Summary
我们在这里提供了一个高效，可靠的协议进行免疫染色，荧光原位杂交，DNA染色后在整个安装拟南芥胚珠定量，高分辨率成像。该方法已成功地用于分析染色质修饰和核架构。
Abstract
在开花植物的体细胞到生殖细胞命运转变是在成人的植物花器官标志着孢子母细胞的规范（校董会）。女性SMC（大孢子母细胞，MMC）区分在胚珠原基和经历减数分裂。所选择的单倍体孢子然后经历有丝分裂，以形成多细胞雌配子体，这将产生配子，卵细胞和中央细胞，连同附件细胞。在MMC，meiocyte和雌配子体的胚珠内的有限的辅助功能是进行细胞学技术挑战性和细胞遗传学分析在单细胞水平上。具体地讲，蜂窝式或核抗原表位直接或间接的免疫检测是由植物细胞和单细胞成像内的试剂的渗透差的障是由缺乏在整个安装组织的光学透明性的批租。
因此，我们开发了分析原子核的有效方法耳组织和染色质修饰在整个安装嵌入式拟南芥胚珠高分辨率单细胞。它是基于解剖和固定胚珠嵌入在丙烯酰胺凝胶上的显微镜载玻片的薄层。嵌入式胚珠受到旨在提高组织的清晰度和通透的免疫染色试剂化学和酶处理。这些治疗维持细胞和染色质组织，DNA和蛋白质的表位。样本可以用于不同的下游细胞学分析，包括染色质免疫染色，荧光原位杂交（FISH），和DNA染色为异分析。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像，分辨率高，其次是三维重建允许在单细胞分辨率的定量测量。
Introduction
在开花植物，建立生殖谱系始于平滑肌细胞的分化，MMC女性和男性孢子母细胞。在MMC来自于胚珠原基的远端子珠心表皮细胞发育和小孢子母细胞从造孢组织发展中的花药药室，分别位于花器官1深处。校董会经过减数分裂，产生单倍体的孢子，然后产生在有丝分裂的配子体。雌配子体，或胚囊，由一个卵细胞，一个中央单元，两个助和三个antipodals的。雄配子体，或花粉，由一个营养细胞和两个精子细胞。而雄配子体仍然是一个相对平易近人对象 - 的研究中，雌配子体嵌入在胚珠内，自己包围在花心皮，从而造成分子和细胞学分析具体的挑战。然而，最近，激光辅助显微切割提供了一个优雅的解决方案，允许在MMC和雌性配子体细胞2-4转录组分析。除了 候选基因表达分析， 例如使用RNA 原位杂交或报告基因检测，细胞学分析允许调查使用特定的直接细胞染色或间接免疫源性细胞成分的动态。特别是在使用FISH和DNA染色，与染色质修饰或染色质免疫成分一起细胞遗传学染色是核心的方法来阐明染色质动力学和核组织在拟南芥 5。通常情况下，减数分裂嗣继承已被很好地研究植物雄性meiocytes 6,7特定的染色体动态;进一步规模化，细胞特异性染色质重组，可能反映动态的表观遗传修饰已经花粉发育过程中8-10被描述。相比之下，由于到阴meiocyte和配子体的相对不便，这些调查保持在技术上难以适用，并且经常需要切片或手工剥离和酶消化（见下文）。此外，普遍缺乏在整个贴装光学清晰度是一个障碍生殖细胞中完整的胚珠高分辨率成像。
在整个安装胚珠一个经典的方法，染色体组织细胞学分析使用富尔根氏染色11-13。它涉及其导致蛋白质变性，从而使破坏的染色质结构的DNA的酸水解（使用次氯酸）。另外，在女性meiocytes和配子体细胞染色体的组织可以利用DAPI染色和免疫染色的半薄切片或解剖胚囊和MMC（例如见14-18）进行观察。但是很显然，人工剥离和切片可以是劳动密集和阻碍对大量染色质抗原表位的定性和定量分析。
在这里，我们提供了一个有效的协议准备了大量适合各种在整个贴装下游细胞学染色拟南芥胚珠。简言之，花芽孵育在固定剂溶液中，行胚珠从心皮解剖并嵌入在丙烯酰胺上滑动为已完成对花粉meiocytes 19,20。嵌入式胚珠进一步清除并固定在甲醇，乙醇，和细胞壁消化和透之前二甲苯。这些步骤可能的变化进行了探讨。样品随后可以用于DNA染色，免疫染色，以及鱼。编写模式是有效的，并允许并行实验装置（最多16个幻灯片可以在一天内进行制备为不同的下游分析）。所描述的治疗方法使信号均匀在全安装和保存完好的组织，细胞，和在生殖细胞和周围的珠心细胞，这些细胞有利于细胞类型之间的定性和定量的比较核的组织。校准，激光共聚焦显微镜为基础的高分辨率成像后的3维重建使荧光信号有意义的定量测量。我们成功地使用这个程序来分析染色质动态的区分MMC 21和发展中国家雌配子体22;我们在座的异染色质的分析，染色质免疫染色，免疫组化绿色荧光蛋白和FISH在整个安装胚珠的代表性结果。我们还认为，我们的协议将适用于其他植物组织和物种。
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Protocol
该过程在图1中的工作流描述，并设置为夹层和组织的嵌入在图2中给出。
1，组织固定
- 收集20-30心皮中含有冰新鲜的BVO固定缓冲液离心管。
- 修复组织30分钟轻微振荡在室温下。
- 旋转含有固定剂的心皮中台式微量离心机1分钟，在400×g下的管中。
- 小心地取出固定缓冲液和加入1 ml的PBT，把试管放在冰。
2，解剖与嵌入
- 准备5 Eppendorf管各200微升新鲜的，5％的丙烯酰胺组合。
- 制备5的Superfrost载玻片预清洗，用70％乙醇及标记用铅笔。
- 解冻20％的APS之一等份，每20％的国家行动方案，在冰上。
- 取4-5心皮与切断端尖，地点他们在一个干净的玻片，去除多余的液体。
- 使纵向切口用微细针取下心皮壁以释放列胚珠所示图2中 ，避免覆盖，用PBS（不超过10微升）的干燥。
- 快速添加和混合12微升国家行动方案，12微升的APS与200微升丙烯酰胺混合等分。
- 加入30微升的激活丙烯酰胺到解剖胚珠。
- 盖在一个20×20毫米的盖玻片，让聚合在室温下，45-60分钟。
- 用刀片去掉盖玻片。在此阶段，样品可以保持过夜，在4℃在含有PBS中的科普林氏缸。
3，组织处理
注：除3.2.1，3.2.3，3.3.2和3.4.3所有步骤都进行了科普林氏罐子，在室温下的化学罩80毫升解决方案。幻灯片被转移了一台尖镊子。
- 组织和澄清固定方式：
- 孵育5分钟，在甲醇中。
- 孵育5分钟，在乙醇中。
- 孵育于乙醇30分钟：二甲苯（1:1）。
- 孵育5分钟，在乙醇中。
- 孵育5分钟，在甲醇中。
- 孵育15分钟，在甲醇和PBT（1:1），补充有2.5％的甲醛。
- 漂洗2×10分钟的PBT。在此阶段，幻灯片可以保持过夜，在4℃下
- 细胞壁的消化：
- 在冰上解冻的细胞壁消化混合物的等分试样。
- 就拿从染色壶幻灯片，通过将它垂直于纸巾上沥干多余的液体。
- 加入100μl的细胞壁消化混合比丙烯酰胺垫，盖上一个23 x 46毫米盖玻片。重复其他幻灯片。孵育2小时，在37℃的保湿室中（在材料中所述）。
- 在PBT洗的幻灯片2×5分钟。
- RNA酶A处理：
- 就拿从染色壶幻灯片，沥干日Ë过量的液体和以前一样。
- 孵育各滑动用100μlRNA酶A在100微克/毫升PBS中含1％Tween-20的1小时，在37℃下在潮湿的腔室中。
- 2×5分钟的PBT洗的幻灯片。
- 后固定和透：
- 后固定20分钟的新鲜的PBT-F。
- 冲洗的幻灯片中的PBT 10分钟。
- 2小时的PBS中透化，用2％Tween-20中在4℃下
- 冲洗的幻灯片2×5分钟的PBT。
4，免疫染色
注意：对于这个步骤中，第一抗体的最佳浓度必须通过使用不同稀释度（1:200，1:500，1:1000）抗体进行检测。
- 孵育各滑动用100μl初级抗体在4℃下在PBS中稀释有0.2％Tween-20的12-24小时
- 在PBT为2-4小时，在下面轻轻摇动室温洗的幻灯片。
- 应用在次级抗体1:200 PBS +0.2％Tween-20的24小时，在4℃下
- 在PBT中1小时以下轻轻摇动室温洗载玻片。
- 染液用10μg/ ml的碘化丙锭的PBS中15分钟，然后冲洗在PBS中15分钟，在温和的晃动，在室温下进行。
- 山中防褪色液封固补充10微克/毫升碘化丙啶。让我们通过激光共聚焦显微镜采集图像之前的安装介质硬化1小时。
5。定量成像
- 图像采集：
- 利用激光共聚焦显微镜，最理想的是采用共振扫描模式，它可以更好地保存荧光信号在长时间成像23和63X甘油浸没透镜获得高清晰度的图像。
- 测试采集参数，如激光强度，增益，针孔，像素大小和缩放因子在实验开始定义一个标准的收购程序严格遵循整个所有幻灯片的一致定量测量。
- 验证的情况下的荧光染料之间的串扰。如果存在，建立一个顺序扫描。分开，而不是同时获得传输图像。
- 与在x和y维度尽可能高的分辨率和在z维度（Nyquist的规则）2倍过采样进行串行，三维图像获取。
- 图像处理：
- 使用商用或开源软件三维空间重建序列图像。
- 定义轮廓的表面围绕在3D感兴趣的每个细胞核（或单元）。
- 在每个信道量化荧光作为像素强度中的每个对象的总和。
- 将数据导出到Excel进行统计分析。针对正常化，例如 DNA染色信号抗体信号。
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Representative Results
我们提供了一个强大的协议大规模制备适合于在全安装细胞学染色拟南芥胚珠和处理。由于嵌入，胚珠保留的3维结构（ 图3）。此外，该组织处理，包括光学澄清，使成像的亚细胞结构的高分辨率。 图4显示了DNA染色在异染色质出现明亮，明确显眼灶（无反褶积用于此图片）整个安装胚珠原基。这些图像被用于分析在MMC和珠心（ 图4）21异的内容。
此外，我们成功地利用这个协议来定量分析染色质动力学通过免疫组化的大孢子母细胞，功能大孢子，发展女性配子和早期胚胎21，22-24。在图5中拟南芥胚珠代表性的结果。 图5A显示免疫检测在胚珠原基，包括大孢子母细胞一个常染色质相关的许可标志，（H3K4me3的）和异染色质相关的镇压标记的一个例子（H3K27me1）。 图5B示出了在成熟的胚珠，包括胚囊（在这种情况下，该协议被略加修改，使用GFP的助推器抗体（见讨论）的GFP免疫检测的例子，我们还检测到本机的染色质蛋白如H3和H1的21表明该程序保存染色质蛋白的抗原表位。该程序还允许重现的量化使细胞类型（ 如生殖与体细胞，细胞周围）21之间的比较。
最后，我们还成功地应用此程序来进行FISH分析了全贴胚珠primordia。一个例子是图6中使用针对45S rDNA的重复探针限定核仁组织区25示出FISH信号。 DNA探针，用FISH-26标签直接用Alexa 488，杂交完成基本如27稍作修改，而在我们的协议中所述的DNA复染已完成。
图1：工作流染色，DNA染色和荧光在拟南芥胚珠原位杂交。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。安装解剖和心皮滑的嵌入。心皮壁被删除，心皮被解剖的幻灯片释放行胚珠（见特写解剖胚珠在步骤3），然后解剖心皮被嵌入在激活的丙烯酰胺混合，覆盖20×20毫米盖玻片。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图3。该协议使保留的三维结构，同时允许光学清晰度和均匀染色的图像显示在xy代表所指示的XZ和YZ轴的三维图像的分割截面图。图像数据已被收购，共聚焦激光扫描显微镜和重建中使用了Imaris软件3个维度。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图4。在胚珠primodia碘化丙啶全安装DNA染色允许精确异定量。左边的图像显示在整个胚珠原基全贴DNA染色。一个MMC核心的标志是白色的轮廓和珠心细胞核为红色。的三维重构核的预测都显示在右边。该组织的清晰使标有黄色的轮廓其中的荧光信号和定量的异染色质灶的高分辨率成像。该图表显示了相对heterochromatin分数21。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5。在拟南芥胚珠整个贴装免疫染色的代表性结果。 A）免疫染色的染色质修饰在年轻的胚珠原基检测常染色质（H3K4me3的）和异染色质（H3K27me1）。抗体信号是绿色的，通过碘化丙啶红counterstained的DNA。的荧光信号的叠加显示，连同使用微分干涉对比（灰色）中的透射光的图像。金属基复合材料是由白色的轮廓显示。特写MMC的细胞核显示为插页中上游面板。该图像是单一的共焦部分B）绿色荧光蛋白的免疫检测在一个成熟的胚珠。采用GFP-助推器抗体的绿色荧光蛋白免疫染色和胚珠经DAPI染色。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6。全安装的荧光在拟南芥胚珠原位杂交的胚珠原基杂交具体到45S rDNA的重复序列位点的DNA探针，用鱼标记技术用Alexa 488，并经DAPI染色26。还示出的45S rDNA的用DAPI和在传输光信道（灰色）所获取的图像的重叠。特写MMC的细胞核显示为插图。 请点击此处查看该图的放大版本URE。
固定，消化和染色过程对整个贴装胚珠的DNA信号图7。影响A）成熟的胚珠是固定的30分钟，无论是用4％多聚甲醛或BVO固定液和处理30分钟或1小时与细胞壁消化酶混合物前DNA染色用碘化丙啶。对于一个给定的批次，再孵育上用低聚甲醛固定比BVO的DNA染色胚珠影响更负B）全安装DNA染色用富尔根试剂以下所需的酸水解28或使用碘化丙啶以下的非变性协议的文本描述。上图表示通过胚囊一个单一的平面部，该下面板呈现的倍率对中央细胞核清楚地显示改变的染色质组织在福尔根染色胚珠。 CCN，中央细胞核，ECN，卵细胞核，同步，助细胞细胞核。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在开花植物中，女性生殖谱系是由几个细胞层，包括珠心和胚珠teguments包围，从而使细胞学染色整个安装技术上的挑战。在这里，我们提出了一个高效的协议使得大量适合细胞学染色，如免疫，DNA染色和荧光在整个贴装原位杂交胚珠的准备和处理。我们成功地使用它在拟南芥 21,22女性生殖生殖系的分析。该方法是高效的多张幻灯片可以并行进行不同的染色处理。它也是鲁棒并给出均匀的信号分布，并允许可再现的定量分析。与此相反，以经典的方法，如福尔根染色，涉及染色质结构的变性，我们的协议保留染色质组织和核抗原表位。加载中银行足球比赛，组织澄清，使高分辨率成像的信号在单细胞水平。
这个协议可以通过省略在3.1中描述的步骤加快，如果花儿也被固定在4％多聚甲醛代替BVO缓冲液（1.1）（在PBS +1％吐温）。而这更短的程序证明功能性的一些免疫染色22-24，我们发现它衰减了染色的样本之间，抗体和批次的细胞壁消化酶混合物的鲁棒性（见下文）。此外，我们没有成功的这短短的过程FISH杂交。对于GFP的使用升压分子。 如图5B所示 ，一个类似的协议如这里所描述，用在步骤1和3稍作修改使用的免疫检测：心皮被固定在2.5％甲醛45分钟（1.1），组织处理的第一步骤在2％缩短到5-10分钟甲醇处理（3.1），封闭步骤介绍（30分BSA在PBS）所述对抗体的应用程序之前过夜。无二次抗体是必要的助推器。
下面我们讨论了一些关键步骤：
组织固定，剥离和嵌入。
免疫组化和DNA荧光染色信号是持续更健壮，均匀分布时，组织被从植物中小于5周龄（以下土壤中转移的苗子）采样。可能的话，在我们的培养条件，培养长时间可能伴随改变细胞壁的生化成分，反过来影响组织处理的效率。因此，我们建议由相对年轻的植物采样组织。此外，该组织应该从解剖在干燥过程中可以防止（否则导致组织学改变和缺乏染色的信号），而过量的PBS中的挑战的操控;多余的溶胶的温柔排水因此ution周围沉积在幻灯片组织尖端建议。另外，气泡中应避免的丙烯酰胺混合物和，同时用盖玻片覆盖。最后，Superfrost Plus或幻灯片强烈建议在适当的丙烯酰胺的附着力（标准质量导致在我们手中脆弱和不稳定垫），因为他们似乎比别人优越的组织和丙烯酰胺的附着力。
固定，通透和细胞壁消化。
细胞壁消化组织处理的一个关键步骤。据认为，这个步骤有利于染色试剂均匀地在整个植物组织的良好穿透。我们经历变性染色均匀性（从没有信号，信号中的组织的一部分，以100％的组织染色）取决于消化时间和酶的酶活性（特定批次，由提供所述）。这是推荐产生大量原液酶混合物（ 例如 100毫升）中，并保持1ml等份在-20℃下每个原液首先应在1-2幻灯片使用在大规模测试过了。此外，我们经历了固定液的类型会影响DNA染色的不同处理时间细胞壁结合的效率消化：胚珠固定在4％多聚甲醛受到负面长时间培养与细胞壁消化组合所影响，而组织固定的BVO溶液分别耐受更长的消化时间，并允许更好的DNA染色（ 图7A）。此外，RNA酶（DNA酶）治疗是绝对必要的，如果组织被counterstained用碘化丙啶，因为它也结合到RNA分子。建议您不要使用4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI）由于与其他荧光重叠其广泛的荧光发射光谱也使得需要渠道转变改正收购后的消色差畸变。我们还建议对富尔根染色，需要组织处理28导致染色质变性尤其在胚囊（ 图7B）中的酸水解。替代的DNA染料也可使用29，但它们的效率尚未这里测试。
免疫组织化学染色。
对于染色质修饰免疫染色，我们建议以验证主要抗体的特异性在开源数据库http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30，一些市售抗体呈交叉反应的其他修改。下游定量分析，其校准的抗体浓度和孵育时间来测量与抗原表位的线性关系的信号是很重要的。我们建议使用抗体稀校准抗体稀释和检测时间ution系列1:200，1:500，1:1000和从12-24小时温育后，分别以确定给健壮且均匀的信号的条件。的最高稀释度和最短的孵育时间允许重现的信号应被用于定量分析。对照无第一抗体应进行测试的特异性。如果免疫产生的非特异性染色，它表示用在PBS中5％BSA +0.1％吐温2小时，在4℃下施加第一抗体之前阻止。抗体的信号可以在幻灯片上进行检查之前的DNA复染，以验证实验的成功。在我们手中，洗涤在PBT为2-4小时培养与第一抗体后，二次抗体1小时后允许低背景信号，即使没有阻塞。
最后，该协议也可能适用于其他植物组织（ 如根，叶片段，花分生组织），可能对其他植物物种，亲viding一些调整上的夹层，细胞壁消化和通透。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
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