Summary
אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.
Abstract
בצמחים פורחים, המעבר גורל תא סומטי לרבייה מתאפיין במפרט של תאי אם נבג (SMCs) באיברים פרחוניים של הצמח הבוגר. נקבת SMC (תא האם megaspore, MMC) מבדיל בprimordium הביצית ועובר מיוזה. Megaspore הפלואידים שנבחר לאחר מכן עובר מיטוזה ליצירת הנשית gametophyte רב תאי, שיהיה להצמיח תאי הרבייה, תא הביצית ותא מרכזי, יחד עם תאי אבזר. הנגישות המוגבלת של MMC, meiocyte וgametophyte הנשי בתוך הביצית היא מאתגרת מבחינה טכנית לציטולוגיה וציטוגנטית מנתח ברמת תא בודדת. במיוחד, immunodetection ישיר או העקיף של אפיטופים סלולריים או גרעיניים נפגעים על ידי חדירה ירודה של חומרים כימיים בתוך ההדמיה תא צמח ותא בודד demised ידי חוסר הבהירות אופטית ברקמות כל הר.
לכן, פיתחנו שיטה יעילה לנתח nuclארגון אוזן ושינוי הכרומטין ברזולוציה גבוהה של תא בודד בכל הר ביציות ארבידופסיס משובצים. היא מבוססת על נתיחה והטבעה של ביציות קבועות בשכבה דקה של ג'ל acrylamide בשקופית מיקרוסקופית. הביציות מוטבעות חשופים לטיפולים כימיים והאנזימטית שמטרתן שיפור בהירות וחדירות רקמה לחומרים הכימיים immunostaining. טיפולים אלה לשמר אפיטופים ארגון, דנ"א וחלבון תאיים והכרומטין. הדגימות יכולות לשמש לניתוחים שונים במורד הזרם ציטולוגית, כוללים immunostaining הכרומטין, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), ומכתים DNA לניתוח heterochromatin. הדמיה מיקרוסקופית סריקת לייזר confocal (CLSM), עם רזולוציה גבוהה, ואחריו שחזור 3D מאפשרת למדידות כמותיות ברזולוציה תא בודד.
Introduction
בצמחים פורחים, הקמת שושלות רבייה מתחילה בבידול של SMCs, MMC הנשי ותא האם נבגון גברי. MMC מתפתח מתא nucellar תת אפידרמיס בקצה הדיסטלי של primordium הביצית, והתא האם נבגון מתפתח מרקמת sporogenous במאבק locule, אשר ממוקמים עמוק בתוך האיברים פרחוניים 1. SMCs לעבור מיוזה לייצר נבגים הפלואידים, אשר לאחר מכן להצמיח gametophytes על מיטוזה. נקבת gametophyte, או שק עובר, מורכב מתא אחד ביצה, תא מרכזי אחד, שתיים ושלוש synergids antipodals. Gametophyte הגברי, או האבקה, מורכבת מתא אחד של צמח ושני תאי זרע. בעוד gametophyte הזכר נשאר מחקר אובייקט-of-יחסית נגיש, הנשי gametophyte מוטבע בתוך הביצית, את עצמו מוקף בcarpel הפרח, ובכך מציב אתגרים ספציפיים לניתוחים מולקולריים וציטולוגיה. לאחרונה, עם זאת, בסיוע לייזרmicrodissection הציע פתרון אלגנטי המאפשר transcriptomic מנתח בMMC ותאי gametophytic הנשיים 2-4. בנוסף לביטוי גני מועמד מנתח, תוך שימוש למשל RNA הכלאה באתר או מבחני גן כתב, ניתוחי ציטולוגית מאפשר חוקרים את הדינמיקה של מרכיבים תאיים אנדוגני באמצעות מכתים ספציפי ישיר הסלולר או immunostaining העקיף. במיוחד, מכתים ציטוגנטית באמצעות דגים ומכתימים-DNA, יחד עם immunostaining של שינויי הכרומטין או רכיבי הכרומטין גישות מרכזיות על מנת להבהיר דינמיקת הכרומטין וארגון גרעיני בארבידופסיס 5. בדרך כלל, מיוזה כרוכה דינמיקה של כרומוזום מסוימת שנחקרה היטב בזכר מפעל meiocytes 6,7; בקנה מידה גדול עוד יותר, ארגון מחדש הכרומטין תא ספציפי, סביר המשקף את תכנות מחדש אפיגנטיים דינמי תוארה במהלך התפתחות אבקת 8-10. לעומת זאת, בשללנגישות היחסית של נקבת meiocyte וgametophyte, החקירות אלה נשארים קשות מבחינה טכנית ליישם, ולעתים קרובות דורשות נתיחת חתך או הוראות ועיכול אנזימטי (ראה להלן). בנוסף, חוסר הרווח של בהירות אופטית בכל ההר הוא מכשול להדמיה ברזולוציה גבוהה של תאי רבייה בביציות ללא פגע.
שיטה קלאסית לניתוח ציטולוגית של ארגון כרומוזום בביציות כל הר משתמשת בהכתמה של Feulgen 11-13. זה כרוך הידרוליזה חומצה (באמצעות חומצת hypochlorous) של ה-DNA שתוצאת denaturation חלבון ובכך גורם להרס של מבנה הכרומטין. לחלופין, ארגון כרומוזום בmeiocytes הנשי ותאי gametophytic ניתן לצפות באמצעות מכתים DAPI וimmunostaining על סעיפי חצי דקים או שקי עובר גזורים וMMC (למשל לראות 14-18). עם זאת, ברור נתיחה וחתך במדריך יכולים להיות עבודה אינטנסיבית ופוגע בניתוח האיכותי וכמותי של מספר גדול של אפיטופים הכרומטין.
כאן אנו מספקים פרוטוקול יעיל להכין מספר גדול של ביציות ארבידופסיס מתאימות למגוון של מכתים ציטולוגית במורד הזרם בכל ההר. בקיצור, ניצני פרחים מודגרת בפתרון מקבע, שורות של ביציות הם גזורים מcarpel והמשובצת בacrylamide בשקופית כפי שנעשו לmeiocytes האבקה 19,20. הביציות מוטבעות נמחקות נוספת וקבוע במתנול, אתנול, וקסילן לפני דופן תא עיכול וpermeabilization. וריאציות אפשריות של צעדים אלה הם דנו. הדגימות לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מכתים DNA, immunostaining, ודגים. מצב ההכנה הוא יעיל ומאפשר לניסוי הגדרה מקבילה (אפשר להכין עד 16 שקופיות ביום לניתוח במורד הזרם שונה). הטיפולים שתוארו יאפשר אותות הומוגנית בכל ההר והשתמרו היסטולוגית, סלולארי טוב,וארגון גרעיני בתאי רבייה ותאים המקיפים nucellar אשר נהנים השוואות איכותיות וכמותית בין סוגי תאים. מכויל, הדמיה ברזולוציה גבוהה המבוססת על CLSM ואחריו שחזור 3 ממדים מאפשרת מדידת כמותית משמעותית של אותות ניאון. אנחנו השתמשנו בהצלחה בהליך זה כדי לנתח את דינמיקת הכרומטין בMMC ההבחנה 21 ופיתוח נשי gametophyte 22; אנו מציגים כאן תוצאות נציג של ניתוח heterochromatin, immunostaining הכרומטין, immunostaining GFP ודגים בביציות כל הר. בנוסף, אנו מאמינים כי הפרוטוקול שלנו יהיה מתאים לרקמות צמח אחרות ומינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליך מתואר בזרימת העבודה באיור 1, וההתקנה לנתיחה והטבעה של רקמות מוצגות באיור 2.
1. קיבוע רקמות
- לאסוף 20-30 carpels בצינור microfuge המכיל חיץ מקבע BVO טרי על קרח.
- תקן את דקות הרקמות 30 עם עדין רועד בטמפרטורת חדר.
- ספין הצינורות המכילים carpels במקבע בדקות microcentrifuge המעבדתיים 1 ב400 x גרם.
- להסיר בזהירות את החיץ מקבע ולהוסיף 1 מיליליטר של PBT, למקם את הצינורות על קרח.
2. Dissection והטבעה
- הכן חמישה צינורות Eppendorf עם כל 200 μl של טרי, תערובת acrylamide 5%.
- הכן חמש שקופיות Superfrost מראש לנקות עם 70% אתנול ושכותרתו עם עיפרון.
- הפשירו aliquot אחד APS 20% ותנומות 20% כל אחת, על קרח.
- קח 4-5 carpels עם קצה חיתוך קצה, מקוםשלהם בשקופית נקייה, להסיר את עודפי נוזלים.
- לבצע חתכים אורך עם מחט דקה ולנתק את קירות carpel לשחרר שורות של ביציות כאיור מוצג 2, להימנע מייבוש על ידי כיסוי עם PBS (לא יותר מ 10 μl).
- מהירות להוסיף ולערבב 12 תנומות μl, 12 APS μl עם aliquot של 200 תמהיל acrylamide μl.
- הוסף 30 μl של acrylamide מופעל על הביציות גזורים.
- כסה עם coverslip מ"מ 20 x 20, בואו פלמר בטמפרטורת חדר, 45-60 דקות.
- הסר את coverslip באמצעות סכין גילוח. בשלב זה, יכולה להישמר דגימות לילה ב 4 ° C בצנצנת Coplin המכילה PBS.
3. עיבוד רקמות
הערה: כל הצעדים מלבד 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 ו 3.4.3 מתבצעים בצנצנות Coplin עם 80 מיליליטר פתרון מתחת למכסת המנוע הכימי בטמפרטורת חדר. שקופיות מועברות עם מלקחיים שטוח קצה.
- הבהרה ורקמותקיבעון:
- דגירה 5 דקות במתנול.
- דגירה 5 דקות באתנול.
- דגירה 30 דקות באתנול: קסילן (1:1).
- דגירה 5 דקות באתנול.
- דגירה 5 דקות במתנול.
- דגירה 15 דקות במתנול וPBT (1:1), השלימה עם פורמלדהיד 2.5%.
- יש לשטוף 2 x 10 דקות בPBT. בשלב זה, יכולה להישמר שקופיות לילה בשעה 4 ° C.
- דופן תא עיכול:
- הפשירו aliquot של תמהיל עיכול דופן תא על קרח.
- קח את שקופית מצנצנת Coplin, לנקז את עודף הנוזלים על ידי הצבתו בצורה אנכית על מגבת נייר.
- הוספה של תערובת עיכול דופן תא 100 μl מעל משטח acrylamide ולכסות עם coverslip מ"מ 23 x 46. חזור לשקופיות האחרות. דגירה עבור שעה 2 על 37 מעלות צלזיוס בתא לח (שמתוארת בחומרים).
- שטוף את דקות 2 x 5 שקופיות בPBT.
- RNase טיפול:
- קח את שקופית מצנצנת Coplin, ניקוז העודף דואר של נוזל כמו קודם.
- דגירה כל שקופית עם של RNAseA 100 μl ב100 מיקרוגרם / מיליליטר PBS עם Tween-20 1% עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח.
- שטוף את השקופיות עבור 2 x 5 דקות בPBT.
- לאחר קיבוע וpermeabilization:
- פוסט לתקן עבור 20 דקות בטריות PBT-F.
- שטוף את השקופיות עבור 10 דקות בPBT.
- Permeabilize עבור שעה 2 ב-PBS עם Tween-20 2% ב 4 ° C.
- שטוף את השקופיות עבור 2 x 5 דקות בPBT.
4. Immunostaining
הערה: לצעד זה, הריכוז האופטימלי של הנוגדן הראשוני יש להיבדק על ידי שימוש בדילולים שונים (1:200, 1:500, 1:1000) של הנוגדנים.
- דגירה כל שקופית עם של נוגדן ראשוני 100 μl המדולל PBS עם 20-Tween 0.2% לשעה 12-24 ב 4 ° C.
- שטוף את השקופיות בPBT במשך 2-4 שעות בטמפרטורת חדר בטלטול עדין.
- החל1:200 נוגדן המשני ב-PBS + 0.2% Tween-20 ל24 שעות ב 4 ° C.
- לשטוף שקופיות PBT במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר מתחת לטלטול עדין.
- Counterstain עם יודיד 10 מיקרוגרם / מיליליטר propidium ב-PBS במשך 15 דקות, ואז לשטוף 15 דקות ב-PBS בטלטול עדין, בטמפרטורת חדר.
- ההר בmountant נוזל אנטי דהייה בתוספת 10 מיקרוגרם / מיליליטר propidium יודיד. בואו ההרכבה בינונית להקשיח עבור שעה 1 לפני רכישת תמונות על ידי CLSM.
5. הדמיה כמותי
- רכישת תמונה:
- לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהות באמצעות CLSM, באופן אידיאלי באמצעות מצב סריקת תהודה, המאפשר שימור טוב יותר של אותות ניאון מעל ההדמיה ממושכת 23, ועדשת 63x טבילת גליצרול.
- בדוק את הפרמטרים הרכישה כגון עוצמת לייזר, רווח, חריר, גודל voxel וגורם הזום בתחילת הניסוי להגדיר הליך רכישה סטנדרטי להקפיד לעקוב לאורךכל השקופיות למדידות כמותיות עקביות.
- ודא העדר הדיבור צולב בין fluorochromes. אם קיימים, להגדיר סריקה רציפה. לרכוש תמונות שידור בנפרד ולא בו זמנית.
- לבצע רכישת סדרתי, תלת ממדי תמונה עם הרזולוציה הגבוהה ביותר אפשרית ובממדי x y ועם דגימת יתר 2x בממד z (שלטונו של נייקוויסט).
- עיבוד תמונה:
- לשחזר תמונות סידוריים בשלושת ממדים באמצעות תוכנת קוד מסחרית או פתוחה.
- הגדרת משטחי גובה סביב כל גרעין (או סלולרי) של עניין ב-3D.
- לכמת הקרינה בכל ערוץ כסכום של עוצמות פיקסל בכל אובייקט.
- לייצא את הנתונים ל-Excel עבור ניתוחים סטטיסטיים. לנרמל את אותות נוגדנים נגד אותות מכתים למשל ה-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מספקים פרוטוקול חזק להכנה בקנה מידה גדולה ועיבוד של ביציות ארבידופסיס מתאימות לצביעת ציטולוגית בכל ההר. הודות להטבעה, הביציות לשמר מבנה 3 ממדים (איור 3). יתר על כן, עיבוד הרקמות כולל הבהרה אופטית מאפשר מבני subcellular הדמיה ברזולוציה גבוהה. איור 4 מראה כתמי DNA בprimordia הביצית כל הר שבו heterochromatin מופיע בהיר כמו, שהוגדרו מוקדים בולטים היטב (לא deconvolution שימשה לתמונה הזאת). תמונות אלה שימשו לניתוח תוכן heterochromatin בMMC וnucellus (איור 4) 21.
בנוסף, השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה כדי לנתח כמותית דינמיקת הכרומטין ידי immunostaining בתאי אם megaspore, megaspore הפונקציונלי, gametophytes הנשי פיתוח ועובר המוקדם 21, 22-24. באיור 5 ארבידופסיס. איור 5A מראה דוגמא של immunodetection בprimordia הביצית, כוללים התא האם megaspore, סימן מתירנית הקשורים euchromatin (H3K4me3) וסימן הדיכוי הקשורים heterochromatin (H3K27me1). איור 5 מראה דוגמא של immunodetection GFP בביצית בשלה, ובכלל זה את שק העובר (במקרה זה, הפרוטוקול היה שונה מעט לשימוש בנוגדן מאיץ ה-GFP (ראה דיון). אנחנו גם זוהו חלבוני הכרומטין יליד כגון H3 ו-H1 21 מראה כי ההליך משמר אפיטופים חלבון הכרומטין. ההליך מאפשר גם quantifications שחזור המאפשר השוואה בין סוגי תאים (לעומת רבייה גופנית למשל, תאים המקיפים) 21.
לבסוף, אנחנו גם מיושמים בהצלחה בהליך זה כדי לבצע FISH מנתח בעמ 'ביצית כל ההרrimordia. למשל מוצג איור 6 מראים אותות דגים באמצעות בדיקה נגד 45s rDNA חוזר על הגדרת האזורים המארגנים nucleolar 25. הבדיקה ה-DNA שכותרתו ישירות עם Alexa 488 באמצעות FISH-Tag 26, הכלאה נעשתה בעצם כמתואר 27 עם שינויים קלים, ואילו counterstaining DNA נעשה כמתואר בפרוטוקול שלנו.
איור 1. זרימת עבודה של immunostaining, מכתים DNA וקרינת הכלאה באתר בביציות ארבידופסיס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. התקנה לנתיחה והטבעה של carpels בשקופית. קיר carpel מוסר וcarpel היא גזור בשקופית לשחרר שורות של ביציות (ראה מקרוב של ביציות גזורים בשלב 3), ולאחר מכן carpel גזור מוטבעת בתמהיל acrylamide מופעל, מכוסה על ידי 20 x 20 coverslip מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הפרוטוקול מאפשר שמירה על מבנה 3 ממדים, ובמקביל לאפשר בהירות אופטית ומכתימים הומוגנית. תמונות מציג תצוגת סעיף פיצול של תמונת 3D בXY, ציר XZ YZ וכפי שצוין. נתוני התמונה כבר נרכשו על ידימיקרוסקופ לייזר confocal סריקה ושחזר ב 3 ממדים באמצעות תוכנת Imaris. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. Whole-Mount מכתים-DNA על ידי יודיד propidium בprimodia הביצית מאפשר כימות heterochromatin מדויקת. התמונה משמאל מציגה מכתים כל ההר DNA לאורך primordia ביצית. גרעין MMC מסומן על ידי קווי המתאר לבנים וגרעין nucellar באדום. תחזיות של גרעינים שחזרו-3D מוצגות בצד הימין. הבהירות של הרקמה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מוקדי heterochromatin מסומנים על ידי קווי המתאר וכימות צהובים של אותות הניאון בו. הגרפים מראים את heterochr היחסיomatin שבריר 21. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. נציג תוצאות של immunostaining כל ההר בביציות ארבידופסיס. א) Immunostaining של שינויי הכרומטין בprimordia ביצית הצעיר איתור euchromatin (H3K4me3) וheterochromatin (H3K27me1). אות הנוגדן היא ירוקה, את ה-DNA counterstained ידי יודיד propidium באדום. כיסוי של אותות ניאון מוצג יחד עם תמונה בהעברת אור באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (אפור). MMCs מסומן על ידי קווי המתאר לבנים. תקריב של גרעין MMC מוצג כהבלעה בפנל העליון. התמונות הן confocal אחת סעיף. ב ') immunodetection של ה-GFP בביצית בשלה.GFP היה immunostained באמצעות נוגדן ה-GFP-מאיץ והביצית הייתה counterstained עם DAPI. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. כל הר הקרינה הכלאה באתר בביציות ארבידופסיס. Primordium הביצית היה הכלאה עם בדיקה DNA ספציפית ללוקוסים חוזרים 45s rDNA ומסומן עם Alexa 488 באמצעות טכנולוגית FISH-Tag, וcounterstained עם DAPI 26. הכיסוי של 45s rDNA עם DAPI ותמונה שנרכשה בערוץ שידור האור (האפור) מוצג גם. תקריב של גרעין MMC מוצג כהבלעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של תאנה זויור.
איור 7. השפעה של הקיבעון, העיכול וההליך מכתים על אותות ה-DNA בביציות כל ההר. ביציות) למבוגרים היו קבועות 30 דקות או עם paraformaldehyde 4% או מקבע BVO ומעובד 30 דקות או שעה 1 עם דופן תא לעכל תערובת אנזים לפני צביעת DNA עם יודיד propidium. לאפיית נתון, דגירה ארוכה יותר משפיעה יותר לרעה על הביציות מכתים DNA שתוקנו עם paraformaldehyde מאשר עם BVO. B) מכתים כל הר ה-DNA באמצעות מגיב Feulgen הבא חומצת הידרוליזה נדרשה 28 או באמצעות יודיד propidium בעקבות אי פרוטוקול denaturing מתואר בטקסט. הפנל העליון מראה סעיף מטוס יחיד באמצעות שק העובר, הפנל התחתון מציג הגדלה מעל לגרעין התא המרכזי מראה בבירור שינוי שלארגון הכרומטין בביציות צבעוניות Feulgen. CCN, גרעין תא מרכזי, ECN, גרעין תא ביצה, syn, גרעין synergid. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בצמחים פורחים, שושלת הרבייה הנשית מוקפת בכמה שכבות תאים הכוללים nucellus וteguments הביצית, ובכך הופכת את צביעת ציטולוגית בכל הר מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול יעיל המאפשר העריכה ולעיבוד של מספר רב של ביציות מתאימות לצביעת ציטולוגית כגון immunostaining, מכתים DNA וקרינת הכלאה באתר בכל ההר. אנחנו השתמשנו בו בהצלחה לניתוח של תאי מין רבייה הנשיים בארבידופסיס 21,22. שיטה זו היא יעילה ביותר כפי שניתן להתייחס אליהם כמה שקופיות במקביל לצביעה שונה. הוא גם חזק ונותן חלוקת אות הומוגנית ומאפשר ניתוחים כמותיים לשחזור. בניגוד לשיטה קלאסית כגון צביעת Feulgen הכוללת denaturation של מבנה הכרומטין, הפרוטוקול שלנו שומר על ארגון הכרומטין ואפיטופים גרעיניים. בתוספתition, הבהרת רקמות מאפשרת הדמיה האותות ברזולוציה גבוהה ברמת התא הבודד.
פרוטוקול זה יכול להיות מזורז על ידי השמטת השלבים המתוארים ב3.1 אם הפרחים כבר קבוע ב4 paraformaldehyde% (בTween% + 1 PBS) במקום חיץ BVO (1.1). בעוד הליך קצר יותר זה הוכיח פונקציונלי לכמה immunostaining 22-24, מצאנו כי זה פוחתת על חוסנו של הכתמים על פני דגימות, נוגדנים ותצוו של תערובת אנזים עיכול דופן תא (ראה להלן). כמו כן לא היינו מוצלחים עבור הכלאה דגים עם הליך קצר זה. לimmunodetection של ה-GFP של שימוש במולקולות המאיץ כ5B איור מוצג, פרוטוקול דומה כפי שתואר כאן היה בשימוש עם שינויים קלים בשלב 1 ו -3: carpels היו קבוע בפורמלדהיד 2.5% 45 דקות (1.1), הצעד הראשון של עיבוד רקמות (30 דקות קוצר לטיפול 5-10 מתנול דקות (3.1), צעד חסימה הוצג בשנת 2% BSA ב-PBS) לפני נוגדני יישום הלילה כפי שתואר. אין נוגדנים משני יש צורך במאיץ.
אנו דנים להלן כמה שלבים קריטיים:
קיבוע רקמות, לנתיחה והטבעה.
אותות Immunostaining ומכתים DNA היו באופן עקבי חזקים יותר וhomogenously מופצים כאשר הרקמה שנדגמו מצמחים פחות מ -5 שבועות (לאחר העברה של השתיל באדמה). אולי, בתנאי הגידול שלנו, תקופה ממושכת של טיפוח עשויה להיות מלווה בשינויים בהרכב הביוכימי של תא הקיר, המשפיעים בתורו את היעילות של עיבוד רקמות. לכן אנו ממליצים רקמת דגימה מצמחים צעירים יחסית. בנוסף, הרקמה יש למנוע מהתייבשות במהלך הנתיחה (מובילה אחר לשינוי והיעדר אותות צביעה היסטולוגית) ואילו עודף של PBS מאתגר את המניפולציה; ייבוש עדין של העודף של סולution עם הקצה סביב הרקמה שהופקדה על שקופית וכך מומלץ. יתר על כן, יש להימנע בועות בתערובת acrylamide ותוך כדי כיסוי עם coverslip. לבסוף, מגלשות Superfrost פלוס מומלצות בחום להידבקות נאותה acrylamide (עופרת באיכות סטנדרטית לרפידות שברירית ולא יציבים בידינו), כפי שהם מופיעים מעולים לאחרים לרקמות והידבקות acrylamide.
קיבעון, permeabilisation וקיר תא עיכול.
דופן תא עיכול הוא שלב קריטי של עיבוד רקמות. הוא חשב כי צעד זה מאפשר חדירה טובה של חומרים כימיים מכתים homogenously לאורך רקמות הצמח. אנחנו חווינו השתנות בהומוגניות מכתים (החל אין אות, אות רק בחלק מהרקמות, ל100% מכתים רקמה) תלוי בזמן העיכול והפעילות האנזימטית (אצווה ספציפי, שתואר על ידי הספק). מומלץ לייצר כמות גדולה של פתרון מניותשל תערובת האנזים (למשל 100 מיליליטר) ולשמור 1 aliquots מיליליטר ב -20 ° C. כל פתרון מניות צריך קודם להיבדק על 1-2 שקופיות לפני השימוש בקנה מידה גדולה. יתר על כן, אנו חווים שהסוג של מקבע משפיע על היעילות של מכתים DNA בשילוב עם זמן עיבוד שונה לקיר תא לעכל: ביציות קבועות paraformaldehyde 4% הושפעו לרעה מדגירה ממושכת עם תמהיל עיכול דופן תא, ואילו רקמות קבועות עם פתרון BVO היו סובלני לפעמי עיכול ארוכות יותר ואיפשר לצביעה טובה יותר ה-DNA (איור 7 א). בנוסף, טיפול RNAse (DNase חינם) הוא הכרחי אם רקמת counterstained עם יודיד propidium כפי שהוא גם נקשר למולקולות RNA. אנו ממליצים על שימוש ב4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) עקב הספקטרום הרחב שלה ניאון פליטה חופף עם fluorophores אחר, אלא גם לסטיות אכרומטית המחייבים תיקוני שינוי ערוץ שלאחר רכישה. אנחנו גםממליץ על צביעת Feulgen אשר דורשת חומצת הידרוליזה במהלך עיבוד רקמות 28 מובילים לdenaturation הכרומטין במיוחד בצק העובר (איור 7). עשויים לשמש גם צבעי DNA אלטרנטיביים 29, אבל היעילות שלהם לא נבדקה כאן.
Immunostaining.
לimmunostaining של שינויי הכרומטין, אנו ממליצים לוודא את הספציפיות של הנוגדן הראשוני במסד הנתונים בקוד הפתוח http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, כמו כמה נוגדנים זמינים מסחרי הראו תגובות צולבות ל שינויים אחרים. לכימות במורד הזרם מנתח, חשוב לכייל את ריכוז נוגדנים ודגירת הזמן למדוד אותות בקשר לינארי עם אפיטופ. אנו ממליצים לכייל את זמן דילול נוגדנים וזיהוי באמצעות דיל נוגדןסדרת ution של 1:200, 1:500, 1:1,000 ו12-24 דגירה שעות, בהתאמה, כדי לזהות את תנאי מתן אותות חזקים והומוגנית. הדילול הגבוה ביותר וזמן דגירה הקצר ביותר המאפשר אמורים לשמש אותות לשעתק על ניתוחים כמותיים. פקדים ללא נוגדן ראשוני יש לבצע כדי לבדוק את הספציפיות. אם immunostaining מייצר כתמים נוקבים, מומלץ לחסום עם 5% BSA + Tween 0.1% ב-PBS במשך שעה 2 על 4 מעלות צלזיוס לפני יישום הנוגדן הראשוני. ניתן לבדוק אותות נוגדנים בשקופית לפני counterstaining DNA כדי לוודא את הצלחת הניסוי. בידיים שלנו, שטיפה בPBT במשך 2-4 שעות לאחר דגירה עם הנוגדן הראשוני, ושעה 1 לאחר הנוגדנים משני מאפשרת לאותות רקע נמוכים גם ללא חסימה.
לבסוף, פרוטוקול זה גם עשוי החלים על רקמות אחרות צמח (לדוגמא שורש, שבר עלה, meristem הפרחוני) וכנראה למינים צמחים אחרים, פרוviding קצת הסתגלות על הנתיחה, דופן תא לעכל וpermeabilization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al.
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., et al. Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
