Summary
Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.
Abstract
In blühenden Pflanzen ist der somatisch-to-Keimzelle Schicksal Übergang von der Spezifikation der Sporenmutterzellen (SMCs) in Blütenorgane der erwachsenen Pflanze markiert. Die weibliche SMC (Megaspore Mutterzelle, MMC) unterscheidet in der Samenanlage Primordium und Meiose. Das ausgewählte haploiden Megaspore läuft dann Mitose die vielzelligen weiblichen Gametophyten, die zu den Gameten geben wird, die Eizelle und Zentralzellen bilden zusammen mit akzessorischen Zellen. Die begrenzte Zugänglichkeit der MMC, meiocyte und weiblichen Gametophyten innerhalb der Samenanlage ist technisch anspruchsvoll für die zytologische und zytogenetische Analysen auf Einzelzellebene. Insbesondere ist eine direkte oder indirekte Immundetektion von zellulären oder Kern Epitope durch schlechte Penetration der Reagenzien innerhalb der Pflanzenzelle und Einzelzellenabbildungs beeinträchtigt wird durch den Mangel an optischer Klarheit in whole-mount Gewebe demised.
So eine effiziente Methode, um die nucl analysieren entwickelten wirOhr Organisation und Chromatin-Modifikation bei hoher Auflösung von Einzelzell ganz-Mount eingebettet Arabidopsis Samenanlagen. Es ist auf Dissektion und Einbettung von festen Eizellen in einer dünnen Schicht aus Acrylamid-Gel auf einen Objektträger beruht. Die Samenanlagen eingebettet werden, um chemische und enzymatische Behandlungen zur Verbesserung der Gewebe Klarheit und Durchlässigkeit für die Immunfärbung Reagenzien unterzogen. Diese Behandlungen erhalten zellulären und Chromatin-Organisation, DNA-und Protein-Epitope. Die Proben können für unterschiedliche nachgeschaltete zytologische Analysen einschließlich Chromatin Immunfärbung, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), und DNA-Färbung für Heterochromatin Analyse verwendet werden. Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) Bildgebung mit hoher Auflösung, gefolgt von 3D-Rekonstruktion erlaubt eine quantitative Messungen an Einzelzellauflösung.
Introduction
In blühenden Pflanzen, die Einrichtung von Fortpflanzungslinien beginnt mit der Differenzierung von SMC, MMC weiblichen und männlichen Pollenmutterzelle. Die MMC entwickelt sich aus einer Unter nucellar epidermalen Zelle an der distalen Spitze der Samenanlage primordium und die Pollenmutterzellen entwickelt von sporenbildenden Gewebes in der Anthere locule, die tief in den Blütenorganen 1 angeordnet sind. SMCs Meiose haploide Sporen, die dann führen zu den Gametophyten bei der Mitose zu produzieren. Der weibliche Gametophyt oder Embryosack, besteht aus einer Eizelle, einer Zentralzelle, zwei und drei Synergiden antipodals. Der männliche Gametophyt oder Pollen, wird von einem vegetative Zelle und zwei Spermazellen zusammengesetzt. Während die männlichen Gametophyten bleibt ein relativ zugänglich Objekt-of-Studie wird die weiblichen Gametophyten innerhalb der Samenanlage eingebettet ist, sich selbst in der Blüte Fruchtblatt umschlossen und damit besondere Herausforderungen, um molekulare und zytologische Analysen. Kürzlich jedoch lasergestützteMikrodissektion bot eine elegante Lösung, die Transkriptom-Analysen in der MMC und weiblichen Zellen gametophytische 2-4. Neben den Kandidaten-Gen-Expressionsanalysen, zB mit RNA in situ Hybridisierung oder Reporter-Gen-Assays, zytologische Analysen ermöglicht die Untersuchung der Dynamik der endogenen zellulären Komponenten mit spezifischen zellulären direkte oder indirekte Immunfärbung. Insbesondere zytogenetische Färbung mit FISH und DNA-Färbung zusammen mit Immunfärbung von Chromatin-Veränderungen oder Chromatin-Komponenten sind zentrale Ansätze zur Chromatin-Dynamik und Atom-Organisation in Arabidopsis 5 aufzuklären. Typischerweise bringt Meiose spezifische Chromosomendynamik, die auch in pflanzlichen männlichen sucht wurde meiocytes 6,7; weitere Groß, zellspezifische Chromatin Reorganisation wahrscheinlich reflektiert dynamische epigenetische Reprogrammierung während der Pollenentwicklung 10.8 beschrieben. Im Gegensatz dazu aufgrundder relativen Unzugänglichkeit des weiblichen Gametophyten meiocyte und bleiben diese Untersuchungen technisch schwierig anzuwenden, und erfordern oft Schnitte oder manuelle Präparation und enzymatische Verdauung (siehe unten). Darüber hinaus ist die vorherrschende Mangel an optischer Klarheit ganz-mount ein Hindernis für die hochauflösende Bildgebung von Keimzellen in intakten Eizellen.
Eine klassische Methode für die zytologische Analyse der Chromosomenorganisation in whole-mount Eizellen verwendet Feulgen-Färbung 13.11. Es handelt Säurehydrolyse (unter Verwendung unterchlorige Säure) der DNA, die in Protein-Denaturierung und damit zu Zerstörungen führt der Chromatinstruktur. Alternativ kann Chromosom Organisation in der weiblichen meiocytes und gametophytische Zellen mit DAPI-Färbung und Immunfärbung auf Semidünnschnitten oder seziert Embryosäcke und MMC (siehe beispielsweise 14-18) beobachtet werden. Fest steht jedoch, manuelle Präparation und Schnitte kann arbeitsintensiv sein undbehindert die qualitative und quantitative Analyse einer Vielzahl von Chromatin-Epitope.
Hier bieten wir eine effiziente Protokoll, um eine große Anzahl von Arabidopsis Samenanlagen geeignet für eine Vielzahl von nachgelagerten zytologische Färbung im gesamten Montage vorzubereiten. Kurz gesagt, sind Blütenknospen in einer Fixierungslösung inkubiert werden Zeilen von Eizellen aus dem Fruchtblatt seziert und in Acrylamid eingebettet auf Folie wie für Pollen meiocytes 19,20 getan. Die eingebetteten Samenanlagen weiter geklärt und in Methanol, Ethanol und Xylol vor der Zellwand Verdauung und Permeabilisierung befestigt. Mögliche Variationen dieser Schritte werden diskutiert. Die Proben können dann für DNA-Färbung, Immunfärbung und FISH verwendet werden. Der Vorbereitungsmodus ist effizient und ermöglicht parallele Versuchsaufbau (bis zu 16 Objektträger kann an einem Tag für unterschiedliche nachgeschaltete Analyse vorbereitet werden). Die beschriebenen Behandlungen ermöglichen homogene Signale in Vollmontage und gut erhaltenen histologischen, Mobilfunk,und Kernorganisation in Keimzellen und die umliegenden nucellar Zellen, die qualitative und quantitative Vergleiche zwischen Zelltypen profitieren. Kalibriert, CLSM-basierte hochauflösende Bildgebung, gefolgt von 3-dimensionalen Rekonstruktion ermöglicht aussagekräftige quantitative Messungen von Fluoreszenzsignalen. Wir dieses Verfahren erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Dynamik in der Differenzierung und Entwicklung von MMC-21 weiblichen Gametophyten 22 zu analysieren; wir hier präsentieren, repräsentative Ergebnisse von Heterochromatin-Analyse, Immunfärbung Chromatin, GFP-Immunfärbung und FISH in whole-mount Samenanlagen. Wir glauben weiterhin, dass unser Protokoll wird für andere Pflanzengewebe und Arten sein.
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Protocol
Das Verfahren wird im Arbeitsablauf in Fig. 1 beschrieben, und die Einrichtung für die Präparation und Einbetten von Geweben sind in Figur 2 dargestellt.
1. Gewebefixierung
- Sammeln 20-30 Fruchtblätter in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit frisch gemacht BVO Fixierungspuffer auf Eis.
- Fix das Gewebe 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
- Drehen Sie die Rohre, die die Fruchtblätter in Fixiermittel in einer Tischmikrozentrifuge 1 min bei 400 x g.
- Entfernen Sie vorsichtig die Fixierungspuffer und 1 ml PBT, legen Sie die Röhrchen auf Eis.
2. Dissection and Embedding
- Bereiten fünf Eppendorf-Röhrchen mit je 200 ul einer frisch zubereiteten, 5% Acrylamid-Mix.
- Vorbereitung fünf Superfrost Objektträger mit 70% Ethanol vorgereinigt und mit einem Bleistift markiert.
- Tauwetter ein Aliquot von 20% und 20% APS NaPS je, auf Eis.
- Nehmen Sie 4-5 Fruchtblättern mit einem Cut-Endrohr, Ortsie auf einen sauberen Objektträger, entfernen Sie das überschüssige Flüssigkeit.
- Machen Längsschnitte mit einer feinen Nadel und nehmen die Fruchtblatt Wände, um Reihen von Samenanlagen wie gezeigt Abbildung 2 zu lösen, vermeiden Trocknung durch Abdecken mit PBS (nicht mehr als 10 ul).
- Schnelles Hinzufügen und mischen 12 ul NaPS, 12 ul APS mit einem Aliquot von 200 ul Acrylamid-Mix.
- In 30 ul der Aktiv Acrylamid auf die Samenanlagen seziert.
- Deckel mit einem 20 x 20 mm Deckglas, lassen Sie polymerisieren bei Raumtemperatur 45-60 min.
- Entfernen Sie das Deckglas mit einer Rasierklinge. In diesem Stadium können die Proben über Nacht bei 4 ° C in einer Glasküvette mit PBS aufbewahrt.
3. Gewebeverarbeitung
HINWEIS: Alle Schritte außer 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 und 3.4.3 sind in Coplin Gläser mit 80 ml Lösung unter der chemischen Abzug bei Raumtemperatur durchgeführt. Folien sind mit einem Flachbild-Spitze Pinzette übertragen.
- Tissue Klärung undFixierung:
- Inkubation 5 min in Methanol.
- Inkubation 5 min in Ethanol.
- Inkubieren 30 min in Ethanol: Xylol (1:1).
- Inkubation 5 min in Ethanol.
- Inkubation 5 min in Methanol.
- Inkubieren 15 min in Methanol und PBT (1:1) mit 2,5% Formaldehyd ergänzt.
- Spülen Sie 2 x 10 min in PBT. In diesem Stadium können Folien über Nacht bei 4 ° C aufbewahrt werden
- Zellwand Verdauung:
- Tauwetter ein Aliquot der Zellwand Verdauung Mix auf Eis.
- Nehmen Sie eine Folie aus der Glasküvette, lassen Sie das überschüssige Flüssigkeit, indem Sie sie senkrecht auf einem Papiertuch.
- 100 l Zellwand Verdauung Mix über die Acrylamid-Pad und mit einem 23 x 46 mm Deckglas. Wiederholen Sie dies für die anderen Folien. Inkubation für 2 h bei 37 ° C in einer feuchten Kammer (in Materials beschrieben).
- In PBT Waschen Sie die Folien 2 x 5 min.
- RNase A-Behandlung:
- Nehmen Sie eine Folie aus der Glasküvette, abtropfen the überschüssige Flüssigkeit wie zuvor.
- Inkubieren jede Folie mit 100 ul RNAseA bei 100 ug / ml in PBS mit 1% Tween-20 für 1 h bei 37 ° C in einer feuchten Kammer.
- Für 2 x 5 min in PBT Waschen Sie die Dias.
- Post-Fixierung und Permeabilisierung:
- Post-fix für 20 min in frisch gemachte PBT-F.
- Spülen Sie die Objektträger für 10 min in PBT.
- Durchdringbar für 2 h in PBS mit 2% Tween-20 bei 4 ° C
- Spülen Sie die Folien für 2 x 5 min in PBT.
4. Immunfärbung
HINWEIS: Bei diesem Schritt hat die optimale Konzentration des primären Antikörpers durch Verwendung von verschiedenen Verdünnungen (1:200, 1:500, 1:1000) der Antikörper getestet werden.
- Inkubieren jede Folie mit 100 ul des primären Antikörpers in PBS mit 0,2% Tween-20 verdünnt 12-24 Stunden bei 4 ° C.
- Waschen der Objektträger in PBT für 2-4 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
- Wenden Sie dasSekundär-Antikörper 1:200 in PBS + 0,2% Tween-20 für 24 Stunden bei 4 ° C
- Waschen Folien in PBT für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
- Mit 10 ug / ml Propidiumiodid in PBS für 15 min Gegenfärbung, dann spülen 15 min in PBS unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
- Berg in der Anti-Fading-Flüssigkeit mountant mit 10 ug / ml Propidiumiodid ergänzt. Lassen Sie die Montagemedium aushärten 1 Stunde vor dem Erwerb durch CLSM Bilder.
5. Quantitative Bildgebung
- Bildaufnahme:
- Erwerben Sie hochauflösende Bilder mit CLSM, idealerweise mit einer Resonanz-Scanmodus, die bessere Erhaltung der Fluoreszenzsignale über längere Bild 23 und einen 63X Glycerin Sionslinse ermöglicht.
- Testen Sie die Aufnahmeparameter wie Laserintensität, Verstärkung, Lochkamera, Voxel-Größe und Zoom-Faktor zu Beginn des Experiments, um eine Standarderwerbsverfahren zu definieren, um in ganz strikt befolgenAlle Folien für konsistente quantitative Messungen.
- Überprüfen Sie, ob das Fehlen von Übersprechen zwischen Fluorochrome. Falls vorhanden, einen sequentiellen Scan eingestellt. Erwerben Sie separat und nicht gleichzeitig Übertragungs Bilder.
- Führen seriell, dreidimensionale Bildaufnahme mit höchster Auflösung in x-und y-Abmessungen und mit 2x Oversampling in der z-Dimension (Nyquist-Regel).
- Bildverarbeitung:
- Rekonstruieren Serien Bilder in drei Dimensionen mit kommerziellen oder Open-Source-Software.
- Definieren Konturflächen um jeden Kern (oder Zelle) von Interesse in 3D.
- Quantifizierung der Fluoreszenz in jedem Kanal die Summe der Pixelintensitäten in jedem Objekt.
- Exportieren Sie die Daten in Excel für statistische Auswertungen. Normalisieren Antikörper gegen Signale zB DNA-Färbung Signale.
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Representative Results
Wir bieten eine robuste Protokoll für die großtechnische Herstellung und Verarbeitung von Arabidopsis Samenanlagen geeignet für zytologische Färbung ganz-mount. Durch die Einbettung sind die Samenanlagen behalten eine 3-dimensionale Struktur (Fig. 3). Darüber hinaus ist die Gewebeverarbeitung einschließlich der optischen Klärung ermöglicht die Abbildung subzellulärer Strukturen mit hoher Auflösung. Abbildung 4 zeigt DNA-Färbung in whole-mount Eizelle Primordia wo Heterochromatin erscheint als helle, gut definierte auffällige Herde (keine Entfaltungs wurde für dieses Bild verwendet wird). Diese Bilder wurden für die Analyse von Heterochromatin Gehalt in der MMC und Nuzellus (Fig. 4) 21 verwendet.
Darüber hinaus haben wir erfolgreich dieses Protokoll verwendet, um quantitativ zu analysieren Chromatin-Dynamik durch Immunfärbung in Megasporenmutterzellen, funktionelle Megaspore, die Entwicklung von weiblichen Gametophyten und frühen Embryo 21, 22-24. In Fig. 5 Arabidopsis-Samenanlagen. 5A zeigt ein Beispiel für die Immundetektion in Primordia Samenanlage, einschließlich der Megasporenmutterzelle, einer Euchromatin-assoziierten permissive Zeichen (H3K4me3) und eine Heterochromatin-assoziierten repressive Marke (H3K27me1). 5B zeigt ein Beispiel von GFP Immundetektion in einer reifen Eizelle, einschließlich der Embryosack (in diesem Fall wurde das Protokoll leicht für die Verwendung des GFP-Booster Antikörper modifiziert (siehe Diskussion). Wir haben fest auch nativen Chromatin-Proteine wie H3 und H1 21 zeigt, dass das Verfahren bewahrt Chromatin-Protein Epitope. Das Verfahren ermöglicht auch für reproduzierbare Quantifizierungen ermöglicht Vergleich zwischen Zelltypen (z. B. Reproduktions vs somatische, umgebenden Zellen) 21.
Schließlich haben wir auch erfolgreich angewendet, um dieses Verfahren durchzuführen FISH-Analysen auf Vollmontage Eizelle primordia. Ein Beispiel wird gezeigt, Abbildung 6 zeigt FISH-Signale mit einer Sonde gegen 45S rDNA wiederholt die Definition der nukleolären Organisationsbereiche 25. Die DNA-Sonde wurde direkt mit Alexa 488 mit FISH-Tag 26 beschriftet wurde die Hybridisierung im Wesentlichen wie beschrieben 27 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt, während die DNA-Gegenfärbung wurde wie in unserem Protokoll beschrieben durchgeführt.
Abbildung 1. Workflow-Immunfärbung von DNA-Färbung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in Arabidopsis Samenanlagen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Aufbau zur Präparation und Einbettung der Fruchtblätter auf Folie. Das Fruchtblatt Wand entfernt und die Fruchtblatt ist auf der Folie seziert, um Reihen von Samenanlagen freizugeben (siehe Nahaufnahme von seziert Samenanlagen in Schritt 3), und dann das Fruchtblatt seziert eingebettet in aktivierten Acrylamid-Mix, von 20 x 20 mm Deckglas abgedeckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. Das Protokoll ermöglicht die Erhaltung der 3-dimensionale Struktur und ermöglicht die optische Klarheit und homogene Färbung. Die Bilder zeigt eine geteilte Schnittansicht des 3D-Bildes in xy-, xz-und yz-Achse angegeben. Die Bilddaten wurden durch erworbenkonfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie und in 3 Dimensionen mit der Imaris Software rekonstruiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Whole-mount DNA-Färbung mit Propidiumiodid in primodia Samenanlage ermöglicht eine präzise Quantifizierung Heterochromatin. Das Bild auf der linken Seite zeigt ganz-mount DNA-Färbung während einer Samenanlage Primordia. Ein MMC-Kern wird von einem weißen Kontur und einer nucellar Kern rot markiert. 3D-Projektionen rekonstruiert Kerne werden auf der rechten Seite gezeigt. Die Klarheit des Gewebes ermöglicht hochauflösende Bildgebung der Heterochromatin Herde durch eine gelbe Kontur und Quantifizierung der Fluoreszenzsignale darin markiert. Die Diagramme zeigen die relative heterochromatin Bruch 21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse der Whole-mount Immunfärbung in Arabidopsis Samenanlagen. A) Immunfärbung von Chromatin-Modifikationen bei jungen Samenanlage Primordia Erfassung Euchromatin (H3K4me3) und Heterochromatin (H3K27me1). Der Antikörper-Signal ist grün, das durch Propidiumiodid gegengefärbt in DNA. Eine Überlagerung von Fluoreszenzsignalen zusammen mit einem Bild in Sendelicht mit Differentialinterferenzkontrast (grau) dargestellt. MMCs werden durch weiße Konturen angedeutet. Eine Nahaufnahme der MMC-Kern wird gezeigt, wie in der oberen Platte eingelassen. Die Bilder sind Einzel konfokalen Abschnitt. B) Immundetektion von GFP in eine reife Eizelle.Das GFP wurde mit GFP-Antikörper immun Booster und die Samenanlage wurde mit DAPI gegengefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in Arabidopsis Samenanlagen. Die Eizelle Primordium wurde mit einer DNA-Sonde, die spezifisch für 45S rDNA-Repeat Loci hybridisiert und mit Alexa 488 mit Hilfe der FISH-Tag-Technologie bezeichnet, und mit 26 DAPI gegengefärbt. Die Überlagerung der 45S rDNA mit DAPI und in der Übertragungslichtkanal (grau) erfassten Bild sind ebenfalls dargestellt. Eine Nahaufnahme der MMC-Kern wird als Leiste dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild sehenure.
Abbildung 7. Einfluss der Fixierung, die Verdauung und Färbeverfahren auf die DNA-Signale in Vollmontage Samenanlagen. A) Ältere Eizellen wurden 30 min entweder mit 4% Paraformaldehyd oder BVO Fixiermittel fixiert und verarbeitet 30 min oder 1 h mit Zellwand verdauen Enzym-Mix DNA vor der Färbung mit Propidiumiodid. Für eine bestimmte Charge, wirkt längere Inkubationszeit mehr negativ auf die DNA-Färbung Samenanlagen, die mit Para als mit BVO B behoben wurden.) Insgesamt Montage DNA-Färbung mit der Feulgen Reagenz nach einer erforderlichen Säurehydrolysebeständigkeit 28 oder mit Propidiumiodid nach der nicht- Denaturierung Protokoll im Text beschrieben. Das obere Feld zeigt eine einzige Ebene Schnitt durch den Embryosack stellt die untere Platte eine Vergrößerung über den zentralen Zellkern zeigt deutlich VeränderungChromatin-Organisation in Feulgen-gefärbten Samenanlagen. ccn, Zentralzellkern, ECN, Ei Zellkern, syn, synergid Kern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In blühenden Pflanzen wird die weiblichen Fortpflanzungs Abstammung von mehreren Zellschichten einschließlich der Nucellus der Samenanlage und teguments umgeben, damit Rendering zytologische Färbung in whole-mount technisch anspruchsvoll. Hier stellen wir eine effiziente Protokoll ermöglicht die Erstellung und Bearbeitung einer großen Anzahl von Eizellen geeignet für zytologische Färbung wie Immunfärbung, DNA-Färbung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ganz-mount. Wir erfolgreich verwendet sie für die Analyse des weiblichen Fortpflanzungskeimbahn in Arabidopsis 21,22. Dieses Verfahren ist sehr effizient, da mehrere Folien können parallel für unterschiedliche Färbung behandelt. Es ist auch robust und gibt homogene Signalverteilung und ermöglicht reproduzierbare quantitative Analysen. Im Gegensatz zu den klassischen Verfahren wie Feulgen-Färbung, die die Denaturierung des Chromatin-Struktur, der bewahrt unser Protokoll Chromatin-Organisation und Kern Epitope. In addition, Gewebe Klärung ermöglicht die Abbildung der Signale mit hoher Auflösung auf Einzelzellebene.
Dieses Protokoll kann durch Weglassen der unter 3.1 beschriebenen Schritte beschleunigt werden, wenn die Blumen in 4% Paraformaldehyd (in PBS + 1% Tween) anstelle der BVO-Puffer (1.1) behoben. Während diese kürzer Verfahren erwies sich für mehrere funktionelle Immunfärbung 22-24, fanden wir, dass es dämpft die Robustheit der Färbung in Proben, Antikörper-und Stapelzellwandverdauungsenzymgemisch (siehe unten). Außerdem waren wir nicht erfolgreich für FISH-Hybridisierung mit dieser kurzen Prozedur. Für die Immundetektion von GFPs mit der Verstärkermoleküle wie gezeigt 5B ein ähnliches Protokoll wie hier beschrieben, wurde mit geringfügigen Modifikationen in Schritt 1 und 3 verwendet: Fruchtblätter wurden in 2,5% Formaldehyd für 45 min (1.1) befestigt ist, der erste Schritt der Gewebeverarbeitung wurde auf 5-10 min Methanolbehandlung (3,1) verkürzt wird, ein Blockierungsschritt eingeführt wurde (30 min in 2% BSA in PBS) vor der Anwendung über Nacht-Antikörper, wie beschrieben. Die sekundären Antikörper mit dem Booster erforderlich.
Wir diskutieren im Folgenden einige wichtige Schritte:
Tissue Fixierung, Präparation und Einbettung.
Immunfärbung und DNA-Färbung Signale waren durchweg robuster und homogen verteilt, wenn das Gewebe wurde aus Pflanzen weniger als 5 Wochen alt (nach Übertragung der Keimling in der Erde) abgetastet. Möglicherweise in unseren Wachstumsbedingungen eine längere Kultivierung kann durch Veränderungen in der biochemischen Zusammensetzung der Zellwand, die wiederum Einfluss auf die Effizienz der Gewebeverarbeitung begleitet werden. Daher empfehlen wir Probenahme Gewebe aus relativ jungen Pflanzen. Darüber hinaus sollte das Gewebe vor dem Austrocknen beim Präparieren verhindert werden (was ansonsten zu histologischen Veränderungen und Abwesenheit von Färbung Signale), während ein Überschuß an PBS fordert die Manipulation; eine sanfte Entwässerung des überschüssigen Solution mit der Spitze rund um die auf Folie hinterlegt Gewebe wird daher empfohlen. Außerdem sollten Blasen in der Acrylamid-Mischung vermieden werden, und während Abdecken mit einem Deckglas. Schließlich werden die Superfrost-Plus-Objektträger stark für eine angemessene Haft Acrylamid (Standardqualität führen zu fragil und instabil Pads in der Hand) empfohlen, da sie den anderen überlegen für Gewebe und Acrylamid Haftung erscheinen.
Fixierung, Permeabilisierung und Zellwand Verdauung.
Zellwandverdauungs ist ein kritischer Schritt des Gewebeverarbeitung. Es wird angenommen, dass dieser Schritt ermöglicht eine gute Penetration der Färbereagenzien homogen im gesamten Pflanzengewebe. Wir hatten Variabilität Färbung Homogenität (im Bereich von keinem Signal, Signal nur in einem Teil des Gewebes, auf 100% Gewebe-Färbung) in Abhängigkeit von der Aufschlusszeit und der enzymatischen Aktivität (chargenspezifische, vom Anbieter beschrieben). Es wird empfohlen, eine große Menge an Stammlösung herzustellender Enzymmischung (z. B. 100 ml) und 1 ml zu halten Aliquots bei -20 ° C. Jede Aktien Lösung sollte zunächst auf 1-2 Folien vor der Verwendung im großen Maßstab getestet werden. Außerdem erfahren wir, dass die Art des Fixiermittels beeinflusst die Effizienz der DNA-Färbung in Kombination mit verschiedenen Verarbeitungszeit für die Zellwand verdaut: Ovula in 4% Paraformaldehyd fixiert wurden negativ durch längere Inkubation mit dem Zellwandverdauungsmischung beeinflußt, während das Gewebe mit festen BVO-Lösung waren tolerant zu längeren Verdauungszeit und erlaubt eine bessere DNA-Färbung (7A). Darüber hinaus ist eine RNase (DNase-frei) Behandlung unbedingt erforderlich, wenn das Gewebe mit Propidiumiodid gegengefärbt, wie es bindet auch RNA-Moleküle. Wir raten mit 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) aufgrund seiner breiten Fluoreszenzemissionsspektren Überschneidungen mit anderen Fluorophore, sondern auch auf achromatische Aberrationen, die Kanalverschiebung Korrekturen erfordern nach der Übernahme. Wir haben auchempfehlen gegen Feulgen-Färbung, die eine Säure-Hydrolyse während der Gewebeverarbeitung, die zu 28 Chromatin Denaturierung insbesondere im Embryosack (7B) erfordert. Alternative DNA-Farbstoffe können auch verwendet werden, 29, aber ihre Effizienz ist nicht hier getestet.
Immunfärbung.
Für Immunfärbung von Chromatin-Modifikationen, empfehlen wir, um die Spezifität des primären Antikörpers in der Open-Source-Datenbank zu überprüfen http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, wie einige im Handel erhältliche Antikörper zeigten Kreuzreaktionen für anderen Modifikationen. Für nachfolgende Quantifizierung analysiert, ist es wichtig, die Antikörper-Konzentration und Inkubationszeit, um Signale in einer linearen Beziehung mit dem Epitop Messung zu kalibrieren. Wir empfehlen, die Antikörperverdünnung und Nachweiszeit kalibrieren mit einem Antikörper dilution Reihe von 1:200, 1:500, 1:1000 und 12-24 h Inkubation jeweils auf die Voraussetzungen für die robuste und homogene Signale zu identifizieren. Die höchste Verdünnung und kürzeste Inkubationszeit ermöglicht reproduzierbare Signale sollten für quantitative Analysen verwendet werden. Kontrollen ohne primären Antikörper durchgeführt werden, um die Spezifität zu testen. Wenn unspezifische Immunfärbung erzeugt, ist es ratsam, mit 5% BSA + 0,1% Tween in PBS für 2 Stunden bei 4 ° C zu blockieren, bevor die primären Antikörper. Antikörper Signale können auf der Folie geprüft werden, bevor die DNA-Gegenfärbung der Erfolg des Experiments zu verifizieren. In unseren Händen, Waschen in PBT für 2-4 Stunden nach der Inkubation mit dem primären Antikörper und 1 Stunde nach dem sekundären Antikörper ermöglicht eine geringe Hintergrundsignale auch ohne Blockierung.
Schließlich ist dieses Protokoll wahrscheinlich auch auf andere Pflanzengewebe (z. B. Wurzel-, Blatt-Fragment, floralen Meristem) und wahrscheinlich auch auf andere Pflanzenarten, proViding einige Anpassungen auf die Zerlegung, Zellwand verdauen und Permeabilisierung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al.
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., et al. Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
