante a noite a 4 ° C num frasco Coplin contendo PBS.
3. Processamento de Tecidos
NOTA: Todas as etapas, exceto 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 e 3.4.3 são realizadas em frascos Coplin com 80 ml da solução sob o capô química à temperatura ambiente. Slides são transferidos com um de ponta plana fórceps.
- Clarificação tecido efixação:
- Incubar 5 min em metanol.
- Incubar 5 min em etanol.
- Incubar 30 minutos em etanol: xileno (1:1).
- Incubar 5 min em etanol.
- Incubar 5 min em metanol.
- Incubar 15 minutos em metanol e PBT (1:1), complementado com 2,5% de formaldeído.
- Lavar 2 x 10 minutos em PBT. Neste estágio, os slides podem ser mantidas durante a noite a 4 ° C.
- Digestão da parede celular:
- Descongelar uma aliquota da mistura de digestão da parede celular em gelo.
- Tome um slide da jarra de Coplin, drenar o excesso de líquido, colocando-o verticalmente sobre uma toalha de papel.
- Adicione 100 ml de mistura de digestão da parede celular sobre a almofada de acrilamida e cobrir com uma lamela mm 23 x 46. Repita o procedimento para os demais slides. Incubar durante 2 horas a 37 ° C numa câmara húmida (descrito em Materiais).
- Lavar as lâminas 2 x 5 minutos em PBT.
- RNase A de tratamento:
- Tome um slide da jarra de Coplin, escorra ªe o excesso de líquido, como antes.
- Incubar cada lâmina com 100 ul de ARNase A a 100 ng / mL em PBS com 1% de Tween-20 durante 1 hora a 37 ° C numa câmara húmida.
- Lavar as lâminas durante 2 x 5 minutos em PBT.
- Pós-fixação e permeabilização:
- Post-correção para 20 min no recentemente feito PBT-F.
- Lavar as lâminas por 10 minutos em PBT.
- Permeabilizar durante 2 horas em PBS com 2% de Tween-20 a 4 ° C.
- Lavar as lâminas por 2 x 5 minutos em PBT.
4. Imunocoloração
NOTA: Para este passo, a concentração óptima do anticorpo primário tem de ser testada por meio de diferentes diluições (1:200, 1:500, 1:1000) dos anticorpos.
- Incubar cada lâmina com 100 uL de anticorpo primário diluído em PBS com 0,2% de Tween-20 durante 12-24 horas a 4 ° C.
- Lavar as lâminas em PBT durante 2-4 horas à temperatura ambiente, sob agitação suave.
- Aplique o1:200 de anticorpo secundário em PBS + 0,2% de Tween-20 durante 24 horas a 4 ° C.
- Lavar as lâminas em PBT durante uma hora à temperatura ambiente, sob agitação suave.
- Contracoloração com 10 ug / ml de iodeto de propidio em PBS durante 15 minutos, depois enxaguar 15 min em PBS, sob agitação suave, à temperatura ambiente.
- Monte em anti-desbotamento montagem líquido suplementado com 10 mg / ml de iodeto de propídio. Deixe o meio de montagem endurecer por 1 hora antes de adquirir imagens por CLSM.
5. Imagens quantitativas
- A aquisição de imagens:
- Adquirir imagens de alta resolução usando CLSM, o ideal é usar um modo de digitalização de ressonância, o que permite uma melhor preservação dos sinais fluorescentes sobre imagem prolongada 23, e uma lente de imersão 63X de glicerol.
- Teste os parâmetros de aquisição, como a intensidade do laser, o ganho, pinhole, tamanho voxel e fator de zoom no início do experimento para definir um procedimento de aquisição padrão a seguir rigorosamente todotodos os slides para medições quantitativas consistentes.
- Determinar a ausência de cross-talk entre fluorocromos. Se estiver presente, configurar uma verificação seqüencial. Adquirir imagens de transmissão separadamente e não simultaneamente.
- Realize serial, aquisição de imagem tridimensional com resolução mais alta possível nos dimensões X e Y e com oversampling 2x na dimensão z (regra de Nyquist).
- Processamento de imagem:
- Reconstruir imagens de série em três dimensões usando o software de fonte comercial ou aberto.
- Definir superfícies de contorno ao redor de cada núcleo (ou célula) de interesse em 3D.
- Quantificar a fluorescência em cada canal, como a soma da intensidade dos pixels de cada objecto.
- Exportar os dados para o Excel para análises estatísticas. Normalizar sinais de anticorpos contra os sinais de coloração, por exemplo DNA.
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Representative Results
Nós fornecemos um protocolo robusto para a preparação em grande escala e de processamento de óvulos Arabidopsis adequados para exames citológicos em todo-mount. Graças à incorporação, os óvulos manter uma estrutura 3-dimensional (Figura 3). Além disso, o processamento de tecidos, incluindo esclarecimento de imagem óptico permite estruturas subcelulares em alta resolução. Figura 4 mostra a coloração de DNA em todo primórdios óvulo de montagem onde heterochromatin aparece como brilhante, bem definido focos conspícuo (sem deconvolução foi usado para esta imagem). Estas imagens foram usadas para a análise de conteúdo de heterocromatina no MMC e nucelo (Figura 4) 21.
Além disso, temos utilizado com sucesso este protocolo para analisar quantitativamente a dinâmica da cromatina por imunomarcação em células mãe de megásporo, megásporo funcional, desenvolvendo gametófito feminino e embrião 21, 22-24. Na Figura 5 de Arabidopsis. Figura 5A mostra um exemplo de imunodetecção em primórdios óvulo, incluindo a célula mãe de megásporo, de uma marca associada ao permissivo euchromatin (H3K4me3) e uma marca associada à repressão heterochromatin (H3K27me1). Figura 5B mostra um exemplo de imunodetecção GFP em um óvulo maduro, incluindo o saco embrionário (neste caso, o protocolo foi ligeiramente modificado para o uso do anticorpo GFP reforço (ver discussão). Também detectou proteínas de cromatina nativo, tal como o H3 H1 21 e que mostra que o processo de preserva epitopos da proteína de cromatina. O processo também permite a quantificação reprodutíveis permitindo a comparação entre os tipos de células (por exemplo, vs somáticas reprodutivo, as células vizinhas) 21.
Finalmente, também aplicado com sucesso este procedimento para realizar FISH análises sobre todo-mount óvulo primordia. Um exemplo é mostrado na Figura 6, que mostra sinais de FISH usando uma sonda contra 45S rDNA repete a definição das regiões organizadoras de nucléolo 25. A sonda de ADN foi marcada directamente com Alexa 488 utilizando FISH-Tag 26, a hibridação foi realizada essencialmente tal como descrito com pequenas modificações 27, enquanto que o ADN A contracoloração foi realizada como descrito no protocolo.
Figura 1. Fluxo de Trabalho de imunomarcação, a coloração do DNA e hibridização fluorescente in situ em óvulos de Arabidopsis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Configuração para dissecção e incorporação de carpelos em slide. A parede do carpelo é removido eo carpelo é dissecado no slide para liberar linhas de óvulos (ver close-up de óvulos dissecados no passo 3), e então o carpelo dissecado é incorporado no mix de acrilamida ativado, coberto por 20 x 20 mm lamela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. O protocolo permite preservar a estrutura 3-dimensional, permitindo a claridade óptica e coloração homogénea. As imagens mostra uma vista em secção de separação da imagem em 3D em XY, XZ e YZ eixo, como indicado. Os dados de imagem foram adquiridos pelamicroscopia confocal a laser e reconstruído em três dimensões usando o software Imaris. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Todo-mount coloração DNA por iodeto de propídio em primodia óvulo permite a quantificação heterochromatin preciso. A imagem à esquerda mostra coloração DNA inteiro de montagem em toda a primórdios óvulo. Um núcleo MMC é marcada por um contorno de branco e um núcleo nucelar no vermelho. Projeções de núcleos 3D reconstruídas são mostrados à direita. A clareza do tecido permite que imagens de alta resolução dos focos Heterocromatinas marcados por um contorno amarelo e quantificação dos sinais de fluorescência das mesmas. Os gráficos mostram a relação heterochromatin fração 21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Resultados representativos de todo-mount imunocoloração em óvulos de Arabidopsis. A) A imunocoloração de modificações da cromatina em jovens primórdios ovule detecção euchromatin (H3K4me3) e heterocromatina (H3K27me1). O sinal de anticorpo é verde, o ADN contrastadas pelo iodeto de propídio em vermelho. Uma sobreposição de sinais fluorescentes é mostrado junto com uma foto na luz transmissão usando interferência diferencial contraste (cinza). MMCs são indicados por contornos brancos. Um close-up do núcleo MMC é mostrado como inserida no painel superior. As imagens são confocal única seção. B) Imunodetecção de GFP em um óvulo maduro.A GFP foi histoquímica utilizando anticorpo GFP-booster eo óvulo foi contrastado com DAPI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Whole-mount hibridização fluorescente in situ em óvulos de Arabidopsis. Primórdio O óvulo foi hibridizada com uma sonda de DNA específica para 45S rDNA repeat loci e rotulado com Alexa 488 usando a tecnologia FISH-Tag, e contrastado com DAPI 26. A sobreposição de 45S rDNA com DAPI e imagem adquirida no canal de transmissão de luz (cinza) também são mostrados. Um close-up do núcleo MMC é mostrado como inserção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figure.
Figura 7. Influência da fixação, a digestão e o processo de coloração em sinais de ADN em óvulos conjunto de montagem. Óvulos A) maduros foram fixadas 30 min ou com 4% de paraformaldeído ou BVO fixador e processada 30 min ou 1 hora com a parede da célula digerir mistura de enzima antes da coloração do ADN com iodeto de propidio. Para um determinado lote, mais de incubação afeta mais negativamente sobre os óvulos de coloração de DNA que foram corrigidos com paraformaldeído que com BVO. B) coloração Whole-mount DNA usando o reagente Feulgen seguindo um ácido-hidrólise necessário 28 ou usando iodeto de propídio, após a não- protocolo de desnaturação descrito no texto. O painel superior mostra uma seção plano único através do saco embrionário, o painel inferior apresenta uma ampliação sobre o núcleo da célula central, mostrando claramente a alteração deorganização da cromatina em óvulos Feulgen-manchadas. CCN, núcleo da célula central, ECN, núcleo da célula ovo, syn, núcleo synergid. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em plantas com flores, a linhagem reprodutor feminino é cercado por várias camadas de células, incluindo o nucelo e os tegumentos óvulo, tornando assim a coloração citológica em toda montagem tecnicamente desafiador. Aqui apresentamos um protocolo eficiente que permite a preparação e processamento de um grande número de óvulos adequados para a coloração citológica como imunomarcação, a coloração do DNA e hibridização fluorescente in situ no todo-mount. Foi utilizado com sucesso para a análise da linhagem germinativa reprodutor feminino em Arabidopsis 21,22. Este método é altamente eficaz como várias lâminas podem ser tratados em paralelo para a coloração diferente. Ela também é robusto e dá a distribuição do sinal homogéneo e permita análises quantitativas reprodutíveis. Em contraste com o método clássico tal como a coloração de Feulgen que envolve a desnaturação da estrutura da cromatina, o nosso protocolo preserva organização da cromatina e epitopos nucleares. Em addition, clarificação tecido permite imaginando os sinais em alta resolução no nível de uma única célula.
Este protocolo pode ser acelerada por omitindo as etapas descritas em 3.1, se as flores foram fixadas em paraformaldeído a 4% (em PBS + 1% de Tween), em vez de tampão de BVO (1.1). Embora este procedimento mais curto mostrou funcional para vários imunomarcação 22-24, descobrimos que ele atenua a robustez da coloração através de amostras, anticorpos e lote de parede celular mistura de enzimas da digestão (veja abaixo). Além disso, não foram bem-sucedidas para a hibridização FISH com este procedimento curto. Para a imunodetecção de GFP de utilizar as moléculas de reforço, como mostrado na Figura 5B, um protocolo similar ao descrito aqui foi utilizado, com ligeiras modificações no passo 1 e 3: carpelos foram fixadas em 2,5% de formaldeído durante 45 minutos (1.1), o primeiro passo de processamento de tecidos foi reduzido para 5-10 minutos tratamento metanol (3.1), um passo de bloqueamento foi introduzida (30 min em 2% de BSA em PBS) antes da aplicação de anticorpo durante a noite, como descrito. Não é necessário o anticorpo secundário com o reforço.
Discutimos abaixo alguns passos importantes:
Fixação do tecido, dissecção e incorporação.
Sinais de imunocoloração e coloração do DNA foram consistentemente mais robusta e distribuída homogeneamente quando o tecido foi coletada a partir de plantas com menos de 5 semanas de idade (após a transferência das mudas no solo). Possivelmente, nas nossas condições de crescimento, um período prolongado de cultivo pode ser acompanhada por alterações na composição bioquímica da parede da célula, por sua vez, influenciam a eficiência do processamento do tecido. Assim, recomendamos tecido amostragem de plantas relativamente jovens. Além disso, o tecido deve ser impedido de se secar durante a dissecção (líder de outra forma de alteração histológica e na ausência de sinais de coloração), enquanto que um excesso de PBS desafia a manipulação; um escoamento suave do excesso de solbuição com a ponta ao redor do tecido depositado no slide é, portanto, recomendado. Além disso, as bolhas devem ser evitadas na mistura de acrilamida e durante a cobertura com uma lamela. Finalmente, as lâminas Superfrost Plus são altamente recomendados para adesão acrilamida adequada (chumbo padrão de qualidade para frágeis e instáveis almofadas em nossas mãos), em que aparecem superior aos outros para tecido e adesão acrilamida.
Fixação, permeabilização e digestão da parede celular.
Digestão da parede celular é uma etapa crítica do processamento de tecidos. Pensa-se que este passo facilita uma boa penetração dos reagentes de coloração de forma homogénea por todo o tecido da planta. Nós experiente variabilidade na coloração de homogeneidade (variando entre sem sinal, de sinal em apenas uma parte do tecido, para a coloração de tecidos de 100%), dependendo do tempo de digestão e a actividade enzimática (específica do lote, descrito pelo fornecedor). Recomenda-se produzir uma grande quantidade de solução de estoqueda mistura de enzimas (por exemplo, 100 mL) e manter a alíquotas de 1 ml a -20 ° C. Cada solução de reserva deve ser primeiro testado em 1-2 lâminas antes de usar em larga escala. Por outro lado, tivemos que o tipo de fixador influencia a eficiência de marcação de DNA em combinação com diferentes tempos de tratamento para a parede da célula digerir: óvulos fixos em paraformaldeído a 4% foram afectados negativamente por incubação prolongada com a mistura de digestão da parede celular, enquanto o tecido fixado com o solução BVO foram tolerantes a períodos de digestão mais longos e permitiu uma melhor coloração do DNA (Figura 7A). Além disso, um tratamento com RNAse (DNase) é estritamente necessário, se o tecido é contrastado com iodeto de propídio como ele também se liga a moléculas de ARN. Aconselhamos contra o uso de 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), devido aos seus espectros de emissão fluorescente amplas sobrepostas com outros fluoróforos, mas também para as aberrações acromáticas que exigem correções de deslocamento do canal de pós-aquisição. Nós tambémrecomendado contra as manchas de Feulgen que requer uma hidrólise ácida durante o processamento do tecido 28, que conduz para a desnaturação da cromatina particularmente no saco embrionário (Figura 7B). Corantes alternativos de ADN também pode ser usado 29, mas a sua eficácia ainda não foi testada aqui.
Imunocoloração.
Para imunocoloração de modificações da cromatina, recomendamos para verificar a especificidade do anticorpo primário no banco de dados open source http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, como alguns anticorpos comercialmente disponíveis mostraram reações cruzadas para outras modificações. Para as análises de quantificação a jusante, isto é importante para calibrar o tempo de incubação e concentração de anticorpos para medir os sinais em uma relação linear com o epitopo. Recomendamos calibrar o tempo de diluição do anticorpo e detecção utilizando um anticorpo dilution série de 1:200, 1:500, 1:1000 e 12-24 horas de incubação, respectivamente, para identificar as condições que dão sinais robustos e homogêneas. A diluição mais elevada e menor tempo de incubação que permite sinais reprodutíveis devem ser utilizados para a análise quantitativa. Controlos sem anticorpos primários deve ser realizado para testar a especificidade. Se imunocoloração produz a coloração não específica, é aconselhável para bloquear com BSA a 5% + 0,1% de Tween em PBS durante 2 horas a 4 ° C antes da aplicação do anticorpo primário. Sinais de anticorpos pode ser verificado no slide antes contracoloração DNA para verificar o sucesso do experimento. Nas nossas mãos, lavagem em PBT durante 2-4 horas após a incubação com o anticorpo primário, e 1 h após o anticorpo secundário permite baixos sinais de fundo, mesmo sem bloqueio.
Finalmente, este protocolo também é provável aplicável a outros tecidos vegetais (por exemplo, de raiz, fragmento de folha, meristema floral) e, provavelmente, de outras espécies vegetais, pronecer algum ajuste na dissecação, parede celular digerir e permeabilização.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
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