Summary
Vi gir her en effektiv og pålitelig protokoll for farging, fluorescens in situ hybridisering, DNA farging fulgt av kvantitativ, bildebehandling med høy oppløsning i hel-mount Arabidopsis thaliana ovules. Denne metoden ble brukt for å analysere kromatin modifikasjoner og atom arkitektur.
Abstract
I blomsterplanter, er det somatiske-til-reproduktiv celle skjebne overgang preget av spesifikasjonen av spore mor celler (SMCS) i floral organer i voksen plante. Den kvinnelige SMC (megaspore mor celle, MMC) skiller i ovule primordium og gjennomgår meiose. Den valgte haploid megaspore deretter gjennomgår mitose å danne flercellet kvinnelige gametofytt, noe som vil gi opphav til kjønnscellene, eggcellen og sentral celle, sammen med tilbehør celler. Den begrensede tilgjengeligheten av MMC, meiocyte og kvinnelige gametofytt inne ovule er teknisk utfordrende for cytologisk og cytogenetiske analyser på celle-nivå. Spesielt er direkte eller indirekte immuno-deteksjons av cellulære eller atom epitoper svekket av dårlig penetrering av reagensene inne i plantecellen, og enkeltcelle-avbildning er demised av mangelen på optisk klarhet i hel-typen vev.
Således, har vi utviklet en effektiv metode for å analysere Nucløret organisasjon og kromatin modifisering i høy oppløsning på én celle i hel-mount innebygde Arabidopsis ovules. Den er basert på disseksjon og innstøping av faste ovuler i et tynt lag av akrylamid gel på et mikroskopisk lysbilde. De innebygde ovules er utsatt for kjemiske og enzymatiske behandlinger som tar sikte på å bedre vev klarhet og permeabilitet til farging reagenser. Disse behandlingene bevare cellulære og kromatin organisasjon, DNA og protein epitoper. Prøvene kan brukes for forskjellige nedstrøms cytologiske analyser, inkludert kromatin farging, fluorescens in situ hybridisering (FISH), og DNA-farging for heterochromatin analyse. Konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) bildebehandling, med høy oppløsning, etterfulgt av 3D rekonstruksjon åpner for kvantitative målinger ved encellede oppløsning.
Introduction
I blomstrende planter, begynner etablering av reproduktive linjene med differensiering av SMCS, kvinnelig MMC og mannlige microspore mor celle. MMC utvikler seg fra en sub-epidermal nucellar celle ved den distale enden av ovule primordium, og microspore mor celle utvikler seg fra sporogenous vev i anther locule, som ligger dypt inne i blomster organer en. SMCS gjennomgå meiose for å produsere haploide sporer, som deretter gir opphav til de gametophytes ved mitose. Den kvinnelige gametofytt, eller embryo sac, består av ett egg celle, en sentral celle, to synergids og tre antipodals. Den mannlige gametofytt eller pollen, er sammensatt av en vegetativ celle og to sædceller. Mens den mannlige gametofytt fortsatt en relativt tilgjengelig objekt-of-studien, er den kvinnelige gametofytt innebygd i ovule, selv vedlagt i blomster carpel, og dermed stiller konkrete utfordringer til molekylære og cytologiske analyser. Nylig har imidlertid laserassistertmicrodissection tilbudt en elegant løsning slik transcriptomic analyser i MMC og kvinnelige gametophytic celler 2-4. I tillegg til kandidat genekspresjon analyser, for eksempel ved bruk RNA in situ hybridisering eller reporter gen analyser, cytologiske analyser lar undersøke dynamikken i endogene cellulære komponenter ved hjelp av spesifikke direkte cellefarging eller indirekte farging. Spesielt, cytogenetisk flekker ved hjelp av FISH og DNA farging, sammen med farging av kromatin endringer eller kromatin komponenter er sentrale innfallsvinkler for å belyse kromatin dynamikk og atom organisasjon i Arabidopsis fem. Vanligvis medfører meiose spesifikke kromosom dynamikk som har blitt godt undersøkt i anlegget mannlig meiocytes 6,7; videre i stor skala, celle-spesifikke kromatin omorganisering, som sannsynligvis gjenspeiler dynamisk epigenetisk reprogrammering har blitt beskrevet under pollen utvikling 8-10. I motsetning til dette, på grunnav den relative utilgjengelighet av den kvinnelige meiocyte og gametofytt, disse undersøkelsene forblir teknisk vanskelig å påføre, og krever ofte snitte eller manuell disseksjon og enzymatisk fordøyelse (se nedenfor). I tillegg er det utbredt mangel på optisk klarhet i hel-mount et hinder for høyoppløselig avbildning av kjønnsceller i intakte ovules.
En klassisk metode for cytologisk analyse av kromosom organisasjon i hel-mount ovules bruker Feulgen er flekker 11-13. Det omfatter syrehydrolyse (ved bruk av hypoklorsyre) av DNA som resulterer i protein denaturering og dermed fører til ødeleggelse av kromatin struktur. Alternativt kan observeres kromosom organisasjon i kvinnelige meiocytes og gametophytic celler ved hjelp DAPI farging og farging på semi-tynne snitt eller dissekert embryo sekker og MMC (for eksempel se 14-18). Det er imidlertid klart, manuell disseksjon og seksjonering kan være arbeidskrevende oghindrer på kvalitativ og kvantitativ analyse av et stort antall kromatin epitoper.
Her gir vi en effektiv protokoll for å forberede et stort antall Arabidopsis ovules egnet for en rekke nedstrøms cytologisk flekker i hel-mount. I korte trekk, er blomsterknopper inkuberes i en fiksativ løsning, er rader med ovules dissekert fra carpel og innebygd i akrylamid på lysbildet som gjøres for pollen meiocytes 19,20. De innebygde ovuler er ytterligere fjernet og fiksert i metanol, etanol, og xylen før cellevegg fordøyelse og permeabilization. Mulige variasjoner av denne fremgangsmåten er omtalt. Prøvene kan deretter bli brukt for DNA beising, farging, og fisk. Preparatet modus er effektiv og gjør det mulig ved parallell eksperimentelle oppsett (opp til 16 slides, kan fremstilles på en dag etter ulike nedstrøms-analyse). Behandlingene er beskrevet aktiver homogene signaler i hel-mount og godt bevart histologisk, mobilnettet,og kjernefysiske organisasjon i kjønnsceller og omkringliggende nucellar celler som gagner kvalitative og kvantitative sammenligninger mellom celletyper. Kalibrert, CLSM-baserte høy oppløsning avbildning etterfulgt av 3-dimensjonale rekonstruksjon muliggjør meningsfylte kvantitative målinger av fluorescerende signaler. Vi hell brukt denne prosedyren for å analysere kromatin dynamikk i differensierende MMC 21 og utvikle kvinnelige gametofytt 22; vi presenterer her representative resultatene av heterochromatin analyse, kromatin farging, GFP farging og FISH i hel-mount ovules. Vi tror videre at vår protokoll vil være egnet for andre plantevev og arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fremgangsmåten er beskrevet i arbeidsflyten i figur 1, og oppsett for disseksjon og innstøping av vev er presentert i figur 2..
En. Tissue Fixation
- Samle 20-30 carpels i en mikro rør som inneholder rykende BVO fiksativ buffer på is.
- Fest vev 30 min med forsiktig risting ved romtemperatur.
- Spinn rør som inneholder de carpels i fiksativ i en bordmikrosentrifuge 1 min ved 400 x g.
- Fjern forsiktig den fiksativ buffer og tilsett 1 ml av PBT, plassere rørene på is.
2. Dissection og Inkludering
- Forbered fem Eppendorfrør med hver 200 mL av en rykende fersk, 5% akrylamid mix.
- Forbered fem Superfrost lysbilder forhånds rengjøres med 70% etanol og merket med en blyant.
- Tine en delmengde av 20% APS og 20% naps hver, på is.
- Ta 4-5 carpels med en cut-end spissen, steddem på en ren lysbilde, fjerne overflødig væske.
- Gjør langsgående kutt med en tynn nål og løsne CARPEL vegger for å frigjøre rader med ovules som vist Figur 2, unngå uttørking ved tildekking med PBS (ikke mer enn 10 mL).
- Raskt legge til og blande 12 mL naps, 12 mL APS med en delmengde av 200 mL akrylamid mix.
- Tilsett 30 pl av den aktiverte akrylamid bort på dissekert ovuler.
- Dekk med en 20 x 20 mm dekkglass, la polymerisere ved værelsestemperatur, 45 til 60 min.
- Fjern dekkglass med et barberblad. På dette stadium, kan prøvene bli holdt over natten ved 4 ° C i en Coplin krukke inneholdende PBS.
Tre. Tissue Processing
MERK: Alle trinn unntatt 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 og 3.4.3 er utført i Coplin krukker med 80 ml oppløsning under kjemisk panseret ved romtemperatur. Lysbilder blir overført med en flat-tip tang.
- Tissue avklaring ogfiksering:
- Inkuber 5 min i metanol.
- Inkuber 5 min i etanol.
- Inkuber 30 min i etanol: xylen (1:1).
- Inkuber 5 min i etanol.
- Inkuber 5 min i metanol.
- Inkuber 15 min i metanol og PBT (1:1), supplert med 2,5% formaldehyd.
- Skylling 2 x 10 min i PBT. På dette stadiet, kan lysbilder holdes over natten ved 4 ° C.
- Cellevegg fordøyelsen:
- Tin en alikvot av celleveggen fordøyelse blandingen på is.
- Ta et lysbilde fra Coplin jar, drenere overflødig væske ved å plassere den vertikalt på et papirhåndkle.
- Legg 100 mL av celleveggen fordøyelsen mix over akrylamid pad og dekk med en 23 x 46 mm dekkglass. Gjenta for de andre lysbildene. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C i et fuktig kammer (beskrevet i Materials).
- Vask lysbilder 2 x 5 min i PBT.
- RNase A behandling:
- Ta et lysbilde fra Coplin jar, avløp the overskudd av væske som før.
- Inkuber hvert bilde med 100 mL av RNAseA på 100 mikrogram / ml i PBS med 1% Tween-20 i 1 time ved 37 ° C i et fuktig kammer.
- Vask lysbildene for 2 x 5 min i PBT.
- Post-fiksering og permeabilization:
- Post-fix for 20 min i rykende PBT-F.
- Skyll lysbildene for 10 min i PBT.
- Permeabilize i 2 timer i PBS med 2% Tween-20 ved 4 ° C.
- Skyll lysbildene for 2 x 5 min i PBT.
4. Immunostaining
NB: I dette trinnet har den optimale konsentrasjon av det primære antistoffet som skal prøves ved hjelp av forskjellige fortynninger (1:200, 1:500, 1:1000) av antistoffer.
- Inkuber hvert bilde med 100 pl av primært antistoff fortynnet i PBS med 0,2% Tween-20 i 12-24 timer ved 4 ° C.
- Vask objektglassene i PBT i 2-4 timer ved romtemperatur under forsiktig risting.
- Påførsekundært antistoff 1:200 i PBS + 0,2% Tween-20 i 24 timer ved 4 ° C.
- Vask lysbilder i PBT for en time ved romtemperatur under forsiktig risting.
- Counterstain med 10 ug / ml propidium-jodid i PBS i 15 min, og deretter tørkes 15 min i PBS under forsiktig risting, ved romtemperatur.
- Mount i anti-fading væske mountant supplert med 10 mikrogram / ml propidium iodide. La montering medium herde i en time før du henter bilder av CLSM.
5. Kvantitativ Imaging
- Bilde oppkjøpet:
- Acquire høyoppløselige bilder ved hjelp CLSM, ideelt sett med en resonans skanning-modus, som gir bedre bevaring av fluorescerende signaler over lengre bildebehandling 23, og en 63X glyserol nedsenking linse.
- Test oppkjøps parametere som laser intensitet, gain, pinhole, voxel størrelse og zoomfaktor ved begynnelsen av eksperimentet å definere en standard anskaffelsesprosedyre å strengt følge helealle lysbilder for konsistente kvantitative målinger.
- Kontroller fravær av krysstale mellom fluorokromer. Hvis den finnes, satt opp en sekvensiell skanning. Acquire overføringsbilder separat og ikke samtidig.
- Utfør serie, tredimensjonalt bilde oppkjøpet med høyest mulig oppløsning i x-og y-dimensjoner og med 2x oversampling i z dimensjon (Nyquist regel).
- Bildebehandling:
- Rekonstruere seriebilder i tre dimensjoner ved hjelp av kommersielle eller åpen kildekode.
- Definer kontur flater rundt hver kjerne (eller celle) av interesse i 3D.
- Kvantifisere fluorescens i hver kanal som summen av piksel intensiteter i hvert objekt.
- Eksportere data til Excel for statistiske analyser. Normaliser antistoff markeringene mot f.eks DNA flekker signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tilbyr en robust protokoll for storskala utarbeidelse og behandling av Arabidopsis ovules egnet for cytologisk farging i hel-mount. Takket være innebygging, de ovules beholde en 3-dimensjonal struktur (figur 3). Videre vevet foredling herunder optisk avklaring lar bildebehandling subcellulære strukturer i høy oppløsning. Figur 4 viser DNA flekker i hel-mount ovule primordia hvor heterochromatin fremstår som lyse, godt definert iøynefallende fokus (ingen deconvolution ble brukt til dette bildet). Disse bildene ble benyttet for å analysere heterochromatin innhold i MMC og nucellus (figur 4) 21.
I tillegg har vi med hell brukt denne protokollen til å kvantitativt analysere kromatin dynamikk ved farging i megaspore mors celler, funksjonell megaspore, utvikle kvinnelige gametophytes og tidlig embryo 21, 22-24. I figur 5 Arabidopsis ovules. Figur 5A viser et eksempel på immunodeteksjonsprosedyren i ovule primordia, inkludert megaspore mor celle, av en eukromatin-forbundet givende mark (H3K4me3) og en heterochromatin-forbundet undertrykkende mark (H3K27me1). Figur 5B viser et eksempel på GFP immunodeteksjonsprosedyren i en moden ovule, inklusive embryosekken (i dette tilfellet, var protokollen litt modifisert for bruk av GFP booster-antistoff (se diskusjon). Vi har også oppdaget at fremmed kromatin proteiner som H3 og H1 21 viser at prosedyren bevarer kromatin protein epitoper. Prosedyren gir også mulighet for reproduserbare quantifications muliggjør sammenligning mellom celletyper (for eksempel reproduktive vs somatiske, omkringliggende celler) 21.
Til slutt, vi også med hell brukt denne fremgangsmåten for å utføre FISH analyser på hel-mount ovule primordia. Et eksempel er vist Figur 6 viser FISH signaler ved hjelp av en sonde mot 45S rDNA gjentar definere nucleolar organisering regionene 25. Denne DNA-proben ble merket direkte med Alexa 488 ved hjelp av FISH-tag 26, ble hybridiseringen utført i det vesentlige som beskrevet 27 med mindre modifikasjoner, mens kontrafarging DNA ble gjort som beskrevet i protokollen.
Figur 1. Arbeidsflyt for farging, DNA farging og fluorescens in situ hybridisering i Arabidopsis ovules. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Oppsett for disseksjon og innebygging av carpels på lysbildet. Den Carpel veggen er fjernet og carpel er dissekert på lysbildet for å frigjøre rader med ovules (se nærbilde av dissekert ovules i trinn 3), og deretter dissekert Carpel er innebygd i aktivert akrylamid mix, dekket av 20 x 20 mm dekkglass. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Protokollen gjør bevare tre-dimensjonale struktur samtidig som optisk klarhet og homogen farging. Bildene viser en split seksjon visning av 3D-bildet i xy, xz og yz aksen som angitt. Bildedataene er innhentet avkonfokal laser scanning mikroskopi og rekonstruert i tre dimensjoner ved hjelp av Imaris programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 Whole-mount DNA farging av propidium iodide i ovule primodia. Tillater presis heterochromatin kvantifisering. Bildet til venstre viser hel-mount DNA flekker gjennom en ovule primordia. En MMC kjernen er preget av en hvit kontur og en nucellar kjernen i rødt. Projeksjoner av 3D-rekonstruerte kjerner vises til høyre. Klarheten i vevet gir høy oppløsning avbildning av heterochromatin foci merket med en gul kontur og kvantifisering av de fluorescerende signaler deri. Grafene viser den relative heterochromatin brøkdel 21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Representative resultater av hel-mount farging i Arabidopsis ovules. A) Immunostaining av kromatin endringer i unge ovule primordia oppdage eukromatin (H3K4me3) og heterochromatin (H3K27me1). Antistoff signalet er grønt, DNA kontra av propidium iodide i rødt. Et overlegg av fluorescerende signaler vises sammen med et bilde i overføring lys ved hjelp av kontrast differensial forstyrrelser (grå). MMCs vises med hvite konturer. Et nærbilde av MMC kjernen er vist som innfelt i øvre panel. Bildene er enkelt confocal delen. B) immunodeteksjonsprosedyren av GFP i en moden ovule.GFP ble immunostained hjelp GFP-booster antistoff og ovule ble kontra med DAPI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Whole-mount fluorescens in situ hybridisering i Arabidopsis ovules. Ovule primordium ble hybridisert med en DNA-probe spesifikk for 45S rDNA gjenta loci og merket med Alexa 488 ved hjelp av FISH-Tag teknologi, og kontra med DAPI 26. Den overlapping av 45S rDNA med DAPI og bilde ervervet i overføring lys kanal (grå) er også vist. Et nærbilde av MMC kjernen er vist som innsatt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette fikenure.
Figur 7. Influence av fiksering, fordøyelse og flekker prosedyre på DNA-signaler i hel-mount ovules. A) Eldre ovules ble fikset 30 min enten med 4% paraformaldehyde eller BVO fiksativ og behandlet 30 min eller 1 time med cellevegg fordøye enzym blanding før DNA farging med propidium iodide. For en gitt batch, påvirker lengre inkubasjonstid mer negativt på DNA flekker ovules som ble løst med paraformaldehyde enn med BVO. B) Whole-mount DNA flekker bruker Feulgen reagens etter en nødvendig syrehydrolyse 28 eller ved hjelp av propidium iodide etter ikke- denaturering protokoll beskrevet i teksten. Det øvre panelet viser et enkelt plan snitt gjennom embryo sac, presenterer den nedre platen en forstørrelse over midtcellekjernen viser tydelig endring avkromatin organisasjon i Feulgen-farget ovules. CCN, sentrale cellekjernen, ECN, egg cellekjernen, syn, synergid kjernen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I blomsterplanter, er den kvinnelige reproduktive avstamning omgitt av flere cellelag inkludert nucellus og ovule teguments, dermed rende cytologisk flekker i hel-mount teknisk utfordrende. Her presenteres en effektiv protokoll som muliggjør fremstilling og bearbeiding av et stort antall ovuler egnet for cytologisk farging som farging, DNA farging og fluorescens in situ hybridisering i hel-festet. Vi hell brukt det for analyse av den kvinnelige reproduktive germline i Arabidopsis 21,22. Denne metoden er svært effektiv som flere lysbilder kan behandles parallelt for annen farging. Det er også robust og gir homogen fordeling signal og gir reproduserbare kvantitative analyser. I motsetning til klassisk metode, for eksempel Feulgen flekker som involverer denaturering av kromatinstruktur, bevarer vår protokoll kromatin organisasjon og atom epitoper. I addition, vev avklaring lar bildebehandling signaler med høy oppløsning på enkelt-celle-nivå.
Denne protokollen kan bli fremskyndet ved å utelate de trinnene som er beskrevet i 3.1 om blomstene har blitt fikset i 4% paraformaldehyde (i PBS + 1% Tween) i stedet for BVO buffer (1,1). Mens dette kortere prosedyre viste funksjonell for flere farging 22-24, fant vi at det demper robustheten av flekker over prøvene, antistoff og batch av celleveggen fordøyelse enzym mix (se nedenfor). Videre kan vi ikke var vellykket for FISH hybridisering med denne korte prosedyre. For immuno-deteksjons av GFP er ved hjelp av bæremolekyler som vist figur 5B, er en lignende protokoll som beskrevet her ble benyttet med små modifikasjoner i trinn 1 og 3: carpels ble fiksert i 2,5% formaldehyd i 45 minutter (1,1), det første trinnet av vev behandlingen ble forkortet til 5-10 min metanol behandling (3.1), ble en blokkerende trinn innført (30 minutter i 2% BSA i PBS) før påføring antistoff over natten som beskrevet. Ingen sekundært antistoff er nødvendig med booster.
Vi diskuterer under noen kritiske trinn:
Tissue Fiksering, disseksjon og innebygging.
Farging og DNA fargings signaler var konsekvent mer robust og homogent fordelt når vevet ble prøvetatt fra planter mindre enn 5 uker gamle (etter overføring av frøplante i jord). Muligens, i våre vekstbetingelser, en forlenget dyrkningsperiode kan ledsages av endringer i den biokjemiske sammensetning av celleveggen, som påvirker på sin side effektiviteten av vev-behandling. Dermed anbefaler vi prøvetaking vev fra relativt unge planter. I tillegg bør vevet forhindres fra å tørke i løpet av disseksjon (som fører ellers til histologiske endringer og fravær av farvesignalene), mens et overskudd av PBS utfordrer manipulasjon; en svak drenering av overskudd av solution med spissen rundt vevet avsatt på lysbildet er derfor anbefalt. Videre bør bobler unngås i akrylamid blandingen og mens dekker med et dekkglass. Endelig er Superfrost Plus lysbilder anbefales sterkt for tilstrekkelig akrylamid vedheft (standard kvalitet fører til skjøre og ustabile pads i våre hender), som de synes bedre enn andre for vev og akrylamid vedheft.
Fiksering, permeabilisation og celleveggen fordøyelsen.
Celleveggen fordøyelsen er et kritisk punkt av vev behandling. Det er antatt at dette trinnet muliggjør en god gjennomtrengning av de Fargingsreagensmidlene homogent gjennom hele plantevevet. Vi har opplevd variabilitet i fargings homogenitet (som strekker seg fra noe signal, signal i bare en del av vevet, 100% vev farging) avhengig av fordøyelsen tid, og den enzymatiske aktivitet (batch-spesifikke, som er beskrevet av leverandøren). Det anbefales å produsere en stor mengde av stamløsningav enzym-blanding (f.eks 100 ml) og holde 1 ml alikvoter ved -20 ° C. Hver stamløsning bør først bli testet på 1-2 lysbilder før bruk i stor skala. Videre opplevde vi at den type bindemiddel påvirker effektiviteten av DNA-farging i kombinasjon med forskjellige behandlingstiden for cellevegg fordøye: ovuler fiksert i 4% paraformaldehyd ble negativt påvirket ved lengre inkubasjon med celleveggen fordøyelse blanding, mens vev fiksert med den BVO løsning var tolerant til lengre fordøyelsen tider og lov bedre DNA farging (figur 7A). I tillegg er strengt nødvendig for en RNase (DNase fri) behandling dersom vevet er kontrafarget med propidium-jodid som det binder seg til RNA-molekyler. Vi fraråder å bruke 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) på grunn av sin brede fluorescerende utslipps spektra overlappende med andre fluoroforene men også til akromatisk avvik som nødvendig kanalforskivning rettelser etter oppkjøpet. Vi har ogsåanbefaler mot Feulgen flekker som krever en syrehydrolyse under vev prosessering 28 som fører til kromatin denaturering spesielt i embryo sekken (figur 7B). Alternativt DNA-fargestoffer kan også anvendes 29, men deres effektivitet er ikke testet her.
Farging.
For farging av kromatin modifikasjoner, vi anbefaler å kontrollere spesifisiteten av primær antistoff i åpen kildekode-databasen http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, som noen kommersielt tilgjengelige antistoffer viste kryssreaksjoner for andre modifikasjoner. For nedstrøms kvantifisering analyser, er det viktig å kalibrere antistoffer konsentrasjon og inkubasjonstiden for å måle signaler i et lineært forhold med epitopen. Vi anbefaler å kalibrere antistoff fortynning og deteksjon tid ved hjelp av et antistoff dilution serie på 1:200, 1:500, 1:1.000 og 12-24 timers inkubering, henholdsvis, for å identifisere de betingelser som gir robuste og homogene signaler. Den høyeste fortynning og korteste inkubasjonstid tillater reproduserbare signaler skal brukes til kvantitative analyser. Kontroller uten primært antistoff bør utføres for å teste spesifisiteten. Hvis farging produserer uspesifikke flekker, er det anbefalt å blokkere med 5% BSA + 0,1% Tween i PBS for to timer ved 4 ° C før det primære antistoffet. Antistoff signaler kan sjekkes på lysbildet før DNA kontra å verifisere suksess for forsøket. I våre hender, vasking i PBT for 2-4 timer etter inkubering med det primære antistoff, og 1 time etter at det sekundære antistoff muliggjør lave bakgrunnssignaler selv uten blokkering.
Endelig er denne protokollen også sannsynlig gjelder andre plantemateriale (f.eks rot, blad fragment, floral meristeme) og sannsynligvis til andre plantearter, probringe noen justering på disseksjon, celleveggen fordøye og permeabilization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al. Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., et al. Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
